Aplicações actuais dos microarrays de anticorpos

Devido às capacidades únicas dos microarrays de anticorpos e à sua aplicabilidade numa série de projectos biomédicos, foi desenvolvida uma série de diferentes microarrays de anticorpos, alguns dos quais se tornaram comercialmente disponíveis. Aqui, reunimos alguns dos estudos representativos dos últimos 7 anos (Tabela 1), e organizamos nossa visão geral em duas partes, dependendo do foco dos projetos: estudos básicos orientados pela biologia e pesquisa clínica. Como permanece praticamente impossível cobrir todas as aplicações recentes de microarranjo de anticorpos, focalizamos as aplicações que consideramos de grande interesse e descobertas de importante significado clínico.

Pesquisa básica

Caminho de sinalização relacionado

Alterações nos caminhos de sinalização é uma marca registrada de muitos estados da doença, incluindo câncer, diabetes e distúrbios neurodegenerativos . A construção de matrizes de anticorpos usando reagentes de captura direcionados a proteínas na cascata de sinalização de interesse permitiu aos pesquisadores investigar mudanças nos perfis de proteínas e modificações nas vias de sinalização em processos biológicos normais e estados de doença. Os pesquisadores aplicaram este conceito a uma gama de materiais e preparações de amostras biológicas, incluindo lisados celulares, extratos de tecidos e plasma .

Calbindin-D28 k (CB), uma importante proteína de ligação de cálcio que atua como um tampão de cálcio e é encontrada a ser expressa em níveis mais baixos no cérebro de ratos e humanos com doença de Alzheimer, mas não se sabe se estas alterações contribuem para a disfunção relacionada com AD (AD). Kook et al. geraram um rato transgênico deficiente em Alzheimer (CBKOTg) para investigar na contribuição da doença de Alzheimer para as vias de sinalização da doença de Alzheimer. Utilizando microarrays de anticorpos para examinar tecido cerebral de camundongos, identificaram alterações significativas nas vias de morte celular, transmissão sináptica e vias de sinalização MAPK na deleção de CB. Esses achados foram verificados pela imunohistoquímica, que mostrou aumento dos marcadores apoptóticos e aumento da morte neuronal, demonstrando que os microarrays de anticorpos podem fornecer novas informações, melhorando nosso entendimento do papel da CB e sua implicação na fisiopatologia da DA.

Microarrays de anticorpos têm sido usados para descobrir o papel fisiológico em proteínas altamente conservadas, incluindo o fator de alongamento 4. Gao et al. dissecaram o mecanismo de controle de qualidade do fator de alongamento mitocondrial fator de alongamento 4 (mtEF4) em tradução usando um microarrays de anticorpos fosfo-exploradores. Ao comparar os lisados celulares entre os tecidos de testículos de camundongos mtEF4 e WT, eles descobriram que o enriquecimento da dobra do mTOR foi o maior entre as diferentes vias de sinalização. Os autores mostraram que com a deleção do mtEF4, o maior sinal de feedback do citoplasma somático é a upregulação do mTOR. Isto foi acompanhado por um aumento da tradução citoplasmática, indicando assim que a mTOR desempenha um papel crucial como efetor a jusante, compensando a deficiência da tradução mitocondrial. Além disso, o estudo relacionou a conversa cruzada, previamente não descrita, entre o controle de qualidade mtEF4-dependente na mitocôndria e a via mTOR no citoplasma.

Mecanismo de drogação

Com a ajuda de ensaios de microarranjo de anticorpos, os pesquisadores podem investigar os mecanismos dos medicamentos de forma sistemática e eficiente. Entre muitas aplicações possíveis, a angiogénese induzida por tumores tem sido estudada, uma vez que desempenha um papel fundamental na progressão do cancro. O P11, um novo ligante peptídeo contendo um motivo de ligação PDZ (Ser-Asp-Val) com alta afinidade com a integrina αvβ3, foi identificado a partir de uma biblioteca de hexapeptídeos (PS-SPCL) usando um microarray de anticorpos. O mecanismo farmacológico do P11, foi elucidado usando uma abordagem de microarranjo farmacoproteômica especificamente projetada, contendo 48 anticorpos relacionados ao câncer . O estudo revelou que o P11 inibe a proliferação de células endoteliais da veia umbilical humana induzida pelo bFGF através da proteína cinase ativada por mitógeno e da inibição da cinase regulada por sinais extracelulares. Além disso, o microarray revelou que o P11 causou a upregulação do marcador apoptótico p53, resultando em indução de apoptose via ativação do sistema de caspases, o que indica que o P11 pode desempenhar um papel fundamental na prevenção da progressão tumoral. A ligação entre o P11 e o p53 apresenta pesquisadores clínicos e básicos do câncer que ajudarão a elucidar mais pistas sobre o papel do P11 e seu alvo inibitório.

