Apocynin, a Low Molecular Oral Treatment for Neurodegenerative Disease

3. Eficácia da apocinina em modelos animais AIMID

A doença alvo inicial na qual testamos o efeito clínico da apocinina foi o modelo WAG/Rij (RT-) da artrite induzida por colágeno (CIA), que é um modelo pré-clínico aceite da doença inflamatória auto-imune (AIMID) da artrite reumatóide (AR). Neste modelo, os PMNs têm um claro papel patogénico , reflectindo a situação nos doentes com AR. No estudo com ratos escolhemos administrar a apocinina numa dose de 0,3 a 200 μg/mL de água potável, a qual foi fornecida ad libitum. Foi observado que já na dose mais baixa de 0,3 μg/mL, correspondente a uma dose oral diária de 6 μg, a artrite foi quase completamente suprimida. Nenhum efeito da apocinina nos níveis séricos de autoanticorpo anticolágeno ou de IL-6, uma importante citocina patogênica na CIA e RA, foi observado, sugerindo uma alta seletividade para o componente inflamatório da doença. Independentemente de nós, Hougee et al. demonstraram em um modelo de CIA de camundongo que a apocinina administrada oralmente restaura a produção bloqueada de proteoglicano cartilaginoso na articulação artrítica. Um efeito colateral intrigante do tratamento, ilustrando o poderoso efeito anti-inflamatório da apocinina, foi a dramática supressão das lesões cutâneas necrosantes nos locais onde a formulação do antígeno imunizante/CFA foi injetada.

Desde sua identificação inicial como potente agente anti-inflamatório em 1990, a apocinina tornou-se um inibidor estabelecido da explosão oxidativa nos neutrófilos, como demonstrado em uma ampla gama de modelos in vivo para distúrbios inflamatórios imunomediados que afetam os órgãos periféricos e centrais. De particular importância para esta revisão são os efeitos clínicos promissores observados em modelos de doença neurodegenerativa, incluindo a ALS, Alzheimer e doença de Parkinson. Nestes modelos, a atividade antioxidante da apocinina não é dirigida ao neutrofilo mas ao “macrófago do cérebro”, ou seja, microglia.

4. Microglia

O cérebro contém vários tipos de células com a capacidade de exercer funções imunológicas, incluindo as astrócitos, células microglia, e macrófagos localizados nas meninges e espaços perivasculares das artérias cerebrais e capilares. Para suas tarefas imunológicas, estas células são equipadas com receptores conservados para padrões moleculares associados a patógenos ou a danos, que retransmitem sinais de ativação às células para induzir mecanismos efetores inflamatórios .

Microglia são células imunes inatas ubiquamente distribuídas dentro do sistema nervoso central, onde estão envolvidas em interações estreitas com neurônios, oligodendrócitos e astrocitos. Entretanto, somente microglia libera MPO após estimulação, sendo um requisito para a ativação metabólica da apocinina.

Microglia no SNC saudável possuem um fenótipo de repouso ramificado. Ao contrário dos conceitos anteriores, as microglia no cérebro saudável não estão em repouso, mas são células altamente dinâmicas que realizam a vigilância homeostática do ambiente extracelular pela extensão e retração de suas protuberâncias e fagocitose dos resíduos teciduais, que de outra forma poderiam causar inflamação. Microglia ativada é encontrada no tecido doente do SNC, como dentro de lesões desmielinizadas de matéria cinzenta cortical no cérebro da EM, ao redor de placas amilóides no cérebro de Alzheimer e na substância degenerante nigra na doença de Parkinson . Embora os diversos perfis de expressão da microglia pareçam refletir um amplo e contínuo espectro de estados de ativação, dois estados de ativação em ambas as extremidades do espectro podem ser reconhecidos correspondendo aos estados M1 e M2 designados para macrófagos . As microglia M1 “Classicamente ativadas”, por exemplo, induzidas por LPS ou IFNγ, têm funções pró-inflamatórias que são exercidas pela secreção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β, e IL-12 e substâncias tóxicas como espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. As microglia M2 “ativadas alternadamente”, como as induzidas em um meio que contém níveis elevados de IL-4 ou IL-13, têm atividades anti-inflamatórias e regenerativas dos tecidos, que são mediadas por citocinas como IL-4, IL-10 ou TGF-β e por fatores reparadores como o fator de crescimento semelhante à insulina, a argina-1 ou a quitina-1. Não apenas o meio citocina, mas também o estado redox do microambiente, que está diretamente relacionado com a atividade da NADPH oxidase, determina a diferenciação funcional da microglia para um fenótipo M1 ou M2 .

