Alpha-2 Agonistas Receptoras Adrenérgicas Bloqueiam a Restituição Induzida de Cocaína em Busca de Estresse

Experimento 1: Efeitos da Clonidina, Lofexidina e Guanabenz na Libertação NE Induzida

Sujeitos

Os sujeitos eram ratos Long-Evans machos (Rio Charles, Quebec) pesando 300-350 g no início da experiência. Ao longo do experimento, os animais foram alojados em uma sala de colônia com umidade e temperatura controlada em um horário de luz-escuro invertido (luzes em 1730-0530 horas) e tiveram livre acesso à comida e água padrão de laboratório de ratos. Os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes do CCAC e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade Concordia.

Cirurgia

Antes da cirurgia, os ratos foram anestesiados com pentobarbital de sódio (65 mg/kg, i.p.) e foram injetados com sulfato de atropina (0,6 mg/ml; 0,2 ml/rato, SC) e antibiótico (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/rato, i.m.). Cânulas guia (20 gauge; Plastics One) foram implantadas para posterior inserção de sondas de diálise; uma foi colocada em PFC e outra em AMG em hemisférios opostos. Os animais utilizados para estudar os efeitos do guanabenz receberam uma única cânula guia destinada a PFC. O hemisfério em que as respectivas cânulas-guia foram implantadas foi contrabalançado através dos tratamentos. As coordenadas estereotáxicas utilizadas (relativas à superfície do bregma e do crânio) foram as seguintes: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos e Watson 1997). Após a inserção, a haste da sonda de diálise estendeu-se a 1 mm da cânula guia. As cânulas guia implantadas foram fixadas ao crânio com parafusos de aço inoxidável e cimento dental. As cânulas guia foram fechadas com obduradores aparafusados. Todos os animais foram devolvidos à sala da colônia por um período de recuperação não inferior a 1 semana antes do teste.

Microdiálise

Microdiálise foi realizada em quatro câmaras de teste hexagonais (42 × 39 × 33,5 cm) construídas de Plexiglas com tetos de madeira e pisos de haste de aço inoxidável. Cortinas escuras foram desenhadas ao redor de cada câmara e a iluminação foi fornecida em ciclo invertido por lâmpadas aéreas (15 W). A sonda de diálise consistiu de uma sonda de 1,8 mm (AMG) ou 3,5 mm (PFC) de membrana de diálise semipermeável (Spectra/Por; 240 μm o.d., corte de 13000 M.W.), fechada numa extremidade e fixada na outra a uma tubagem de aço inoxidável de 19 mm de comprimento de 26 gauge. Um tubo PE-20 de 40 a 50 cm de comprimento conectou a outra extremidade do eixo de aço inoxidável a uma bomba de infusão de velocidade variável, estacionada acima da câmara de teste que, por sua vez, foi conectada via tubo PE-20 a uma bomba de infusão de velocidade variável. Um tubo de sílica fundida de pequeno diâmetro, estendido internamente através da sonda, com uma extremidade apoiada a 0,5 mm da ponta da sonda e a outra extremidade saindo do tubo de PE 35 cm abaixo do giro de infusão. O comprimento externo do tubo de PE-20 foi protegido de danos por invólucros de mola de aço. As sondas foram projetadas de modo que todo o comprimento da membrana semipermeável se estendesse abaixo da ponta da cânula guia.

Separate squads of animals were used to examine the effects of each of the drugs tested. Dentro de cada esquadrão, cada animal foi designado aleatoriamente para a condição de tratamento. Os animais que receberam injeções veiculares foram executados em cada esquadrão, mas foram combinados em um único grupo para análise estatística. Os tamanhos finais dos grupos (PFC/ AMG) foram os seguintes: veículo (n = 15/17), clonidina 20 μg/kg (n = 7/6), clonidina 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidina 75 μg/kg (n=6/6), lofexidina 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). Com exceção dos animais que receberam guanabenz, todos os sujeitos foram dialisados duas vezes, uma no PFC e outra na AMG com intervalo de 3-4 semanas entre os testes.