Lovastatina, um produto natural derivado de Aspergillus terreus ou Monascus ruber, tem sido amplamente utilizado como um medicamento que reduz o colesterol na clínica. Yang et al. usaram um microarray de anticorpos contendo 656 anticorpos com foco em diferentes vias celulares funcionais, o que sugere que a lovastatina também tem propriedades anticancerígenas, através de mecanismos mal definidos. Existe uma forte necessidade de encontrar tratamentos oncológicos eficazes e de compreender os seus mecanismos de acção. Utilizando um microarray, as células cancerosas da mama foram estudadas sob condições hipóxicas para investigar os mecanismos moleculares através de Lovastin exalta o seu efeito. Elas mostraram 17 proteínas super-reguladas e 20 proteínas desreguladas para células de câncer de mama tratadas com lovastatina, em comparação com o controle, e os resultados foram posteriormente validados por PCR em tempo real. A assinatura proteica incluiu proteínas envolvidas na apoptose, proliferação celular e metástase tumoral, ligando a modulação destas vias à acção farmacológica da lovastatina.

O medicamento metformina tipo 2 para diabetes, também propôs ter propriedades anti-cancerígenas. Lee et al. investigaram a potência de novos derivados de metformina usando um microarray de anticorpos construído para estudar moléculas relacionadas ao ciclo celular. Os autores mostraram que o metformina-boritrato (MFB) teve melhor eficácia antitumoral do que a metformina-HCl, através de maior atividade neoplásica e melhor eficiência em prejudicar a progressão do ciclo celular durante as fases S e G2/M, além de parecer ter efeitos citotóxicos preferenciais nas populações de células-tronco do câncer de mama. Estes achados destacam como as matrizes de anticorpos podem fornecer evidências proteômicas que apoiam o desenvolvimento de medicamentos com melhor eficácia.

Para a pesquisa básica em biologia, os microarrays de anticorpos podem servir na detecção de proteínas de sinalização e proteínas associadas a um fenótipo particular. Arrays com detecção de proteínas paralelas criam uma oportunidade de investigar múltiplas vias de sinalização em um único experimento, fornecendo insights sobre novos mecanismos, tais como o estudo da progressão da doença, interação medicamentosa e resposta a infecções.

Pesquisa clínica

Análise de amostras clínicas no nível de proteína permitirá a melhoria dos marcadores de diagnóstico, e direcionando opções de tratamento. Uma vez que as proteínas estão envolvidas na maioria dos processos celulares, a análise proteica pode fornecer uma assinatura biológica da doença, gerando percepções detalhadas sobre o estado atual de uma célula, órgão ou sistema. Os microarrays de anticorpos podem fornecer um guia em tempo real das mudanças atuais nos processos biológicos durante a saúde e a doença. Nesta seção, vamos exemplificar como os microarrays de anticorpos têm sido usados para investigar coortes clínicas, principalmente analisando amostras de soro e plasma. Não é possível cobrir todos os aspectos dos microarrays de anticorpos para investigação clínica, aqui focamos apenas várias das doenças mais importantes, ou seja, doenças auto-imunes, doenças infecciosas, cancro e doenças neurodegenerativas.

Doenças auto-imunes

O diagnóstico do lúpus eritematoso sistémico (LES) é desafiante devido à sua apresentação clínica heterogénea e à falta de biomarcadores robustos para o distinguir de doenças activas e inactivas, bem como de outras doenças auto-imunes. Lin et al. realizaram um rastreio de microarranjo de anticorpos DotScan™ de células mononucleares do sangue periférico de 60 doentes com LES de actividade variável da doença, 25 doentes com artrite reumatóide, 28 outras amostras de doenças auto-imunes e 24 controlos saudáveis. Os perfis dos microarranjos de anticorpos poderiam distinguir os doentes com LES activos dos controlos saudáveis. Usando uma matriz de captura de leucócitos melhorou a capacidade discriminatória dos diagnósticos convencionais do LES, ao verificar o antidsDNA sérico, complementos C3 e C4, os microarrays aumentaram a capacidade de discriminação do LES semi-activo e activo, informação que ajudará a melhor gestão da doença.

