Análises genômicas integrativas da assinatura, expressão e deleção germinativa do APOBEC3, e imunogenicidade em múltiplos tipos de câncer

Distintos padrões das isoformas do APOBEC3A e APOBEC3B associados à assinatura mutante do APOBEC. a Duas isoformas, uc003awn e uc011aob, transcritas do APOBEC3A, e três isoformas, uc003awo, uc003awp e uc003awq, transcritas do APOBEC3B. b Isoform uc011aoc derivada de um evento de fusão cobrindo desde a última intrônica do APOBEC3A até a última exon do APOBEC3B. c, d, e Os gráficos de distribuição indicam a associação entre APOBEC-mutacional assinatura e isoformas, uc003awn (c), uc003awo (d) e uc011aoc (e)

Utilizando análises de regressão múltipla que incluem todas as isoformas tanto do APOBEC3A como do APOBEC3B, descobrimos que os níveis de expressão do uc003awn (APOBEC3A) e do uc003awo (APOBEC3B) foram independentemente e comumente associados com a assinatura mutante avaliada do APOBEC em múltiplos tipos de câncer: bexiga (uma associação marginal para o uc003awn), mama, cervical, adenocarcinoma pulmonar e cabeça e pescoço (Tabela 1). Da mesma forma, uma associação adicional para o uc011awn (APOBEC3A) foi observada na tireóide, enquanto associações para o uc003awo (APOBEC3B) foram observadas no estômago, pâncreas e câncer de rim. Consistente com a análise univariada, uma associação marcante para a uc011aoc (APOBEC3A/B) com a assinatura mutante da APOBEC foi observada no câncer de mama (P = 5,3 × 10- 11), e uma associação adicional também foi observada no adenocarcinoma pulmonar (P = 0,01) (Tabela 1). Estes achados sugerem que a uc011aoc desempenha um papel específico dos tecidos ao afectar a assinatura mutante da APOBEC principalmente no cancro da mama, enquanto a uc003awn e a uc003awo desempenham um papel omnipresente, mas distinto, em todo o espectro do cancro humano. Notavelmente, nossa análise adicional mostrou a correlação de expressão positiva entre a isoforma uc011aoc e o APOBEC3A em uma grande parte dos tipos de câncer, especialmente no câncer de mama (arquivo adicional 1: Tabela S4).

Além disso, realizamos uma análise de associação estratificada por subtipos clínicos no câncer de mama. Observamos que as associações das isoformas de uc003awn (APOBEC3A) e uc011aoc (APOBEC3A/B) com a assinatura mutante da APOBEC variaram entre diferentes subtipos clínicos, sendo a associação mais significativa observada no subtipo LumA (arquivo adicional 1: Tabela S5).

ApOBEC3A/B da linha germinal afetando os níveis de expressão das isoformas dos genes APOBEC3A e APOBEC3B

Investigar como a deleção da linha germinal APOBEC3A/B afeta a expressão das isoformas do APOBEC3A e APOBEC3B, primeiro identificamos 30 amostras previstas para eliminação homozigotos, 239 amostras previstas para eliminação heterozigotos e 2287 amostras previstas para eliminação sem eliminação (arquivo adicional 1: Tabela S6, ver Métodos). A seguir, avaliamos as associações entre a deleção APOBEC3A/B da linha germinal e os níveis de expressão de cada isoforma usando análise univariada (ver Métodos). Como esperado, observamos que a supressão da linha germinal APOBEC3A/B foi significativamente associada à diminuição dos níveis de expressão da isoforma uc003awo (APOBEC3B) em todos os tipos de câncer com P < 0,05, exceto para o câncer do pâncreas com P = 0,14. Associações significativas com diminuição dos níveis de expressão do uc003awn (APOBEC3A) também foram observadas em três tipos de câncer – bexiga, mama e tireóide (Fig. 2; Tabela 2). Em contraste, nossos resultados mostraram que a deleção germinal APOBEC3A/B foi significativamente associada a um aumento do nível de expressão da uc011aoc (APOBEC3A/B) em todos os tipos de câncer, exceto cânceres de estômago, pâncreas e rins. Para estes, não houve significância estatística mas tiveram as mesmas direções de associação (Fig. 2; Tabela 2). Em particular, o câncer de cabeça e pescoço mostrou a associação mais significativa com P = 3,8 × 10- 65, e os cânceres de mama e bexiga mostraram a associação significativa com P = 3,0 × 10- 8, e P = 2,9 × 10- 7, respectivamente. Além disso, realizamos a mesma análise, estratificada por população, e uma tendência similar foi observada nestes tipos de câncer (dados não mostrados). Nossos achados sugerem que, em quase todos os tipos de câncer investigados, a deleção germinativa APOBEC3A/B foi significativamente associada à diminuição dos níveis de expressão de uc003awn e uc003awo, mas houve um aumento do nível de expressão de uc011aoc.

