[Antigen retrieval: its significance and drawbacks in immunohistochemistry]

Um dos maiores problemas em imunohistoquímica tem sido como manter tanto a boa morfologia como a imunoreatividade dos antígenos em seções teciduais. Várias técnicas para recuperar as imunoreatividades dos antígenos (desmascaramento) após preparações de rotina dos tecidos, tais como fixação, desidratação e incorporação, foram concebidas e estão agora a ser utilizadas para imuno-histoquímica não só em investigações citológicas mas também em diagnósticos patoclínicos. Neste relatório, em primeiro lugar, os mecanismos e o significado tanto da fixação como da recuperação de antígenos foram pesquisados sob o ponto de vista da inativação de proteínas. Segundo, alguns problemas práticos e notas em duas das técnicas mais populares de desmascaramento, digestão enzimática e recuperação de epitopos induzida pelo calor (HIER), foram revistos a fim de adaptar as técnicas precisamente na imuno-histoquímica. O principal artefato induzido pela fixação é o mascaramento dos antígenos dos tecidos devido à ligação cruzada entre os resíduos amino-ácidos das proteínas. É importante escolher uma condição de fixação adequada para cada antígeno considerando sua natureza bioquímica e resistência à fixação. (Tabela 2), e manter as condições de fixação a um mínimo para que a imunoreatividade do antígeno possa ser facilmente recuperada por várias técnicas de desmascaramento (Tabela 3, Fig. 1). A recuperação do antigénio per se é o processo que causa a desnaturação proteica nos tecidos, tal como muitos outros processos de inactivação de proteínas (Tabela 1). A digestão enzimática pode gravar as partes mascaradas das proteínas em torno de um antígeno para expor o seu epitopo. Embora a digestão enzimática seja relativamente simples e a sua condição de tratamento fácil de controlar, os resultados não são necessariamente dramáticos e consistentes, dependendo dos tipos ou lotes de enzimas. Assim, é necessário encontrar seu próprio manual de digestão para obter o melhor resultado de coloração para cada antígeno (por exemplo, Tabela 4). Por exemplo, a digestão da pepsina deu os melhores resultados na coloração imunológica da bromo-deoxiuridina (BrdU) e do antígeno nuclear celular proliferante (PCNA), enquanto outras enzimas tiveram pouco efeito (Tabela 5). O aquecimento também pode fender a espinha dorsal do polipeptídeo e romper as ligações cruzadas produzidas pela fixação. O efeito de aquecimento na recuperação do antígeno é dependente da temperatura e parece ser proporcional ao produto da temperatura e do tempo. No caso da imunoglobulina PCNA em secções fixadas em paraformaldeído, o aquecimento a 90 graus C durante pelo menos 3 min foi necessário, contudo, como a condição de aquecimento se tornou mais grave, as manchas de fundo não específicas também aumentaram (Tabela 6), o que é um dos problemas mais graves na recuperação de antigénios (Fig. 2a, c). Uma escolha possível para evitar tais resultados indesejáveis é a combinação de aquecimento subótimo (a 80 graus C durante 10-15 min) e digestão de pepsina (Fig. 2b, d). Uma consideração teórica importante para empregar um método tão dramático de desnaturação é se os epitopos antigênicos mascarados podem ser adequadamente expostos sem dar origem a resultados falso-positivos (ou falso-negativos) com anticorpos previamente confiáveis. Parece que cada antigénio requer uma preparação de tecido “à medida” para uma preservação óptima da sua antigenicidade e localização precisa. De acordo com o desenvolvimento da imunologia, biologia molecular, genética ou embriologia, a necessidade de múltiplas imunoglobulinas em combinação com outras tecnologias como a hibridação in situ deve aumentar a fim de analisar as relações espaciais e funcionais entre várias moléculas in situ. A recuperação de antígenos tornar-se-ia então uma estratégia poderosa.