5. A apocinina como potencial tratamento da doença neurodegenerativa

M1 as células da microglia são o principal recurso da Nox2 no cérebro. A expressão pela microglia M1 da Nox2 ativada produzindo ROS é um componente essencial da neurotoxicidade mediada pela microglia. A noção amplamente aceita de que as ROS derivadas da microglia são mediadores importantes do dano cerebral neurodegenerativo levanta a questão se o perfil farmacológico favorável e a baixa toxicidade da apocinina podem ser usados para o tratamento neuroprotetor. As células de microglia não só expressam Nox2, mas também secretam MPO após a ativação, podendo assim potencialmente exercer a ativação metabólica da apocinina. Vários autores relataram o efeito benéfico da apocinina em (modelos de) distúrbios neurológicos agudos, tais como isquemia, hemorragia intracerebral, e acidente vascular cerebral (revisto em ). Quais são as perspectivas da apocinina em distúrbios neurodegenerativos crônicos?

Estudos in vitro usando microglia cultivada implicaram ROS derivada da Nox2 na proliferação e polarização funcional da microglia . Uma descoberta crucial tem sido que a inibição da Nox2 promove a ativação de microglia alternativa e antiinflamatória durante a neuroinflamação . Isto implica que a supressão da Nox2 com apocinina pode restaurar um equilíbrio saudável entre um M1 pró-inflamatório e um fenótipo anti-inflamatório/proregenerativo M2 da microglia. Outros demonstraram que a apocinina reduz a produção de IL-1β, TNF-α e óxido nítrico por microglia, interrompendo assim um ciclo auto-perpetuador de atividade prejudicial. Embora o mecanismo neurotóxico exato da microglia ativada na doença neurodegenerativa ainda seja incerto, também é de considerável interesse que a liberação da excitotoxina glutamato requeira atividade Nox2 e que esta possa ser inibida pela apocinina . Em conjunto, estes dados sugerem um papel potencialmente benéfico da apocinina na doença neurodegenerativa. De fato, efeitos promissores da apocinina têm sido observados em modelos de camundongos de algumas doenças neurodegenerativas importantes.

Esclerose Lateral Miotrófica (ALS, Doença de Lou Gehrig). A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa comum em adultos, que afeta os neurônios motores. A doença leva a uma rápida progressão do comprometimento motor e morte, geralmente dentro de 5 anos. Enquanto na maioria dos pacientes a causa da doença é desconhecida, em um subconjunto de casos a doença tem uma causa genética, ou seja, mutações no gene superóxido dismutase-1 (SOD1). A mutação aumenta o stress oxidativo pela produção desregulada do ânion superóxido devido à redução da dismutação para H2O2. A SOD1 mutante expressando astrocitos está ligada à patologia da ALS devido à sua reduzida capacidade de absorver glutamato e/ou pela sua liberação de fatores neurotóxicos . O silenciamento seletivo do SOD1 mutante ou a substituição do mutante por microglia do tipo selvagem no modelo de rato SOD1 mutante apontam fortemente para um papel patogênico central da microglia. Harraz et al. usaram a apocinina oral para controlar a progressão da neurodegeneração em um modelo de rato mutante SOD1 e observaram efeitos promissores; foi observado que a administração de apocinina na água de beber prolongou significativamente a sobrevivência e atrasou o início de defeitos motores. Este estudo mostra que a apocinina administrada oralmente pode acumular uma concentração suficientemente alta dentro do parênquima do SNC para mitigar os níveis neurotóxicos da produção de ROS. Entretanto, esses dados promissores não puderam ser reproduzidos em outro estudo usando a mesma estirpe mutante de mouse .

Alzheimer Disease (AD). A doença de Alzheimer é uma desordem neurológica progressiva associada ao envelhecimento que leva à demência irreversível. As marcas neuropatológicas da DA são placas senis de agregados amilóides e fibrilares amilóides e emaranhados intraneuronais de proteína tau dentro do córtex cerebral. Foram encontradas células de microglia ativadas agrupadas em torno de placas senis produzindo agentes neurotóxicos como ROS, NO, e TNF-α. A ativação da microglia Nox2 por amilóide oligomérico e/ou fibrilar-β e expressão da Nox2 ativada no cérebro de Alzheimer foram relatadas.

Lull et al. testaram a apocinina em uma dose oral diária de 10 mg/kg através da água potável em um modelo de rato transgênico hAPP de AD . Observaram em camundongos tratados com apocinina uma redução significativa do tamanho da placa dentro do córtex e hipocampo e uma redução do número de microglia no córtex, mas não no hipocampo. No entanto, uma característica comportamental da DA observada neste modelo de rato, ou seja, o desempenho no teste de natação em labirinto aquático Morris, que testa a memória espacial organizada no hipocampo, não foi nitidamente melhorada pelo tratamento. O efeito clínico limitado da apocinina no modelo pode ser devido à ausência de neuroinflamação clara, enquanto que esta é mais proeminente em pacientes com DA, e devido ao fato da formação da placa não prever necessariamente o declínio cognitivo.

