Antibiotic susceptibilidades das bactérias indicadoras Escherichia coli e Enterocococci spp. isolados de patos no município de Morogoro, Tanzânia
Métodos
Área de estudo e amostragem de patos
Este estudo transversal foi realizado no município de Morogoro entre novembro de 2014 e março de 2015, onde 100 patos moscovitas (Carina moschata) foram amostrados em 26 bandos de quintal. Os patos do estudo foram selecionados aleatoriamente de cada bando, onde 5-10% do tamanho do bando foi amostrado. As aves amostradas incluíam 86 fêmeas e 14 patos machos. Antes da amostragem, informações básicas sobre manejo, alimentação, usos e descarte de antibióticos não utilizados foram coletadas através de um questionário (arquivo adicional 1). Os patos seleccionados foram imobilizados manualmente e um cotonete esterilizado foi inserido na cloaca para recolher o material fecal. As amostras foram armazenadas em caixa fria com gelo e transportadas para o laboratório da Universidade de Agricultura de Sokoine para análise. Por uma questão de consistência, dois pesquisadores depois foram treinados pelos tecnólogos do laboratório em amostras de esfregaço de aves fizeram a amostragem a todos os 100 patos.
Isolamento e identificação de E. coli e Enterococci spp.
Amostras de Faecal foram banhadas em ágar MacConkey (Oxoid, Basingstoke, UK) e incubadas durante 24 h sob condições aeróbicas para isolamento de E. coli . As colónias suspeitas foram ainda identificadas com base na morfologia colonial, coloração de Gram e testes bioquímicos . Para o isolamento de Enterococci spp., as amostras foram incubadas durante 48 h em condições aeróbias e identificação com base na morfologia colonial e testes bioquímicos . Durante o isolamento e identificação, E. coli ATCC25922 e Enterococcus faecium ATCC 2912 foram incluídos como cepas controle.
Suscetibilidade a antibióticos
Todos os isolados de E. coli e Enterocococci foram testados para susceptibilidade a antibióticos usando o método de difusão em disco e interpretados de acordo com o CLSI . Testes de susceptibilidade antimicrobiana foram realizados para alguns antibióticos que são comumente usados na medicina humana na Tanzânia. Quatro antibióticos para E. coli foram testados em concentrações indicadas: ampicilina 10 µg, cefotaxima 30 µg, trimetoprim-sulfametoxina 25 µg e tetraciclina 30 µg. Enterococci foram testados contra ampicilina 10 µg, eritromicina 15 µg, rifampicina 5 µg, tetraciclina 30 µg e trimetoprim-sulfametoxina 25 µg. Todos os discos antibióticos eram de Oxoid, Basingstoke, UK.
Considerações éticas
A permissão para realizar este estudo foi concedida pelo Oficial Municipal de Pecuária de Morogoro e a aprovação ética para o estudo foi dada pelos Comitês de Ética da Universidade de Agricultura de Sokoine, Tanzânia. O consentimento verbal foi obtido de cada um dos agricultores antes da amostragem.
Resultados
Acima de 100 amostras fecais cultivadas 91% tinham E. coli, das quais 64 (70,3%) mostraram resistência a diferentes antibióticos testados (Tabela 1). Múltiplas resistências a antibióticos mostradas por E. coli foram: 28 (30,8%) isolados para quatro antibióticos, 35 (38,5%) para três antibióticos, 13 (14,3%) para dois antibióticos, 11 (12,1%) isolados para um antibiótico. O Enterococcus foi isolado de todas as amostras e 42% mostraram resistência a diferentes antibióticos testados. Cinco por cento dos isolados de Enterococcus foram resistentes a todos os antibióticos, 13% a quatro antibióticos, 21% a três antibióticos, 26% a dois antibióticos e 28% a um antibiótico testado. Os resultados sobre o manejo dos patos e seu possível acesso aos resíduos de antibióticos estão resumidos na Tabela 2. Dos 26 patos entrevistados, 92,3% manejaram extensivamente os patos onde eles tiveram acesso aos locais de despejo. Nenhuma administração de medicamentos veterinários foi relatada aos patos mas os entrevistados relataram tratar outros animais usando tetraciclinas/oxitetraciclina.