Associações entre os níveis de expressão isoforma do APOBEC3A e APOBEC3B e deleção da linha germinal do APOBEC3A/B. a Isoform uc011aoc transcrita de uma região de fusão derivada de uma deleção da linha germinal cobrindo desde o último intrônomo do APOBEC3A até o último exon do APOBEC3B. b, c, d Os gráficos da caixa indicam níveis de expressão de isoformas, uc003awn (b), uc003awo (c) e uc011aoc (d), para amostras que estão previstas para carregar deleção homozigotos e heterozigotos e não têm deleção para cada tipo de câncer

Linha germinal APOBEC3A/B influenciando a APOBEC-Assinatura mutacional, cargas de neoantigênio e composições relativas de células imunes, especificamente no câncer de mama

Um estudo anterior mostrou que a deleção de APOBEC3A/B na linha germinativa está associada a um aumento da assinatura mutante de APOBEC no câncer de mama, enquanto um padrão semelhante, mas sem significância estatística, foi observado em muitos outros tipos de câncer, como o de bexiga . Utilizando a análise univariada para avaliar os efeitos globais da deleção APOBEC3A/B na linha germinal sobre a assinatura mutante APOBEC, descobrimos que a deleção estava significativamente associada ao aumento da assinatura mutante APOBEC somente no câncer de mama (P = 5,6 × 10- 3; Tabela 3; Fig. 3a). Entretanto, uma tendência oposta foi observada na maioria dos outros tipos de câncer, embora a maioria das associações não tenha sido estatisticamente significativa (Tabela 3). Especificamente, no câncer de bexiga, observou-se que a deleção APOBEC3A/B na linha germinal estava significativamente associada à diminuição da assinatura mutante APOBEC (P = 1,7 × 10- 3; Tabela 3). Para elucidar ainda mais se a influência da supressão da linha germinal APOBEC3A/B na assinatura mutante APOBEC se deve ao seu efeito na expressão gênica, avaliamos ainda as associações entre a assinatura mutante APOBEC e a supressão com um ajuste para a expressão de isoformas (ver Métodos). Da mesma forma, nossos resultados revelaram que a deleção germinal APOBEC3A/B foi significativamente associada ao aumento da assinatura mutante APOBEC somente no câncer de mama (P = 2,8 × 10- 6; Tabela 3; Fig. 3b). Um tamanho maior do efeito (Beta = – 0,620) da deleção com uma expressão isoforma ajustada foi observado quando comparado com a observação inicial do efeito global (Beta = – 0,281; Tabela 3). Para avaliar se a supressão da linha germinal pode contribuir para a proporção de APOBEC-mutacional, também analisamos uma proporção de APOBEC-mutacional em relação ao total de mutações para cada amostra (ver Métodos). Consistente com a observação inicial da assinatura mutante da APOBEC, observamos que a supressão da linha germinal foi significativamente associada ao aumento da proporção da assinatura mutante da APOBEC somente no câncer de mama (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 e Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 para o efeito global e efeitos com expressão gênica ajustada; ver Tabela 3). Estes resultados indicam que a supressão da linha germinal APOBEC3A/B, que leva ao aumento da assinatura mutante APOBEC, é provavelmente devido à sua função distinta de uc011aoc transcrita da supressão, além de seu efeito no aumento das expressões de uc011aoc. Foi relatado que o haplótipo APOBEC3H I (APOBEC3H-I) pode contribuir significativamente para a assinatura mutante do APOBEC para amostras portadoras da linha germinativa APOBEC3A/B deleções no câncer de mama . Analisamos ainda o haplótipo APOBEC3H-I para um total de 76 amostras que foram preditas a carregar deleções de APOBEC3A/B na linha germinativa (ver Métodos). Nossos resultados mostraram que a assinatura mutante do APOBEC não estava significativamente correlacionada com o haplótipo APOBEC3H-I, independentemente das amostras previstas para carregar deleções germinativas homozigotos ou heterozigotos APOBEC3A/B (Dados não mostrados). Entretanto, nossos achados estão de acordo com o achado anterior de que a proteína APOBEC3A/B, gerada pela deleção, tem um nível de expressão maior do que a proteína APOBEC3A com base na investigação de ensaios funcionais in vitro .

