Anticorpos específicos precisam de validação específica

Uma das ferramentas mais utilizadas na investigação biomédica é o anticorpo monoclonal. Estas proteínas têm o potencial de procurar e ligar-se a qualquer alvo desejado, e podem ser usadas para imagens celulares, classificação celular, imunoensaios e muitas outras aplicações.

Mas estes cavalos de trabalho de laboratório nem sempre são verdadeiros. Dependendo da natureza do seu alvo, um anticorpo pode ser inconsistente em certos testes – ligando-se ao alvo errado para dar resultados falsos positivos, por exemplo. Dada a prevalência do uso de anticorpos na pesquisa, este é potencialmente um problema de um bilhão de dólares.

Um objetivo principal é desenvolver estratégias de validação de anticorpos para que os pesquisadores possam ter confiança que um anticorpo é adequado para suas necessidades particulares – e que seus resultados serão reproduzíveis.

Thermo Fisher Scientific desenvolveu uma plataforma de validação de anticorpos em duas partes para testar não apenas a especificidade de seus anticorpos InvitrogenTM (que se ligam ao alvo certo), mas também sua adequação para diferentes aplicações. No entanto, o mesmo teste não é apropriado para todos os anticorpos: O Thermo Fisher usa um teste apropriado para cada alvo proteico, dependendo da sua função biológica. Certos anticorpos serão melhor testados usando CRISPR-Cas9 para derrubar o gene que codifica a proteína alvo, e verificar se o anticorpo não se liga mais a nada. Outros anticorpos poderão ser testados usando imunoprecipitação seguida de espectrometria de massa para verificar se estão ligados aos alvos certos.

Thermo Fisher está desenvolvendo e refinando testes de validação de anticorpos baseados na função biológica do antígeno alvo. Aqui estão dois estudos de caso de proteínas específicas e seus testes de especificidade.

Knock-outs for cancer

O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é uma proteína bem estudada: a desregulação na via EGFR está implicada em vários cancros. Para testar se os anticorpos são específicos do EGFR ou de algum dos seus alvos a jusante, os investigadores podem eliminar proteínas críticas na via EGFR e ver como o sinal de ligação de anticorpos muda.

Nos últimos anos, o sistema CRISPR-Cas9 tornou-se conhecido como a forma mais fiável e poderosa de eliminar um gene. Isto torna-o ideal para testar a especificidade dos anticorpos dentro de uma cascata de sinalização. Os pesquisadores da Thermo Fisher tomaram uma linha padrão de carcinoma humano (A-431) e usaram uma mancha ocidental para obter uma linha de base para o sinal de ligação. Eles então usaram CRISPR-Cas9 para eliminar o gene alvo e criar nocaute de EGFR. Uma mancha ocidental de proteína extraída destas células knockout mostrou que não havia mais nenhum sinal para uma proteína alvo (Figura 1).

Outros testes confirmaram o resultado. A cascata de sinalização a jusante da EGFR inclui proteínas como RAS, RAF, MEK e ERK. A ativação do EGFR pelo fator de crescimento epidérmico (EGF) leva à fosforilação dessas proteínas a jusante, que pode ser detectada usando outros anticorpos que reconhecem esses estados fosforados. No entanto, a adição de EGF às células de EGFR-knockout não deve resultar em nenhuma fosforilação a jusante. A adição dos mesmos anticorpos que reconhecem os alvos fosforilados não produziu nenhum sinal. Assim, os pesquisadores da Thermo Fisher estão confiantes de que o anticorpo anti-EGFR é específico para o alvo.

Uma série de modificações

No núcleo da célula, o DNA é firmemente embalado – enrolado em volta das proteínas do histone para formar cromatina. O estudo das histonas é difícil, pois elas podem ser afetadas por uma série de alterações químicas, conhecidas como modificações pós-traducionais (PTMs). Por exemplo, os resíduos de uma histona podem ganhar um ou mais grupos metilo, acetil ou fosforilo, que têm um efeito sobre a função celular.

Técnicas certas, como a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), western blotting, imunofluorescência e imunohistoquímica, usam anticorpos contra PTMs específicos da histona para compreender o estado da histona e sua ligação. No entanto, várias modificações de histone têm padrões de ligação de DNA semelhantes; um anticorpo que não tenha sido rigorosamente testado contra todos os PTMs de histone pode ligar-se ao tipo errado e dar um resultado falso-positivo.

Thermo Fisher testou os seus anticorpos específicos de PTMs de histone usando um conjunto de peptídeos com uma variedade de PTMs. Se um anticorpo é realmente específico de um PTM, ele se ligará apenas às manchas que carregam esse PTM. Os pesquisadores da Thermo Fisher mediram os sinais usando um fator de especificidade: a intensidade média de todas as manchas contendo um determinado PTM dividido pela intensidade média de todas as manchas sem ele (Figura 2). Os anticorpos mostraram um fator de especificidade 4 a 190 vezes maior para seu estado PTM alvo do que os estados não-alvo, dando a confiança de que eles são altamente seletivos.

Thermo Fisher tem outros sete testes de especificidade além dos testes genéticos de nocaute e arrays de peptídeo. Estes incluem o uso de RNAi para derrubar a expressão gênica, um anticorpo diferencialmente elevado para verificar o alvo de forma independente, e a expressão de variáveis naturais para confirmar a especificidade. Somente através de testes tão cuidadosos e rigorosos os pesquisadores podem estar confiantes de que seus cavalos de trabalho de laboratório estão aptos para o propósito – e que seu trabalho resistirá ao escrutínio mais próximo.

Encontrar notas de aplicação sobre esses anticorpos Invitrogen e mais sobre a abordagem de testes em duas partes da Thermo Fisher Scientific aqui.