As sondas foram inseridas no dia anterior ao início dos testes de microdiálise. Para evitar a oclusão, o LCR artificial (145 mM Na+, 2,7 mM K+, 1,22 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0,2 mM ascorbato, 2 mM Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) foi perfundido durante a noite a uma taxa de 0,06 μl/min. A amostragem dialisada e o monitoramento da atividade começaram na manhã seguinte. O fluxo de dialisado foi aumentado para 0,6 μl/ min, e amostras de dialisado de linha de base (∼12 μl/ amostra) foram coletadas a cada 20 minutos. As amostras foram coletadas até uma linha de base estável, definida como um mínimo de três amostras consecutivas em que os níveis de dialisado NE variaram em ±10%, foi alcançado. Após o estabelecimento de níveis de NE estáveis na linha de base, todos os animais receberam uma injeção i.p. (1 ml/kg) do medicamento ou veículo apropriado, que foi dada 40 min antes de um período de 10 min de pedalada. Os choques foram administrados em um horário variável com um intervalo médio de 40 segundos (intervalo de 10-70 segundos); cada choque (0,6 mA) teve uma duração de 0,5 segundos. As amostras foram coletadas por mais 120 minutos (6 amostras). As amostras foram imediatamente analisadas utilizando um dos dois sistemas similares de cromatografia líquida de alta performance com detecção eletroquímica (HPLC-EC). As amostras (10 μl) foram carregadas em colunas de fase reversa (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Produtos & Equipamentos, Concord, Ontário) através de portas de injeção manual (Reodyne 7125; 20 μl loop); correntes de redução e oxidação para NE, ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido 5-hidroxi-indoleacético (5-HIAA) e ácido homovanílico (HVA) foram medidas com detectores coulométricos de duplo canal ESA (Coulochem 5100, com uma célula de condicionamento modelo 5021 e uma célula analítica modelo 5011, Sci. Produtos & Equipamentos). As correntes para NE foram medidas independentemente das correntes para DOPAC e HVA, utilizando canais separados dos detectores Coulochem. As fases móveis (acetato de sódio 36 mM, SOS 3.1 mM, EDTA 100 μM, acetonitrilo 5%, ajustado a pH 3.7 usando ácido acético glacial) circularam através de cada sistema fechado a uma vazão de 1.4 ml/min por bombas de HPLC Waters 510. Os picos obtidos para NE, DOPAC e HVA foram integrados e quantificados pelo Sistema de Dados Cromatográficos EZChrom (Sci. Products & Equipment). As amostras dialisadas de ratos individuais foram sempre analisadas com o mesmo sistema HPLC-EC, e a atribuição de animais a cada sistema foi contrabalançada em todos os grupos de tratamento. Os alimentos foram retirados das câmaras antes da amostragem, mas um tubo de água potável estava disponível. Na conclusão dos testes, a confirmação da correta colocação da sonda foi determinada pelo exame de 30 seções μm cortadas através dos locais de colocação da sonda corada com Cresyl violet.

Experimento 2: Efeitos da Clonidina sobre a Reinstauração Induzida de Pés e Cocaína

Sujeitos

Os sujeitos eram 25 ratos Long-Evans machos (Rio Charles, Quebec) pesando 350-425 g no início do experimento. Os animais foram mantidos conforme descrito na Experiência 1.

Cirurgia

Animais foram preparados para cirurgia conforme descrito na Experiência 1. Um cateter intravenoso (Dow Corning) foi implantado na veia jugular direita. Um tubo de silicone de 3 cm de comprimento foi inserido na veia (diâmetro interno 0,30 mm, diâmetro externo 0,64 mm) e foi conectado com um tubo termoencolhível a um tubo de silicone de 9 cm de comprimento (diâmetro interno 0,51 mm, diâmetro externo 0,94 mm) que foi passado subcutaneamente para a parte superior do crânio. O cateter foi fixado à veia com suturas de seda e saiu em um conector (uma cânula de calibre 22 modificada; Plastics One, Roanoke, VA) que foi montado no crânio com parafusos de joalheiro e cimento dental; uma tampa de plástico foi colocada sobre a abertura da cânula. Os animais tiveram 1-2 semanas para recuperar da cirurgia.

