Beta-Ensaio Galactosidase (Um Miller melhor)

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Background

β-A galactosidase é codificada pelo gene lacZ do operon lac em E. coli. É uma proteína grande (120 kDa, 1024 aminoácidos) que forma um tetrâmero. A função da enzima na célula é de dividir a lactose em glicose e galactose para que possam ser usadas como fontes de carbono/energia. O composto sintético o-nitrofenil-β-D-galactoside (ONPG) também é reconhecido como um substrato e clivado para produzir galactose e o-nitrofenol que tem uma cor amarela. Quando o ONPG está em excesso sobre a enzima em uma reação, a produção de o-nitrofenol por unidade de tempo é proporcional à concentração de β-Galactosidase; assim, a produção de cor amarela pode ser usada para determinar a concentração enzimática.

Então, por que nos importamos? Normalmente, os experimentos são projetados para que a concentração da β-Galactosidase na célula seja uma leitura para algum aspecto de um sistema em estudo. Por exemplo, um investigador pode fundir um promotor ao gene lacZ e usar o nível β-Gal como uma leitura para a atividade promotora sob várias condições. Em 1972, Jeffrey Miller publicou “Experiments in Molecular Genetics”, que continha um protocolo para determinar a quantidade de β-Gal com ONPG. Devido a isso, os ensaios ONPG/β-Gal são referidos como ensaios “Miller”, e uma quantidade padronizada de β-Gal é uma “Unidade Miller”.

1 Unidade Miller = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

where:

Abs420 é a absorvância do o-nitrofenol amarelo,

Abs550 é a dispersão dos detritos celulares, que, quando multiplicada por 1.75 aproxima-se da dispersão observada a 420nm,

t = tempo de reação em minutos,

v = volume de cultura testada em mililitros,

Abs600† reflete a densidade celular.

†Note que este valor é diferente para cada espectrofotómetro utilizado e deve ser calibrado por diluições de placas de culturas de Abs600 conhecidas para determinar as unidades formadoras de colónias por Abs600.

No seu livro, Dr. Miller explica que esta fórmula produz aproximadamente 1 unidade Miller para E. coli não induzida (baixa produção β-Gal) e aproximadamente 1000 unidades para uma cultura totalmente induzida (cultivada com lactose ou IPTG).

Na minha experiência, culturas de MG1655 induzidas com 1 mM IPTG em fase logarítmica têm 1500-1800 unidades Miller. A razão para a diferença não é conhecida, mas suspeito que ela deriva de diferenças na densidade de células Abs600 entre o espectrofotômetro do Dr. Miller e o que eu uso e o fato de eu fazer os meus ensaios Miller a 30 °C (por conveniência) enquanto o Dr. Miller fez os seus ensaios a 28 °C. Eu fiz fusões promotoras que geram ~40.000 unidades Miller; contudo, como será discutido abaixo, isto é muito alto para o ensaio e por isso o protocolo foi alterado para baixar este valor.

Protocolo

O protocolo que eu uso é derivado de um papel de Zhang e Bremer (JBC 270, 1995, Texto completo grátis!) no qual o protocolo Miller original foi muito simplificado para permitir que mais amostras fossem medidas com menos manipulação.

Em suma, o protocolo consiste em medir a densidade celular de uma cultura de bactérias (Abs600), depois remover uma alíquota das células da cubeta e misturá-las com uma solução de “permeabilização” que contém detergente que perturba as membranas celulares (mas deixa o β-Gal intacto). Isto mata as células e impede a sua tradução. Após a incubação, adiciona-se uma solução de “substrato” de ONPG e deixa-se desenvolver a cor amarela. Uma solução “stop” é então adicionada e a absorvância do o-nitrofenol é medida.

1. Culturas de crescimento sob quaisquer condições que se pretenda testar.
2. Culturas de crescimento, pré-medida 80 μL alíquotas de solução de permeabilização em 1.5 mL de tubos de microfuga e feche-os.
3. Medida Abs600 e GRAVE IT!
4. Remova uma alíquota de 20 μL da cultura e adicione-a ao 80 μL da solução de permeabilização.

A amostra está agora estável durante várias horas. Isto permite realizar experimentos de tempo.

1. Após a última amostra ser colhida, mova as amostras e a solução de substrato para a sala quente a 30 °C durante 20-30 minutos.
2. Adicionar 600 μL de solução de substrato a cada tubo e NOTE O TEMPO DE ADITION.
3. Após o desenvolvimento de cor suficiente, adicione 700 μL de solução Stop, misture bem e NOTE O TEMPO DE STOP.
4. Após parar a última amostra (alguns podem demorar mais que outros, mas geralmente são feitos em 30-90 minutos), transfira os tubos para uma microcubadora e gire por 5-10 minutos na velocidade máxima.
5. Retirar cuidadosamente os tubos da centrífuga e transferir a solução do TOP dos tubos para sua(s) cubeta(s). Você está tentando evitar ter material particulado na cubeta para que a dispersão não influencie a leitura.
6. Record Abs420. Isto deve ser menor que 1 e maior que 0.05. Se estiver um pouco fora deste intervalo, não se preocupe.

Calcular Unidades Miller como:

\displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \text{ of culture sampled})*(\text{volume {volume } )*(\text{reaction time}))} }

Comentários sobre o ensaio

Reshma 11:28, 15 de Outubro de 2007 (CDT): Miller recomenda uma cultura com OD600 = 0,28 a 0,70. No entanto, ele afirma que também podem ser utilizadas culturas nocturnas, mas que células em crescimento exponencial dão ensaios mais precisos .