Discussão
O estudo atual constatou que as taxas de isolamento de E. coli foi de 91% enquanto todos os patos habitaram Enterocococci e os isolados tiveram altas taxas de resistência multiantibiótica. Este estudo mostrou que as bactérias indicadoras de patos necrófagos livres na Tanzânia podem ser usadas em estudos de resistência a antibióticos. Isto sugere que o problema da resistência aos antibióticos é generalizado mesmo para as bactérias isoladas de animais que não recebem terapia antibiótica. Isto tem um impacto na saúde pública uma vez que os patos necrófagos para a alimentação em volta das áreas de habitação e derramam os seus excrementos fecais por toda a parte e as bactérias resistentes podem encontrar o seu caminho na cadeia alimentar e afectar os seres humanos ou o gene resistente pode ser transferido para bactérias patogénicas .
A prevalência estimada de resistência aos antibióticos na E. coli isolada durante este estudo é comparável à resistência relatada na Malásia . Na Nigéria, uma baixa prevalência de 8,6% tem sido relatada provavelmente devido ao uso de diferentes antibióticos como ofloxacina, ácido nalidíxico e gentamicina . A alta prevalência de resistência a antibióticos observada durante este estudo provavelmente os patos são constantemente expostos a resíduos de antibióticos provenientes de descargas animais e humanas, devido a usos amplos . Estudos mostram que os antibióticos utilizados nos alimentos dos animais são pouco absorvidos no intestino e que o composto parental é excretado nas fezes. Isto é apoiado por vários estudos que têm relatado altos níveis de resíduos de antibióticos nos esgotos e resíduos animais . Portanto, a flora normal em patos necrófagos está constantemente exposta a resíduos de antibióticos, o que os faz desenvolver resistência como foi observado durante este estudo.
A resistência da E. coli à ampicilina foi a maior (81%) em comparação com outros antibióticos usados no estudo, semelhante ao relatório anterior na Eslováquia, onde a resistência registrada foi de 87,8% . Geralmente, estudos mostram que 60-70% dos isolados de E. coli desenvolveram resistência contra a ampicilina . Isto pode ser causado pelo uso excessivo de ampicilina na prática humana, cujos resíduos são fontes potenciais de contaminações ambientais onde os patos se alimentam. No caso da sulfametoxina, a resistência registada foi de 76%, tal como anteriormente registado pela Van Tuat . A resistência antibacteriana mostrada pela tetraciclina neste estudo foi de 59% enquanto que na Eslováquia foi de 37,5% e a da Nigéria foi de 75% . Curiosamente, a E. coli também mostrou resistência antibacteriana à cefotaxima a 63%, um antibiótico não comumente usado no tratamento dos animais na Tanzânia. Os patos podem ter acesso a resíduos de cefotaxima em lixeiras onde se encontram fezes humanas e restos de medicamentos eliminados (Quadro 2). No entanto, foi observada uma alta resistência à cefotaxima com bactérias isoladas dos esgotos de diferentes instalações sanitárias .
Resistências múltiplas de E. coli a mais de um antibiótico também foram observadas no estudo. Os achados foram muito altos quando comparados com o estudo realizado no Vietnã, onde a resistência múltipla à E. coli foi de 16,7% a quatro antibióticos, a três antibióticos 20% e a dois antibióticos 23,3% . Esta ocorrência de resistência a múltiplos medicamentos sugeriu que o gado desempenhou um papel de reservatório de bactérias resistentes à contaminação ambiental . Verificou-se que populações bacterianas isoladas do intestino de animais expostos a antibióticos tinham cinco vezes mais probabilidade de serem resistentes a qualquer antibiótico. As bactérias não resistentes normalmente adquirem os plasmídeos extra-cromossómicos resistentes a antibióticos (R-plasmídeos) dos resistentes quando estão em estreito contacto . A resistência observada pode ser contribuída pelo uso irracional de antibióticos que descarrega uma quantidade substancial de resíduos para o ambiente. Outros fatores que causam o desenvolvimento da resistência podem ser a fácil disponibilidade e o uso desenfreado de antibióticos de amplo espectro no tratamento presuntivo de infecções, mesmo em instalações de saúde. A falta de aplicação das normas sobre o uso de antibióticos como parte dos programas de controle de infecções poderia ter influenciado o padrão de resultados de resistência em um grau considerável.