Aparelho

As câmaras de auto-administração usadas nas experiências foram equipadas com uma alavanca retráctil (Med Associates, St Albans, VT) e uma alavanca “manequim” não retráctil. Ambas as alavancas estavam localizadas 9 cm acima do chão. Uma bomba de infusão (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) foi ativada por respostas na alavanca retrátil, ou “ativa”. As respostas na alavanca “dummy” foram registradas, mas não resultaram na ativação da bomba. A solução farmacêutica foi entregue durante um período de 10-s em um volume de 65 μl. Durante todo o período de infusão, uma luz branca de estímulo logo acima da alavanca ativa foi iluminada e respostas adicionais durante esse tempo foram registradas, mas não resultaram na reativação da bomba. Cada câmara de auto-administração foi instalada para fornecer corrente constante, intermitente, inescapável, choques elétricos através de um scrambler ao chão da rede (Gerador Grason-Stadler #E1064GS ou Med Associates). O pedal foi entregue durante 15 minutos de acordo com um horário variável a um intervalo médio de 40 segundos (intervalo de 10-70 segundos). Cada choque (0,6 mA) teve uma duração de 0,5 segundos. Esta intensidade de choques foi encontrada usando nosso aparelho para ser o mínimo necessário para induzir uma restauração confiável.

Drogas

Cocaína HCl foi obtida de BDH Chemicals (Toronto, Canadá) e foi dissolvida em soro fisiológico. Clonidina HCl foi adquirida da Sigma (St Louis, MO) e foi dissolvida em soro fisiológico e injetada i.p. (0, 20, e 40 μg/kg).

Procedimento

Fase 1: Treinamento. Ratos foram treinados para autoadministrar HCl de cocaína (0,5 mg/kg/infusão, i.v.) em um horário de reforço de ratio-1 durante uma sessão diária de autoadministração de 3 horas. A cada dia, metade dos animais eram levados às câmaras operantes para a sessão de auto-administração pela manhã, aproximadamente três horas após o apagamento das luzes, e metade dos animais eram levados às câmaras pela tarde, aproximadamente sete horas após o apagamento das luzes. O grupo de animais designados para as sessões da manhã e da tarde alternava-se diariamente, de modo que ao final do treinamento todos os animais tinham recebido um número igual de sessões de auto-administração em ambos os momentos. Era importante que todos os animais tivessem uma experiência semelhante de auto-administração no início e no final do dia, já que durante a Fase 2 todos os animais receberam sessões de extinção pela manhã, seguidas de uma sessão de teste que tipicamente ocorria na parte da tarde. No início de cada sessão, uma luz vermelha da casa era acesa durante 10 segundos antes da introdução da alavanca retráctil na gaiola. A luz logo acima da alavanca ativa foi acesa durante os 30 segundos iniciais, após a apresentação da alavanca. A luz da casa permaneceu iluminada durante toda a sessão. Como indicado anteriormente, as respostas na alavanca ativa resultaram na ativação da bomba de infusão e na iluminação da luz acima da alavanca durante os 10 segundos de entrega do medicamento. Foram registradas pressões adicionais na alavanca durante o período de entrega do medicamento, mas não resultaram na reativação da bomba. As condições de treinamento foram estabelecidas por 10 a 12 dias. No final do treino, os animais foram deixados sem perturbações na sala da colónia durante 7 a 13 dias. Posteriormente, ocorreu a extinção e os testes. Nesta experiência e na Experiência 3B, grupos de animais foram designados para diferentes doses dos medicamentos testados. Todos os animais de cada grupo foram então submetidos a três condições de teste; soro fisiológico, cocaína e choques nos pés.

Fase 2: Extinção e teste. Durante a extinção e os testes, que ocorreram durante quatro dias consecutivos, os animais foram alojados 24 horas por dia nas câmaras de auto-administração. Alimentos e água estavam livremente disponíveis para os animais, exceto durante as sessões diárias de extinção e testes. Os animais eram levados para as câmaras na noite anterior ao primeiro dia de extinção e de testes. Como dois grupos separados de ratos foram testados cada dia durante a fase de treinamento, um grupo de animais foi testado nos primeiros quatro dias da Fase 2 e o outro grupo de animais foi testado nos quatro dias seguintes. Durante a extinção e os testes, todas as condições que estavam presentes durante o treinamento foram mantidas, exceto que as prensas de alavanca não resultaram em infusões de cocaína.