Quando é feita a reacção? Eu nunca encontrei uma boa resposta para isto na literatura. Se eu deixei uma reação chegar ao fim, eu medi um Abs420 de ~2-3. Claro, isto está fora da faixa confiável do espectrofotômetro, mas dá uma indicação de quão longe a reação pode ir. Obtive dados reprodutíveis quando a cor amarela era apenas detectável antes de adicionar a solução de paragem até aproximadamente a cor do caldo de LB antes de parar. Lembre-se, você precisa do substrato para saturar a enzima durante o curso da reação, então não os deixe ir muito longe. Eu faço rotineiramente três medições separadas para cada cultura e faço a média delas.

• Reshma 11:28, 15 de outubro de 2007 (CDT): Miller recomenda que a leitura de OD420nm seja idealmente de 0,6-0,9 .

Frequentemente, as pessoas usam cuvetes plásticas descartáveis para medir a turbidez da cultura e o o-nitropenol amarelo. É minha experiência que as cuvetees descartáveis têm ótica HORRÍVEL: sim, elas são claras, mas o caminho da luz é pateticamente distorcido (basta olhar através de uma para um objeto distante). Isto não é um grande problema se a mesma cuvete é usada para o branco e a amostra e é orientada da mesma forma no espectrofotômetro. O problema surge quando muitas amostras diferentes são medidas em diferentes cuvetes. Os valores podem variar GRATUITAMENTE mesmo para a mesma cultura medida em diferentes cuvetes. Eu recomendo o uso de uma cubeta de vidro ou quartzo de alta qualidade, ou a medição das amostras em um leitor de placas usando placas de fundo plano com 96 poços. Descobri que o meu erro na pipetagem de 150 μL de cultura para medições de Abs600 foi WAY menos do que a utilização de cuvetes descartáveis. É claro que a turbidez medida deve ser calibrada para células/mL como com uma cubeta de 1cm.

Ao girar as amostras e remover cuidadosamente uma amostra do sobrenadante, você evita ter que medir a dispersão a 550nm e adivinhar o que seria a 420nm.

Se a sua reação tiver muito β-Gal, o tubo ficará amarelo em poucos minutos (ou até segundos). Isto é muito rápido. Uma das maiores contribuições para o erro será sua estimativa do tempo de reação. Ao ter as condições de reacção definidas de modo a que leve cerca de uma hora, os erros de tempo tornam-se insignificantes. Se você precisar retardar a reação, você pode usar menos células e aumentar a quantidade de buffer de permeabilização para que o volume ainda seja de 100 μL. Alternativamente, pode reestruturar o site de ligação da sua construção β-Gal para o enfraquecer. Descobri que se as minhas células estavam a fazer 40.000 unidades Miller de β-Gal, elas estavam muito doentes com o stress da tradução. Foi melhor neste caso enfraquecer a tradução do β-Gal mRNA.

• Faço estas reacções como eu faço cinética enzimática. Inicio as amostras com 10 segundos de intervalo (com o tempo contando para cima) para que seja possível obter tempos de reacção precisos, mesmo que apenas deixe as suas reacções passar por alguns minutos. Obtenho resultados muito reprodutíveis com tempos de reacção de 1,5-30 minutos. Uma vez que você tenha uma sensação de quanto tempo suas reações precisarão, é fácil agrupar amostras que precisarão do mesmo tempo de reação. Fazendo cada amostra em triplicado, você terá alguma confiança de que seu tempo é reproduzível.–Kathleen 16:43, 14 Dezembro 2005 (EST)

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Aqui está um exemplo de alguns dados reais que eu obtive usando este ensaio. Foi uma experiência de curso de tempo. A cada vez, eu removi 1 mL de cada uma das minhas culturas, medi o OD600, tomei três alíquotas de 20 µL diretamente da cubeta e adicionei cada uma a 80 µL de solução de permeabilização. Realizei o ensaio exactamente como descrito acima, e todas as amostras foram mantidas à temperatura ambiente até que o curso temporal estivesse terminado. Os OD600 para estas culturas variaram de 0,4 a 4 (nas minhas especificações) ao longo deste experimento e os tempos de reação para os ensaios de β-Gal variaram de 2-25 min. Os três ensaios individuais β-Gal para cada ponto de tempo de cada cultura (símbolos vermelhos ou pretos) são plotados no gráfico para ilustrar a reprodutibilidade do ensaio dentro de cada experimento.–Kathleen

Recipes

Permeabilization Solution

Precisa 80 μL por amostra.

100 mM de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)

(O protocolo Zhang tem 200 mM de fosfato de sódio. Eu nunca consegui resolver isto com os outros componentes, não importa o que eu tentasse, então eu o apoiei para 100 mM. Usei até 50 mM sem alteração detectável.)

20 mM KCl

2 mM MgSO4

0.8 mg/mL CTAB (brometo de hexadeciltrimetilamónio)

0.4 mg/mL deoxicolato de sódio

5.4 μL/mL beta-mercaptoetanol

Solução de substrato

Precisa de 600 μL por amostra.

60 mM Na2HPO4

40 mM NaH2PO4

1 mg/mL o-nitrofenil-β-D-Galactoside (ONPG)

2.7 μg/mL μL-mercaptoetanol

(O protocolo Zhang também possui 20 μg/mL CTAB e 10 μg/mL deoxicolato. Eu deixo estes de fora, descobrindo que ainda há muito da solução de permeabilização e, se ainda não estão mortos, não vão estar.)

Stop solution

Você precisa de 700 μL por amostra.

1 M Carbonato de Sódio (Na2CO3)

O pH elevado da solução stop desnaturaliza o β-Gal e aproximadamente duplica a cor amarela da reacção.