Enterococci spp. são comensais naturais do intestino humano e animal. Todos os patos do estudo tinham Enterococci spp. no seu conteúdo intestinal que mostrou uma taxa de resistência de 42% a diferentes antibióticos testados. No entanto, os resultados deste estudo mostraram uma elevada resistência em rifampicina (62%), ampicilina (62%) e tetraciclina (42%). Também foi observada resistência multirresistência em mais de 65% dos isolados. Como foi dito anteriormente, a resistência observada das bactérias a diferentes antibióticos testados na ausência de uso dos medicamentos em patos pode ser devida a resíduos descarregados no ambiente onde os patos necrófagos podem facilmente ser expostos a antibióticos e outras bactérias resistentes. Quando as bactérias resistentes estão em contacto com as não resistentes, pode haver troca de materiais genéticos e o gene resistente pode ser adquirido. Noutros locais, estudos relataram que as Enterococci spp. isoladas dos patos mostraram resistência contra os macrolídeos e antibióticos lincosamídicos . No entanto, os Enterococci spp. são intrinsecamente resistentes a vários grupos antibióticos, incluindo cefalosporinas e aminoglicosídeos. Além disso, muitas cepas abrigam elementos genéticos transmissíveis para a resistência adquirida a vários antibióticos como a tetraciclina . Outros estudos de resistência a antibióticos em Enterococci spp. isolados de patos têm sido realizados utilizando o antibiótico vancomicina . Outros estudos de susceptibilidade dos Enterococci spp. à vancomicina são sugeridos no futuro, uma vez que o antibiótico é hoje em dia uma droga comum na medicina humana na Tanzânia.
O estudo do questionário apoia ainda mais a observação laboratorial sobre a alta taxa de resistência mostrada por E. coli e Enterococcus spp. Foi observado que os antibióticos são amplamente utilizados no tratamento de animais e humanos. Independentemente da não utilização de drogas veterinárias em anoitecer, o sistema de manejo extensivo de varreduras os expõe ao meio ambiente com resíduos de antibióticos e outras bactérias de animais e humanos, que têm estado sobre antibióticos. Isto é apoiado pelos achados de que as resistências observadas foram aos antibióticos que são comumente usados em humanos e animais (Tabela 2). As bactérias de resistência foram isoladas da variedade de fontes, incluindo a descarga de esgoto e o meio ambiente. Os restos de medicamentos e os recipientes foram eliminados de forma aleatória nos ambientes circundantes da casa, o que pode expor os patos ao antibiótico. Portanto, o sistema de manejo intensivo dos patos pode ajudar a minimizar a exposição desnecessária das aves aos resíduos antibióticos.
Conclusão
Generalmente, a resistência aos antibióticos mostrada por E. coli e Enterococcus spp. neste estudo foi elevada. Isto mostra o papel desempenhado pelo gado e pelas galinhas que estão constantemente a tomar antibióticos como potenciais fontes primárias de genes de resistência aos antibióticos para as bactérias isoladas dos patos. O isolamento de E. coli e Enterococcus spp. multiantibióticos resistentes aos antibióticos de patos servem como potenciais portadores de estirpes resistentes aos antibióticos para os seres humanos e coloca um grave problema à saúde pública.
Limitações
Este estudo utilizou apenas 100 amostras de patos colhidas no município de Morogoro o que limita a generalização dos resultados a serem utilizados como representativos do estado de resistência antimicrobiana com E. coli e Enterococcus spp. em patos na Tanzânia. Também os números de antibióticos testados foram poucos. Os testes de susceptibilidade antibiótica das bactérias utilizando o método de teste de difusão em disco podem ser inferiores aos métodos de microdiluição de caldo. Além disso, o estudo não determinou os genótipos de resistência em E. coli e Enterococcus spp. que eram resistentes a diferentes tipos de antibióticos. No entanto, a presença de outros animais no local onde foi feita a amostragem dos patos actua como factores de confusão sobre as taxas de resistência observadas nos isolados bacterianos dos patos.