Doença de Parkinson (DP). A marca patológica da DP é uma degeneração progressiva dos neurônios produtores de dopamina na substantia nigra (SN), uma estrutura pigmentada localizada na parte inferior do cérebro médio. Através da liberação de dopamina, o SN tem um papel central na coordenação de várias funções neurológicas, incluindo a recompensa, a dependência e o movimento. Esta última função é particularmente perturbada na DP. Para compensar a perda de dopamina, é dado um precursor metabolicamente estável da dopamina (L-DOPA), que num número substancial de pacientes causa movimentos involuntários típicos, conhecidos como síndrome hipercinética. Enquanto na grande maioria dos pacientes (esporádicos) com DP a causa da doença não é conhecida, em uma pequena fração foi encontrada uma causa genética, a saber, mutações em vários genes, incluindo alfa-sinucleína, parkin, quinase repetida rica em leucina 2, quinase putativa 1 induzida por PTEN, e ATP13A2 . A observação de que os usuários de heroína contaminada com MPTP desenvolveram sintomas de DP permitiu a geração de um modelo de DP animal clinicamente relevante. Após a conversão de MPTP em MPP+ por monoamina oxidase B em astrocitos, a MPP+ é concentrada em células dopaminérgicas através da captação através do transportador específico de dopamina, onde bloqueia o complexo I da cadeia respiratória mitocondrial. O stress redox resultante causa, entre outras causas, a desregulação do Ca2+ celular, levando à morte celular. Assim como na ELA e AD, a neurodegeneração na DP está associada à ativação da microglia Nox2, que se acredita contribuir significativamente para o processo patogênico .

Utilizando um sistema in vitro, Gao et al. demonstraram que a ROS gerada pela microglia Nox2 aumenta a sensibilidade dos neurônios dopaminérgicos à MPP+ . Um efeito benéfico da apocinina sobre os efeitos neurotóxicos mediados pela microglia foi demonstrado em um modelo de PD .

6. O Efeito da Apocinina em um Modelo de Doença de Primata Não-Humana Parkinson

Injeção repetitiva de uma baixa dose de MPTP em micoses comuns, um primata neotropical de corpo pequeno, provoca uma doença neurológica que, ao nível da apresentação clínica e neuropatológica, se aproxima muito da PD . Utilizamos este modelo de MPTP em 5 gêmeos de marmotas para testar se a apocinina oral também é eficaz em uma espécie superior. Para a administração oral, a apocinina foi dissolvida em goma arábica; a um irmão de cada gémeo foi dada apocinina contendo goma e ao outro foi dada apenas a goma. O tratamento com apocinina (100 mg/kg, TID) foi iniciado uma semana antes da indução da DP com MPTP (1 mg/kg, via injecção subcutânea durante 8 dias). A apocinina limitou a típica perda de peso corporal associada com a síndrome de Parkinson. Também a função motora nos macacos tratados com apocinina foi melhorada, indicando uma eficácia anti-Parkinson da apocinina. Além disso, o número de neurônios dopaminérgicos sobreviventes foi aumentado pela apocinina, indicando uma eficácia neuroprotectora. Notavelmente, a apocinina tem uma estrutura molecular semelhante à do ácido homovanílico (HVA), um metabolito da dopamina. Uma explicação da eficácia protectora da apocinina na DP pode também estar relacionada com a compensação do nível reduzido do o-metoxica-catecol HVA natural disponível.

7. Perspectiva para o Tratamento de Pacientes Humanos

A apocinina é um pró-fármaco oral potencialmente atractivo devido à sua baixa toxicidade geral e ao facto da sua acção antioxidante específica ser desencadeada após activação metabólica por células fagocitárias libertadoras de MPO. Os dados de segurança da apocinina são escassos, mas os disponíveis mostram baixa toxicidade e alta estabilidade (parcialmente revistos em ). O LD50 após a dosagem oral em ratos foi estimado em 9 g/kg. Em ratos cerca de 80% da apocinina injetada intraperitonealmente a 120 mg/kg foi recuperada de forma inalterada em uma amostra de urina coletada 20 horas depois. Uma dose intravenosa de 420 mg/kg de apocinina em camundongos causou sinais mínimos de toxicidade .

Ao nosso conhecimento, a apocinina não foi testada em pacientes com doenças neurodegenerativas humanas. Entretanto, Peters et al. avaliaram o potencial terapêutico da apocinina inalada na hiper-responsividade brônquica induzida pelo ozônio à metacolina em pacientes asmáticos como um modelo de doença inflamatória pulmonar. Os autores puderam excluir a remoção de ozônio pela apocinina e concluíram que o efeito estava mitigando a produção de ROS por PMNs e eosinófilos que se infiltraram no pulmão após a exposição ao ozônio.

Os estudos em camundongos discutidos nesta revisão mostram que baixas doses de apocinina administrada por via oral chegam ao parênquima do SNC em concentração suficiente para inibir a ruptura oxidativa da microglia e inibir a neurodegeneração. Considerando a toxicidade sistêmica muito baixa e o modo de ação altamente específico da apocinina, seria uma perspectiva atraente testar o valor terapêutico na doença neurodegenerativa humana.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.

Conhecimento

Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Henk van Westbroek (BPRC) pela preparação da obra de arte.