Neste e em todos os experimentos subseqüentes de reativação, os animais foram submetidos a várias sessões diárias de extinção 1-h separadas por períodos intermediários nos quais a alavanca foi retirada. No dia 1, os animais receberam quatro sessões de extinção; nos dias 2-4, os animais receberam duas a três sessões de extinção, suficientes para estabelecer um nível básico de resposta de 15 ou menos respostas em uma hora, seguido por uma sessão de teste de 180 minutos. A duração dos períodos intervenientes foi mantida constante para cada experiência e correspondeu ao atraso necessário para a absorção de drogas entre as injecções pré-tratamento e o início do teste. No presente experimento, a duração dos períodos de intervenção foi de 40 min.

No teste, grupos separados de animais foram pré-tratados com 0, 20, ou 40 μg/kg, i.p., clonidina antes de cada um dos três testes para restabelecimento (soro fisiológico, cocaína, e choque de pés), dados em dias consecutivos e em ordem contrabalançada. A clonidina foi injetada 40 minutos antes de a alavanca ser inserida. Para os testes de soro fisiológico e de iniciação à cocaína, os animais receberam uma injeção de soro fisiológico ou cocaína (20 mg/kg) 5 min antes da inserção da alavanca. Para os testes de calcinação, os animais foram expostos ao stress breve e intermitente dos pés de 15 minutos imediatamente antes da inserção da alavanca. As sessões de teste foram de 3 horas de duração. A dose de cocaína e os parâmetros de choque dos pés foram escolhidos com base em trabalhos anteriores deste laboratório (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). As doses de clonidina foram escolhidas com base em experimentos de reintrodução que conduzimos com ratos treinados com heroína (Shaham et al. 2000).

Experiment 3A: Efeitos da Lofexidina em Altas Taxas de Resposta à Sacarose

Porque o perfil farmacológico da lofexidina não tem sido tão bem caracterizado como o da clonidina, foi realizado um experimento para estabelecer se, e em que doses, a lofexidina induz déficits de desempenho. As doses nos testes para reposição foram escolhidas com base nos resultados obtidos neste experimento.

Sujeitos

Os sujeitos foram 8 ratos Long-Evans (Charles River, Quebec) machos pesando 400-550 g no início do experimento. Ratos foram usados anteriormente em um experimento que visava estudar o restabelecimento da procura de sacarose induzida pelos pés (Buczek et al. 1999). Os animais foram mantidos em condições semelhantes às descritas no experimento 1.

Aparelho

A cada câmara de auto-administração foi equipada com duas alavancas estacionárias, simetricamente centradas em um painel lateral, 5 cm acima do chão. As respostas em uma alavanca, a alavanca “ativa”, acionou uma bomba (Razel Sci. Stamford, CT). As respostas na outra alavanca, a alavanca “dummy”, foram gravadas mas sem consequências. A ativação da bomba resultou numa entrega de 20 segundos de 0,18 ml de solução de sacarose para um recipiente de gota de líquido localizado entre as duas alavancas. Durante todo o período de entrega da sacarose, uma luz branca de estímulo logo acima da alavanca ativa foi iluminada e respostas adicionais durante esse tempo foram registradas, mas não resultaram na reativação da bomba.

Medicamentos

Lofexidina HCl foi generosamente fornecida por Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Reino Unido. O medicamento foi dissolvido em soro fisiológico e injectado i.p. (0, 80, 120, 160 ou 200 μg/kg).

Procedimento

Animais que tinham previamente aprendido a auto-administrar sacarose num estudo diferente (Buczek et al. 1999) foram subsequentemente dados cinco sessões ao longo de cinco dias consecutivos em que eles auto-administraram uma solução de sacarose a 30% num horário FR-1. Nas sessões diárias subsequentes, os animais foram injectados com veículo (0 μg/kg) ou lofexidina (80, 120, 160 ou 200 μg/kg, i.p.) 60 min antes do início da sessão de auto-administração. Todos os animais receberam todas as doses de lofexidina numa ordem contrabalançada; a dose mais elevada de lofexidina foi testada duas vezes. Cada sessão em que os animais foram tratados com lofexidina foi seguida por uma sessão de pré-tratamento salino para minimizar a possibilidade de efeitos de transporte do medicamento.

