Apc -related models of intestinal neoplasia: a brief review for pathologists
Carcoma colo-retal é uma causa comum de mortalidade por câncer no mundo ocidental. Em muitas práticas patológicas, os adenomas colorretais removidos durante a colonoscopia de triagem constituem uma alta porcentagem da carga diária de trabalho e, portanto, a morfologia do carcinoma colorretal humano e dos adenomas, suas lesões precursoras, é familiar aos patologistas patologistas cirúrgicos. Em centros acadêmicos, os patologistas cirúrgicos podem ser solicitados a interpretar modelos de camundongos de neoplasia para os investigadores, e um entendimento básico das semelhanças e diferenças entre a morfologia da neoplasia intestinal humana e modelos de camundongos é necessário para uma interpretação precisa.
Modelos de camundongos geneticamente alterados de neoplasia tumoral, enquanto às vezes criticados por sua modelagem imperfeita da doença humana, são úteis para avaliar se mutações específicas podem levar à formação de tumores, para estudos de quimioprevenção e para elucidar a funcionalidade de produtos gênicos alterados. Embora existam muitos modelos de ratos geneticamente modificados (GEM) de neoplasia intestinal descritos na literatura científica, eles podem ser amplamente divididos em 5 grupos: Modelos relacionados a Apc com alterações na sinalização Wnt, modelos deficientes de reparação de desajustes, modelos tratados com carcinógenos, modelos com alterações no fator de crescimento transformador β, e neoplasias associadas a colites que surgem em modelos imunodeficientes como os ratos IL10-/-. Esta revisão focará a patologia de um dos primeiros modelos GEM de neoplasia intestinal, o ApcMin+/- mouse e modelos relacionados, com o objetivo de descrever as características morfológicas das lesões intestinais, com comparação aos adenomas colorretais humanos e carcinomas.
Um dos modelos mais utilizados para neoplasia intestinal humana é o modelo ApcMin+/-, desenvolvido em 1990 no laboratório de William Dove (Moser et al., 1990). O ApcMin+/- rato, o primeiro modelo de rato mutante da linha germinal da neoplasia intestinal, carrega uma perda autossômica dominante da mutação da função no códon Apc 850 gerada pela exposição à N-etil-N-nitrosourea (ENU), um mutagênio altamente potente. Vários outros modelos com mutação Apc, muitos com mutações truncantes, têm sido gerados desde então (Tabela 1).
Estes modelos relacionados a Apc são particularmente úteis porque a mutação mais comum para carcinoma colorretal em humanos é a mutação no gene supressor do tumor APC, levando à inativação do APC e ativação do caminho de sinalização Wnt, com estabilização do β-catenin e sua translocação para o núcleo. O gene APC em humanos codifica uma proteína de 213 kilodalton envolvida na adesão e motilidade celular, regulação do ciclo celular, apoptose e transdução de sinal (Boman & Fields, 2013), e sua mutação na linha germinal resulta em polipose coli adenomatosa familiar (FAP). Esta síndrome de predisposição ao câncer é caracterizada pelo desenvolvimento de centenas de adenomas colorretais, levando ao adenocarcinoma em uma idade jovem. A maioria das mutações causadoras da FAP estão dentro da metade do gene 5′ e resultam em polipéptidos truncados.