Em outro estudo, Carlsson et al. construíram 135 variáveis de fragmento de cadeia única recombinante humana (scFv) visando proteínas imunitárias para construir um microarray de anticorpos interno. Neste estudo, eles examinaram pacientes com esclerose sistêmica (SSc), LES e 15 voluntários saudáveis. A SSc é um distúrbio auto-imune que afeta o tecido de conexão, o que pode ser um desafio para o diagnóstico diferencial do LES. A matriz identificou 40 proteínas expressas diferencialmente, criando uma assinatura proteômica candidata para delinear o LES e sua gravidade a partir da SSc. Essa assinatura proteômica foi uma melhor classificação de doença do que uma ou mesmo combinações de parâmetros clínicos convencionais, incluindo, ANA, anti-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 e CRP, ilustrando o uso potencial de microarrays de anticorpos para criar novas assinaturas de doenças que agregarão valor clínico ao manejo da doença.

Doenças infecciosas

Infecções ativam o sistema imunológico de forma diferente, e esses mecanismos podem ser investigados usando matrizes de anticorpos em nível de proteoma. Helicobacter pylori é um patógeno que coloniza aproximadamente metade da população mundial, o que causa gastrite crônica. Sukri et al. empregaram o microarray de anticorpos DotScan™ para determinar a tolerância do sistema imunológico às células tumorais no câncer gástrico usando 144 anticorpos CD para perfilar a distribuição de marcadores CD entre células de adenocarcinoma gástrico infectadas e não infectadas pelo Helicobacter pylori. Curiosamente, eles encontraram células da linha de adenocarcinoma gástrico AGS infectadas por cagA + H. pylori mostraram aumento da expressão do CD27, que é essencial para a manutenção da população de células T, e o aumento dos marcadores de CD também foi detectado em pacientes com câncer gástrico infectados por H. pylori-infecção. Este estudo sugere não só a tolerância do sistema imunológico ao câncer gástrico, mas também as variações da resposta imunológica exploradas por diferentes linhagens de H. pylori.

Outras vezes, as matrizes de anticorpos podem ser úteis no acompanhamento de uma mudança contínua no ambiente fisiológico, incluindo o estado da doença e a resposta a terapias e intervenções. Após o transplante hepático, 94% dos pacientes foram encontrados com o vírus da hepatite C (HCV) induzindo danos histológicos, com alguns pacientes sofrendo recidiva de doença grave. Há uma necessidade urgente de biomarcadores preditivos para identificar a gravidade da doença recorrente. Usando um microarray de anticorpos CD, o sangue periférico de pacientes definidos como grupos pré-transplante, precoce, médio e tardio foram investigados para prever a gravidade da recidiva do HCV após o transplante . Amostras seriadas de sangue colhidas de pacientes antes e depois do transplante hepático permitiram o rastreamento do meio da doença, com seus próprios controles internos. Cinco marcadores de DC (CD27, CD182, CD260, CD41 e CD34) foram significativamente aumentados na recidiva grave, em comparação com a recidiva leve. Este resultado mostra que as matrizes de anticorpos podem auxiliar na avaliação da gravidade da doença do HCV recorrente após o transplante hepático.

Ellmark et al. desenvolveram um único anticorpo recombinante estrutural (SinFabs) microarray contendo 127 anticorpos diferentes contra antígenos imuno-reguladores selecionados da biblioteca n-CoDeR sobre adenocarcinoma gástrico. Eles elucidaram que assinaturas distintas de expressão de proteínas associadas a tumores e infecções, como IL-9, IL-11 e MCP-4, poderiam ser identificadas a partir dos proteomas plasmáticos e servir como potenciais biomarcadores. Estes achados podem ajudar a melhorar a compreensão do câncer induzido por H-pylori e podem preparar o caminho para diagnósticos refinados no futuro.

Foram realizadas matrizes de anticorpos à base de esferas para investigar perfis diferenciais de proteínas no plasma em crianças que sofrem de malária e complicações relacionadas à malária. De 1000 proteínas rastreadas, 41 proteínas tiveram expressão diferencial entre as crianças infectadas pela malária e os controles comunitários. Treze outras proteínas foram ligadas à gravidade da malária. Estes achados indicam o envolvimento da inflamação, bem como o desequilíbrio do metabolismo da glicose nas formas graves da doença e as maiores alterações foram observadas em duas das proteínas musculares (anidrase carbónica 3 e creatina quinase) apontadas para lesões e danos musculares em crianças com malária cerebral. Estes achados podem ajudar no desenvolvimento de testes simples para classificar crianças infectadas com malária em grupo, mostrando um maior risco para a forma grave da doença.