ApOBEC3A/B de linha germinal associada à assinatura mutante APOBEC, cargas neoantigênicas e composição relativa de células T (CD8+) no câncer de mama. Uma significativa maior assinatura absoluta (a) e relativa (b) da APOBEC-mutacional, neoantigênio (c) e composição relativa das células T (CD8+) (d) em amostras previstas para carregar deleção homozigotos e heterozigotos em comparação com amostras previstas para não ter deleção no câncer de mama

Para explorar mais a função distinta e os caminhos potenciais que a expressão isoforma uc011aoc (transcrita da deleção APOBEC3A/B) pode estar envolvida, analisamos genes que foram coexpressos com a isoforma uc011aoc nas amostras previstas para carregar a linha germinal APOBEC3A/B deleções (ver Métodos). Uma análise de enriquecimento em vias de sinalização canônica usando o IPA revelou que esses genes co-expressos foram significativamente enriquecidos em vias canônicas distintas, variando de acordo com os tipos de câncer. Especificamente, observamos que as principais vias enriquecidas foram a sinalização HIPPO para bexiga, a sinalização PTEN para mama, iNOS e a sinalização Interferon para adenocarcinoma pulmonar, Hidrólise de Acyl-CoA para estômago, e DNA Double-Strand Break Repair e Ácido Gordo α-oxidação para pâncreas, sinalização EIF2 para tireóide e Integração mediada por GPCR para rim (P < 0,01 para todos; arquivo adicional 1: Tabela S7). Adicionalmente, um enriquecimento funcional em Morte Celular e Sobrevivência foi comumente observado em múltiplos tipos de câncer incluindo bexiga, mama, cervical, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma pulmonar (P < 0,05 para todos).

Avaliamos ainda a associação entre a deleção APOBEC3A/B da linha germinal e cargas de neoantigênio. Consistente com a observação da assinatura mutante de APOBEC, nossos resultados mostraram que a deleção germinativa APOBEC3A/B estava significativamente associada ao aumento das cargas de neoantigênio somente no câncer de mama (P = 6,5 × 10- 3; Fig. 3c), enquanto uma tendência oposta foi observada em muitos outros tipos de câncer (arquivo adicional 1: Tabela S8). Da mesma forma, descobrimos que a deleção da linha germinal estava marginalmente associada à relativa abundância da composição das células T (CD8+) nos TILs, mas apenas no câncer de mama (P = 0,08; Fig. 3d). A associação significativa foi detectada quando penteamos amostras com deleções homozigotos e heterozigotos e as comparamos com as amostras com deleções não portadoras (um teste de Wilcoxon assinado, P < 0,05). Entretanto, nenhuma associação foi observada para outras células imunes. Nossos achados mostraram que a deleção germinativa APOBEC3A/B desempenha um papel específico de tecido para afetar a assinatura mutante APOBEC e a imunogenicidade no câncer de mama, provavelmente reforçando os achados em estudos anteriores de associação ampla do genoma de potenciais mecanismos para sua associação com o aumento do risco de câncer de mama.