Genética de modelos animais relacionados ao APC
Muitos modelos de camundongos relacionados ao Apc foram projetados para conter mutações na linha germinativa do Apc que levam à expressão de uma proteína Apc truncada; na maioria desses modelos, apenas heterozigotos são viáveis, pois a homozigose é letal embrionária. A perda do controle de crescimento após a perda da restante cópia do tipo selvagem da Apc leva a múltiplos adenomas intestinais. A localização específica da mutação do Apc afeta a multiplicidade, localização e longevidade do pólipo (McCart et al., 2008). Por exemplo, o rato Apc1638N/+ tem uma carga reduzida de pólipo e uma maior longevidade em comparação com o rato ApcMin/+ (Smits et al., 1998), No rato Apc1322T, a proteína mutante retém um ácido de 20 aminoácidos β-catenin binding/degradation repeat (no rato ApcMin/+, não há nenhum); os adenomas nestes ratos são detectáveis mais cedo, têm displasia mais grave, e são maiores (Pollard et al., 2009) em comparação com os ratos ApcMin/+. O tempo de perda da função Apc também pode ser importante; por exemplo, a perda de Apc por etapas usando Apc(Min/CKO) ou Apc(1638N/CKO) resulta em neoplasia grosseiramente visível no intestino, enquanto a perda simultânea leva à expansão clonal oculta através da fissão da cripta sem transformação morfológica (Fischer et al., 2012). A eliminação de todo o gene Apc no rato ApcΔel-15 produz um desenvolvimento mais rápido do tumor em comparação com a truncagem Apc, com diminuição da sobrevida, polipose mais grave e progressão mais avançada dos tumores do cólon em comparação com os ratos ApcMin/+ (Cheung et al.., 2010).
Modelos de rato geneticamente alterados com mutação Apc também estão disponíveis e são apelativos com base na longevidade dos modelos e na relativa facilidade de realização da colonoscopia, permitindo experiências longitudinais (Tabela 2). Os mais comuns são o rato Kyoto Apc Delta (KAD) e o rato Pirc. O rato KAD foi derivado através da mutagénese ENU e tem uma mutação sem sentido no códão 2523 no exon 15 de Apc, produzindo uma proteína truncada. Estes ratos são viáveis no estado homozigoto e não desenvolvem tumores intestinais espontaneamente. O tratamento com azoxymethane e dextran sulfato de sódio (AOM/DSS) é necessário para induzir neoplasia intestinal. O rato Pirc, também produzido via mutagênese induzida por ENU, tem uma mutação Apc no nucleotídeo 3409, produzindo uma proteína truncada. Esta mutação é letal embyronic no estado homozigoto. A mutação tem penetração de 100%, com todos os ratos desenvolvendo pólipos de cólon após 4 meses de idade.
Foi desenvolvido um modelo de porco geneticamente alterado portador de uma mutação APC 1311, ortológico para APC 1309 humano. Estes animais desenvolvem focos de cripta aberrantes, adenomas de cripta simples e adenomas colorretais múltiplos, semelhantes ao FAP humano. Os adenomas maiores apresentam progressão sob a forma de displasia de alto grau. O envolvimento superficial, semelhante aos adenomas humanos (Flisikowska et al., 2012), é característico.
Modificadores de Fenótipos de Câncer
As diferenças de tensão têm sido reconhecidas há muito tempo como tendo um efeito significativo na carga tumoral no modelo ApcMin+/-, que é geralmente mantido em um fundo C57Bl/6J. O cruzamento de ratos B6 Min/+ para AKR e outras linhagens consanguíneas resultou numa diminuição do número médio de tumores nos ratos F1 (Shoemaker et al., 1997). Experiências de retrocruzamento e outras análises genéticas para mapear loci modificadores produziram um número de genes candidatos a Modificador de Min (Mãe) (McCart et al., 2008). Além disso, a dieta e o microbioma intestinal da colónia de ratos têm efeitos importantes na multiplicidade, progressão e tamanho do pólipo. Por exemplo, uma dieta de alto teor de gordura e baixo teor de fibras no estilo ocidental tem mostrado aumentar o número de pólipos e a progressão tumoral em ratos ApcΔ716/+ (Hioki et al., 1997).