Câncer

Microarrays de anticorpos têm sido aplicados na pesquisa do câncer principalmente para estudar a progressão do câncer e proteínas candidatas que podem servir como biomarcadores diagnósticos. O câncer pancreático é uma doença agressiva com mau prognóstico, e os biomarcadores específicos da doença que oferecem diagnóstico precoce e preciso estão em necessidade urgente. Usando uma plataforma de microarranjo de anticorpos recombinantes desenvolvida internamente, Wingren et al. rastrearam soros de 148 pacientes com câncer pancreático, pancreatite crônica, pancreatite auto-imune (AIP) e controles saudáveis. Eles identificaram um painel de 25 alvos proteicos, incluindo IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, que contribuíram para distinguir o câncer pancreático dos controles saudáveis. Essa 25 assinatura proteica apresenta um alto potencial de diagnóstico (AUC de 0,88). Além disso, o grupo ampliou recentemente a análise de seu painel para conjuntos de amostras adicionais, incluindo linfoma, câncer de próstata e de mama em lisados de células e plasma. Estes achados são úteis para ajudar no desenvolvimento de métodos de diagnóstico novos e multivariados.

Uma das questões mais importantes em biologia do câncer, é a determinação da invasividade de um tumor. Um estudo desenvolveu uma plataforma personalizada de microarranjo de anticorpos contendo 4096 características para interrogar amostras de plasma abrangendo doenças pré-invasivas e invasivas a partir de um modelo de adenocarcinoma pancreático ductal (PDA) de camundongo. Eles encontraram uma assinatura proteica, compreendendo a expressão diferencial de três proteínas, ERBB2, TNC e ESR1, que poderia ser usada para melhorar a AUC de 0,86 (intervalo de confiança de 95% 0,76-0,96) para 0,97 (IC 95% 0,92-1,0) quando o marcador PDA CA19-9 incluía.

A maioria dos casos de câncer de bexiga recém-diagnosticados são de baixo estágio, baixo grau, não invasivos . Após a ressecção transuretral padrão, 50-70% dos tumores voltam a ocorrer, porém 10-30% dos tumores progridem para doença músculo-invasiva . A compreensão do mecanismo de progressão tumoral pode fornecer informações mais úteis para os escopos clínicos. Srinivasan et al. estudaram lisados lisados celulares com um microarranjo de anticorpos contendo 810 anticorpos relacionados ao câncer construídos pelo laboratório Hoheisel. Os autores construíram um classificador multivariado contendo 20 proteínas, o que facilitou a previsão de recidiva com uma sensibilidade de 80% e uma especificidade de 100%. Curiosamente, encontraram a repressão da via de sinalização TGF-β no câncer recorrente. Os fatores de sinalização IFNG, TNF-α e THBS1 foram expressos menos e a abundância do inibidor MAPK3 (também conhecido como ERK1) foi maior, enquanto SMAD2, SMAD3 e SMAD4 foram novamente significativamente subrepresentados. Os dados indicaram que os inibidores da via de sinalização TGF-β podem reduzir a recorrência do câncer de bexiga .

Puig-Costa et al. empregaram microarrays de anticorpos para descobrir biomarcadores para câncer gástrico (GC). Notavelmente, os microarrays de anticorpos continham anticorpos direcionados a diferentes proteínas funcionais bem conhecidas que desempenham um papel crucial na progressão do câncer, incluindo 120 citocinas, 43 fatores angiogênicos, 41 fatores de crescimento, 40 fatores inflamatórios e 10 metaloproteinases. A análise da via de ingenuidade confirmou que alguns biomarcadores, como o ICAM-1 e a angiogenina, indicaram uma elevada resposta inflamatória em pacientes com GC. O movimento celular e os alvos do tráfico de células imunes, como a proteína quimiotrativa monócita (MCP)-1, foram sobre-representados em pacientes com GC. Os valores preditivos positivos e negativos nesta coorte de validação foram 75% (95% CI 53-90) e 80% (95% CI 56-94), respectivamente. Finalmente, análises de microarranjo de anticorpos do proteoma inflamatório associado ao GC identificaram uma assinatura inflamatória protéica de 21 proteínas do câncer gástrico (INPROGAS) que discriminava com precisão o GC da mucosa gástrica não carcinogênica, e pode fornecer novos eletrodos para a análise da progressão do câncer.

