Auxotrofia
GenéticaEditar
Em genética, diz-se que uma estirpe é auxotrófica se ela carrega uma mutação que a torna incapaz de sintetizar um composto essencial. Por exemplo, um mutante de levedura com um gene da via de síntese uracil inativado é um auxotrofio uracil (por exemplo, se o gene da levedura Orotidina 5′-fosfato descarboxilase está inativado, a cepa resultante é um auxotrofio uracil). Tal estirpe é incapaz de sintetizar o uracil e só será capaz de crescer se o uracil puder ser retirado do ambiente. Isto é o oposto de um protótipo de uracil, ou neste caso uma estirpe do tipo selvagem, que ainda pode crescer na ausência do uracil. Os marcadores genéticos auxotróficos são frequentemente usados na genética molecular; eles foram famosos no trabalho premiado com o Nobel de Beadle e Tatum sobre a hipótese de um gene – uma enzima, conectando mutações de genes a mutações de proteínas. Isto permite o mapeamento das vias biossintéticas ou bioquímicas que podem ajudar a determinar que enzimas ou enzimas são mutantes e disfuncionais nas cepas de bactérias auxotróficas em estudo.
Pesquisadores têm usado cepas de E. coli auxotrophic para aminoácidos específicos para introduzir análogos não naturais de aminoácidos em proteínas. Por exemplo, células auxotróficas para o aminoácido fenilalanina podem ser cultivadas em meios suplementados com um análogo como a para-azido fenilalanina.
Muitos seres vivos, incluindo humanos, são auxotróficos para grandes classes de compostos necessários para o crescimento e devem obter estes compostos através da dieta (ver vitamina, nutriente essencial, aminoácido essencial, ácido gordo essencial).
O complexo padrão de evolução da auxotrofia vitamínica através da árvore eucariótica da vida está intimamente ligado com a interdependência entre organismos.
O teste de mutagenicidade (ou teste de Ames)Editar
O teste de Salmonella Mutagenesis (teste Ames) usa múltiplas cepas de Salmonella typhimurium que são auxotroficas à histidina para testar se uma determinada substância química pode causar mutações, observando sua propriedade auxotrofica em resposta a um composto químico adicionado. A mutação que uma substância química ou composto causa é medida aplicando-a às bactérias numa placa contendo histidina e depois movendo as bactérias para uma nova placa sem histidina suficiente para o crescimento contínuo. Se a substância não mude o genoma da bactéria de auxotrofio para histidina de volta para prototrofio para histidina, então a bactéria não mostraria crescimento na nova placa. Assim, ao comparar a proporção da bactéria na nova placa com a placa antiga e a mesma proporção para o grupo de controle, é possível quantificar a mutagenicidade de uma substância, ou melhor, a probabilidade de ela causar mutações no DNA. Um produto químico é considerado positivo para o teste de Ames se causar mutações aumentando a taxa de reversão observada e negativo se se apresentar semelhante ao grupo controle. Há um número normal, mas pequeno, de colônias reversíveis esperadas quando uma bactéria auxotrófica é plaqueada em um meio sem o metabólito que ela precisa, porque ela poderia sofrer mutação de volta à prototrofia. As chances de isso acontecer são baixas e, portanto, causam a formação de colônias muito pequenas. Se uma substância mutagênica for adicionada, no entanto, o número de revertentes seria visivelmente maior do que sem a substância mutagênica. O teste Ames, basicamente, é considerado positivo se uma substância aumenta a chance de mutação no DNA da bactéria o suficiente para causar uma diferença quantificável nos revertentes da placa mutagênica e da placa do grupo de controle. O teste Ames negativo significa que o possível DID mutagênico não causa aumento nos revertentes e o teste Ames positivo significa que o possível DID mutagênico aumenta a chance de mutação. Esses efeitos mutagênicos sobre bactérias são pesquisados como um possível indicador dos mesmos efeitos sobre organismos maiores, como humanos. Sugere-se que se uma mutação pode surgir no DNA bacteriano sob a presença de um mutagênico, então o mesmo efeito ocorreria para organismos maiores causadores de câncer. Um resultado negativo do teste Ames poderia sugerir que a substância não é um mutagénico e não causaria a formação de tumores em organismos vivos. No entanto, apenas alguns dos produtos químicos positivos resultantes do teste Ames foram considerados insignificantes quando testados em organismos maiores, mas o teste Ames positivo para bactérias ainda não pôde ser conclusivamente ligado à expressão de câncer em organismos maiores. Embora possa ser um possível determinante de tumores para organismos vivos, humanos, animais, etc., mais estudos devem ser concluídos para se chegar a uma conclusão.
Métodos baseados na auxotrofia para incorporar aminoácidos não naturais em proteínas e proteomasEditar
Um grande número de aminoácidos não naturais, que são semelhantes aos seus homólogos canônicos em forma, tamanho e propriedades químicas, são introduzidos nas proteínas recombinantes por meio de hospedeiros de expressão auxotrofizantes. Por exemplo, as cepas de Escherichia coli metionina (Met) ou triptofano (Trp) auxotrofio podem ser cultivadas em um meio mínimo definido. Nesta configuração experimental é possível expressar proteínas recombinantes cujos resíduos canônicos de Trp e Met são completamente substituídos por diferentes análogos relacionados ao meio-suplementado. Esta metodologia leva a uma nova forma de engenharia de proteínas, que não é realizada pela manipulação do códon a nível do DNA (por exemplo, mutagênese dirigida por oligonucleotídeos), mas por reatribuições do códon a nível de translação de proteínas sob pressão seletiva eficiente. Portanto, o método é referido como incorporação de pressão seletiva (SPI).
Nenhum organismo estudado até agora codifica outros aminoácidos além dos vinte canônicos; dois aminoácidos canônicos adicionais (selenocisteína, pirrolisina) são inseridos nas proteínas por recodificação de sinais de terminação de translação. Esta fronteira pode ser atravessada pela evolução laboratorial adaptativa de cepas microbianas auxotróficas metabolicamente estáveis. Por exemplo, a primeira tentativa claramente bem sucedida de evolução da Escherichia coli que pode sobreviver apenas com o aminoácido não natural tienopirrolil) alanina como único substituto do triptofano foi feita em 2015.