Patologia
A morfologia das lesões intestinais no ApcMin+/e modelos relacionados são semelhantes em todos os modelos, embora a idade de início, grau de displasia e distribuição no trato gastrointestinal varie (Tabela 1). As lesões reconhecíveis mais precoces consistem em uma única cripta ampliada ou pequeno grupo de criptas revestidas por células apinhadas com aumento da relação núcleo/citoplasma e hipercromasia nuclear (Fig. 1). Estas lesões iniciais são lesões displásicas de baixo grau, semelhantes a pequenos adenomas do cólon tubular observados em pacientes com PAF. No intestino delgado, desenvolve-se uma pequena invaginação na lâmina propria na zona proliferativa na junção da cripta e vilosidades (Fig. 2). As células adenomatosas empurram para dentro da lâmina própria e para cima, formando uma camada dupla de epitélio adenomatoso sob uma mucosa superficial normal (Fig. 3). No cólon, os adenomas precoces invadem a lâmina própria entre as criptas, embora também possam ser identificados adenomas de cripta simples (Oshima et al., 1997). A imunoistoquímica para a catenina beta pode ser usada para ajudar a identificar adenomas precoces, já que mesmo adenomas de cripta única em ApcMin+/- e modelos relacionados mostram acúmulo de catenina beta nuclear (Fig. 4).
Um pequeno adenoma na mucosa do cólon num rato Apc1638N/+, semelhante aos adenomas colorrectais humanos. Note o aumento da relação núcleo a citoplasma e núcleos lápisados hipercromáticos e apinhados
Uma única cripta adenomatosa no intestino delgado de um rato ApcMin/+, composta por uma invaginação cística dilatada no villu
Adenomas em ApcMin/+ e modelos relacionados são frequentemente cobertos por uma única camada de epitélio sobreposto normal, ao contrário dos adenomas colorrectais humanos, onde a mucosa da superfície é normalmente envolvida por epitélio adenomatoso
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Immunohistoquímica para beta catenina em ApcMin/+ e modelos relacionados é útil na identificação de pequenos adenomas de cripta única, que mostram perda do padrão membranoso normal e acúmulo de beta catenina no núcleo devido a alterações na sinalização Wnt
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À medida que os adenomas crescem, eles formam lesões polipóides, pedunculadas ou às vezes em forma de copo com um centro deprimido (Fig. 5a e b). Em muitos modelos, os adenomas não progridem para além da displasia de baixo grau. No entanto, em modelos de vida mais longa com menos tumores, alguns desenvolvem displasia de alto grau caracterizada pela arquitetura cribriforme, na qual nem todas as células estão em contato com uma membrana do porão (Fig. 6). Numerosas figuras mitóticas e corpos apoptóticos são comuns em adenomas em todos os estágios de desenvolvimento.
a Adenomas do intestino delgado em ratos ApcMin/+ empurram para os espaços intervilares à medida que crescem. Observe a preservação do epitélio normal sobre grande parte do adenoma. b Um adenoma cólico pedunculado em um rato Apc1638N/+
Displasia de alto grau, caracterizada pela arquitetura cribriforme, em um Apc1638N/+ adenoma
As neoplasias intestinais que surgem no ApcMin+/- e modelos relacionados contêm múltiplos tipos de células, mas são compostos principalmente de células do tipo absorvente e células gobelétricas (Tabela 3). Adenomas surgindo no intestino delgado do ApcMin+/- e modelos relacionados contêm células Paneth que são facilmente identificadas na hematoxilina e eosina (Fig. 7) e destacadas com imuno-histoquímica para lisozima. Foi demonstrado que elas compreendem 10% ou menos das células em adenomas do intestino delgado (Moser et al., 1992). O cólon de camundongo não contém células de Paneth, mas células lisoenzimáticas que não têm positividade de PAS foram identificadas em adenomas colônicos nestes modelos, sugerindo diferenciação semelhante à célula de Paneth mesmo em lesões colônicas (Moser et al., 1992; Husoy et al., 2006). As células neuroendócrinas compreendem uma pequena proporção das células nos adenomas tipo ApcMin+/-, mas o tipo celular específico reflete as células neuroendócrinas encontradas na mucosa intestinal normal no local do adenoma (Moser et al., 1992). Por exemplo, as células serotonina-expressoras são as células neuroendócrinas mais comuns no intestino de camundongos e são encontradas em todo o corpo; tais células compreendem até 5% das células ApcMin+/- adenoma, em lesões do intestino delgado e do cólon (Moser et al., 1992). As células PYY-positivas, pelo contrário, são encontradas apenas no adenoma a partir do cólon distal, reflectindo a distribuição destas células normalmente. As células neuroendócrinas estão difusamente espalhadas pelos adenomas e não formam pequenos grupos como as células lisoenzima-positivas (Moser et al.., 1992).