APOBEC-mutacional signature contribuindo significativamente para os neoantigénios

Para investigar até que ponto a assinatura mutante APOBEC contribui para os neoantigénios, analisámos as cargas previstas de neoantigénios para cada amostra recolhida de um estudo anterior (ver Métodos). Usando análise univariada, avaliamos associações entre a assinatura mutante APOBEC e as cargas de neoantigênio para cada tipo de câncer. Como esperado, a assinatura mutante APOBEC foi associada positivamente às cargas de neoantigênio em todos os tipos de câncer (P < 1,0 × 10- 4 para todas as comparações), enquanto as associações mais significativas foram observadas nos tipos de mama e bexiga com P = 5,1 × 10- 125, e P = 1,5 × 10- 90, respectivamente (arquivo adicional 1: Tabela S9). Da mesma forma, foi observada uma tendência geral positiva de associação entre as cargas previstas de neoantigênio e a proporção de assinatura mutante APOBEC, com exceção do câncer de estômago (Fig. 4; Arquivo adicional 1: Tabela S10). Especificamente, as associações significativas foram observadas em múltiplos tipos de câncer, incluindo bexiga, mama, cervical, adenocarcinoma pulmonar, cabeça e pescoço, e tireóide. Em particular, o câncer de mama e de bexiga mostrou as melhores associações com P = 8,9 × 10- 29, e P = 2,8 × 10- 27, respectivamente (Arquivo adicional 1: Tabela S10). Nossos achados sugerem que a assinatura mutante APOBEC tem um papel significativo na contribuição para a biogênese dos neoantígenos no câncer humano.

Associações entre as cargas previstas de neoantigénios e a proporção de APOBEC-assinatura mutacional

Associações entre a abundância relativa de composições de células imunes em TILs com carga de neoantigênio e assinatura mutante APOBEC

Para investigar a relação entre carga de neoantigênio e TILs, usamos dados de expressão gênica em tecidos tumorais para medir a abundância de composições celulares relativas de cada tipo de célula imune, incluindo células B naïve, memória celular B, células T CD8 e células T CD4 ativadas por memória em TILs (ver Métodos). Usando a análise univariada, avaliamos a associação entre a carga de neoantigênio e a abundância relativa de composições de células imunes para cada tipo de câncer. Observamos que houve uma tendência positiva de associação entre a carga de neoantigênio e ambos os tipos de células T CD8+ e CD4+ ativadas por memória em todos os tipos de câncer, exceto tiróide e rim (teste binomial P = 0,11 e P = 0,02 para as células T CD8+ e CD4+ ativadas por memória, respectivamente). Um padrão oposto foi observado tanto para os tipos de células B naïve e de memória em todos os tipos de câncer, com exceção do adenocarcinoma pulmonar (teste binomial P = 0,02 e P = 2,2 × 10- 16 para os tipos de células B naïve e de memória, respectivamente). Em particular, nossos resultados mostraram que as cargas de neoantigênio tinham uma associação com as abundâncias relativas de células T CD8+ e CD4+ ativadas por memória, e células B naïve e tipos de memória no câncer de bexiga. Houve uma associação tanto para os tipos de células B naïve e de memória no câncer de mama, como para os tipos de células T CD4 ativadas por memória no adenocarcinoma pulmonar, cabeça e pescoço e câncer de pâncreas (arquivo adicional 1: Tabela S11). Como a assinatura do APOBEC-mutacional contribuiu significativamente para os neoantigénios, avaliamos adicionalmente a associação entre a abundância relativa das composições celulares imunes nos TILs e a assinatura do APOBEC-mutacional. Consistente com a observação da análise de associação da carga de naeoantigênio, um padrão similar também foi encontrado para a assinatura mutante APOBEC (Arquivo adicional 1: Tabela S12). Nossos achados sugerem que a assinatura mutante APOBEC tem uma influência nas habilidades imunogênicas do câncer, como atrair certas células imunológicas nos TILs, possivelmente mediadas pelo aumento da carga de neoantigênio.