No câncer de próstata, Schwenk et al. usaram matrizes de anticorpos em matrizes de esferas em suspensão para comparar os níveis plasmáticos de proteínas entre diferentes grupos, a fim de encontrar biomarcadores adicionais junto com o antígeno prostático específico (PSA). Além de classificarem os doentes com base no PSA, identificaram níveis plasmáticos reduzidos de CNDP1 e, num estudo subsequente de maior envergadura, foi demonstrada a sua associação em formas mais agressivas da doença. Um imunoensaio em sanduíche foi desenvolvido para validar estes achados em mais de 1200 pacientes, e a associação da diminuição do CNDP1 com metástases linfonodais foi ainda mais elucidada. Isto demonstra um dos poucos estudos que validaram com sucesso uma indicação inicial através do tubo de microarranjo de anticorpos e o desenvolvimento de um ensaio direccionado. Numa investigação subsequente da caquexia do cancro, verificou-se que os níveis plasmáticos de CNDP1 diminuíram em doentes com caquexia, apontando assim para um papel metabólico das alterações nos níveis de CNDP1 .

Num estudo de tumores neuroendócrinos do intestino delgado, Darmanis et al. investigaram os níveis plasmáticos de dois conjuntos de estudos independentes (77 e 132 amostras) e um conjunto de esferas-alvo para 124 proteínas únicas. Eles puderam alcançar uma precisão de classificação de até 85% usando um painel de proteínas e concluíram com a proposta de novos candidatos para classificar os tumores. Dos candidatos pré-selecionados, como para IGFBP2 e IGF1, o grupo realizou ensaios ELISA para confirmar as indicações. Estes achados indicam uma associação metabólica de proteínas plasmáticas com câncer e apoio para considerar estes alvos em futuros estudos sobre câncer.

Doenças neurodegenerativas

Análise de expressão protéica oferece a possibilidade de ampliar os conhecimentos atuais sobre patofisiologia neurodegenerativa. Avanços recentes no campo da proteômica ofereceram o potencial para a busca de novos biomarcadores usando microarrays de anticorpos . Avanços no desenvolvimento de protocolos permitiram aos pesquisadores estudar não apenas o sangue, mas também o líquido cefalorraquidiano (LCR) .

Com a neuroproteômica, o laboratório Nilsson conduziu vários estudos usando anticorpos do Atlas de Proteínas Humanas em conjunto com os ensaios do conjunto de esferas de suspensão. Ao perfilar o LCR de pacientes com Esclerose Múltipla (EM), eles encontraram GAP43, uma proteína citoplasmática envolvida na formação e regeneração de neurônios, daí uma promissora doença biomarcadora do cérebro. Mais recentemente, Remnestål et al. compararam os níveis de proteína em 441 amostras de LCR coletadas de diferentes conjuntos de amostras de doenças neurodegenerativas, bem como de LCR coletados post-mortem. Entre 376 anticorpos, verificou-se que as proteínas sinápticas GAP43 e NRGN estavam associadas a doentes com AD em comparação com os controlos.

Usando amostras de plasma, LCR e tecido cerebral de doentes com EM, foi realizado um rastreio em larga escala que começou com a utilização de 4500 anticorpos em conjuntos de esferas . Um conjunto de proteínas foi associado a subtipos de EM no LCR e no plasma. Utilizando alguns dos anticorpos candidatos levantados contra IRF8, IL7 e METTL14 também para análise de imunofluorescência de tecido cerebral mostrou coloração de neurônios nas proximidades de lesões de EM. Isto indica que anticorpos selecionados de ensaios baseados em array para análise de fluidos corporais também podem fornecer evidências adicionais no tecido afetado.

Por último, as arrays de esferas foram usadas para traçar o perfil plasmático de pacientes que sofrem de esclerose lateral amiotrófica (ELA), onde 367 pacientes com ELA e 101 controles foram analisados para 278 proteínas. O estudo conclui com a proposta de polipéptido neurofilamento médio (NEFM), família portadora de soluto 25 (SLC25A20) e regulador de G-protein signalling 18 (RGS18) como proteínas valiosas por estarem envolvidas em processos relacionados à fisiopatologia da doença, que justificam validação adicional em conjuntos de amostras independentes.