Os tipos de células múltiplas estão presentes nos adenomas no ApcMin/+ e modelos relacionados. Aqui, células Paneth dispersas podem ser identificadas pelos seus grânulos citoplasmáticos vermelhos, e algumas células gobelétricas estão presentes no adenoma. O tipo celular predominante é uma célula absorvente
Displasia em adenomas intestinais em modelos de camundongos deve ser classificada usando a mesma terminologia (displasia de baixo grau, displasia de alto grau, carcinoma intramucoso) e critérios como para adenomas colorretais humanos (Washington et al., 2013). A maioria dos adenomas no ApcMin+/- mouse e modelos relacionados mostram displasia de baixo grau, mas muitos se tornam progressivamente maiores à medida que o mouse envelhece, e alguns progridem ao longo da sequência de adenoma-carcinoma. O carcinoma invasivo é raro, pois a maioria dos camundongos morre de anemia ou intussuscepção antes da progressão. Entretanto, alguns dos modelos de vida mais longa com menos adenomas desenvolvem adenocarcinoma invasivo na submucosa (Colnot et al., 2004; Fodde et al., 1994; Robanus-Maandag et al., 2010). Metástase não ocorre em camundongos ApcMin+/- e é extremamente rara em modelos relacionados (Fodde et al., 1994).
Patologistas cirúrgicos solicitados a analisar amostras de intestinos devem estar cientes de uma armadilha na avaliação da invasão tumoral em modelos de camundongos. Como as camadas do intestino de camundongo são finas e delicadas, a hérnia de epitélio benigno em submucosa é uma ocorrência comum (Boivin et al., 2003), especialmente no cenário de prolapso retal e em condições inflamatórias (Fig. 8a e b). O mesmo deslocamento da mucosa adenomatosa (pseudoinvasão) ocorre em adenomas colorretais pedunculados em humanos e na colite cística profunda. Diretrizes consensuais para distinção entre hérnia e adenocarcinoma invasivo foram desenvolvidas em um Workshop de Modelos de Ratos de Neoplasia Intestinal nos Laboratórios Jackson em 2000 por um painel de cientistas e patologistas (Boivin et al., 2003) e estão resumidas na Tabela 4. Pode não ser possível diagnosticar com certeza o carcinoma invasivo, especialmente em modelos inflamatórios ou áreas de prolapso, e a avaliação de ratos mais velhos com lesões mais desenvolvidas pode ser necessária para uma determinação conclusiva da invasão.
a Prolapso retal em ratos pode imitar mudança adenomatosa, como em humanos. Aqui, observe a mucosa hiperplásica espessada, com alterações fibromusculares na lâmina própria. b Em áreas de prolapso, o deslocamento de criptas não neoplásicas pode imitar o adenocarcinoma invasivo. Aqui, uma única hérnia de cripta está presente na submucosa. Note o perfil arredondado da cripta e a semelhança com as criptas sobrepostas
Invasão na lâmina propria é caracterizada pelo desenvolvimento de perfis de cripta angular com células infiltrantes individuais e pode ser acompanhada de alterações estromais como desmoplasia e aumento da densidade de células inflamatórias (Fig. 9a e b).
a O carcinoma invasivo pode ser visto em modelos relacionados ao ApcMin/+ de vida mais longa. Em contraste com o perfil de cripta lisa da hérnia, o adenocarcinoma invasivo aqui mostrado tem um perfil angulado com infiltração de células tumorais em um estroma desmoplásico. b Neste exemplo de um rato Apc1638N/+, as células do adenocarcinoma infiltram-se na lâmina propria como pequenas glândulas anguladas com perfis pontiagudos e provocam uma reação inflamatória e estromal
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