Experimento 3B: Efeitos da Lofexidina sobre a Reinstauração Induzida de Footshock- e Cocaína

Sujeitos

Os sujeitos eram 49 ratos Long-Evans machos (34 de Charles River, Quebec; 15 de Harlan Sprague Dawley, EUA) pesando 350-400 g no início da experiência. Os animais foram mantidos como descrito no experimento 1. Não houve diferenças óbvias na resposta entre os animais dos dois fornecedores em qualquer fase do experimento.

Procedimento

Fase 1: Treinamento. Os animais foram treinados para auto-administrar cocaína nas condições descritas na Experiência 2.

Fase 2: Extinção e testes. Nesta experiência, os períodos de intervenção, como descrito acima, foram de 60 min de duração. No teste, grupos separados de animais foram pré-tratados com 0, 50, 100, 150, ou 200 μg/kg, i.p., lofexidina, antes de cada um dos três testes de reposição (salina, cocaína, e stress dos pés), dados em dias consecutivos e em ordem contrabalançada (ver Experiência 2). A lofexidina foi injetada 60 minutos antes da inserção da alavanca. As sessões de teste foram de 3 horas de duração. As doses de lofexidina foram escolhidas com base nos resultados obtidos na Experiência 3A.

Experimento 4: Efeitos do Guanabenz sobre a Reinstauração de Footshock- e Cocaína- Induzida

Disciplinas

Os sujeitos eram 18 ratos Long-Evans machos (Rio Charles, Quebec) pesando 350-400 g no início da experiência. Os animais foram mantidos como descrito no experimento 1.

Droga

Guanabenz foi adquirido da Sigma (St Louis, MO) e foi dissolvido em soro fisiológico e injetado i.p. (0, e 640 μg/kg).

Procedimento

Fase 1: Treinamento. Os animais foram treinados para auto-administrar cocaína nas condições descritas na Experiência 2.

Fase 2: Extinção e testes. Nesta experiência, os períodos de intervenção, como descrito acima, foram de 60 min de duração. No teste, os animais foram pré-tratados com 0 ou 640 μg/kg de guanabenz, i.p., antes de cada um dos dois testes para a reintegração (sem choques nos pés, sem choques nos pés, sem soro, sem cocaína), dados em dias consecutivos (ver Experiência 2). O Guanabenz foi injectado 60 minutos antes da inserção da alavanca. As sessões de teste foram de 3 horas de duração. A dose de guanabenz foi escolhida com base na sua substituibilidade por 40 μg/kg de clonidina em um procedimento de discriminação de drogas (Bennett e Lal 1982).

Análises estatísticas

Dados de microdiálise foram analisados utilizando uma ANOVA de fator misto para concentração de NE extracelular em 20 minutos de amostras de dialisado; o fator entre sujeitos foi dose de clonidina (0, 20, 40 μg/kg), lofexidina (0, 75, ou 150 μg/kg), ou guanabenz (0 ou 640 μg/kg) e a medida repetida foi o tempo. O tempo significativo por interação de dose foi submetido a ANOVAs unidirecionais para o fator de dose em pontos específicos do tempo. Quando apropriado, testes post hoc (LSD de Fisher, p < .05) foram conduzidos para comparar o veículo (0 μg/kg) com as condições do medicamento.

As duas medidas dependentes nos testes para reposição foram o número de respostas na alavanca ativa (infusões + tempo fora das respostas) e o número de respostas na alavanca inativa em três horas. Todos os dados comportamentais são apresentados como média ± SEM. Devido à variabilidade considerável no número de respostas feitas nos diferentes testes para reposição, as estatísticas não paramétricas para amostras relacionadas (Friedman e Wilcoxon) e não relacionadas (Kruskal-Wallis e Mann-Whiney) foram usadas onde apropriado.

Para o estudo da sacarose (Experimento 3A) as medidas dependentes foram o número de respostas sobre as alavancas ativas (reforçadas + tempo esgotado) e inativas e o número de reforços obtidos. As medidas repetidas ANOVAs foram realizadas com a dose como o fator interno do sujeito. Quando apropriado, testes post hoc (LSD de Fisher, p < .05) foram conduzidos para comparar as condições do veículo (0 μg/kg) com as condições do medicamento.