BiomedicalReports

Introdução

Carcoma hepatocelular (CHC) é um primarimalinhamento dos hepatócitos, sendo responsável por 80% de todos os seres vivos primários. A nível mundial, o CHC está classificado como a quarta causa principal de mortes relacionadas com o cancro (1). Os pacientes com doenças hepáticas crónicas associadas ao vírus da hepatite B ou infecções do vírus da hepatite C desenvolvem frequentemente CHC(2). Houve uma melhoria das técnicas cirúrgicas e o desenvolvimento de diversas modalidades de tratamento não cirúrgico; no entanto, a melhoria para o extremamente pobre prognóstico dos pacientes com CHC continua limitada (3).

A investigação exaustiva da apoptose, também conhecida como morte celular por asprogramação, nas últimas décadas destacou este processo como um método adequado para a terapia do câncer (4,5). No entanto, numerosos medicamentos com efeitos apoptóticos são actualmente limitados para a terapia do cancro devido aos efeitos secundários. Portanto, a identificação de agentes terapêuticos inovadores e confiáveis que possam induzir eficazmente a apoptose de células cancerígenas no tratamento de pacientes com CHC é importante.

Recentemente, a medicina tradicional chinesa tem um papel animador no tratamento de tumores malignos, devido aos seus efeitos significativamente melhorados e aos efeitos colaterais mais baixos (6). Gecko, um dos populares medicamentos tradicionais chineses, tem sido usado como droga bruta para tratar os tumores malignos na prática clínica (7-9). Os peptídeos brutos de Gecko e o extrato de etanol de gecko podem induzir apoptose em células HumanHCC e exercer atividade antitumoral em ratos ascetas portadoras de H22, o que foi demonstrado em nossos estudos anteriores (10,11). O objetivo do presente estudo foi examinar o efeito apoptótico e o mecanismo subjacente da mistura de peptídeos de osga (GPM) nas linhas de células do livercarcinoma HepG2 humano in vitro.

Materiais e métodos

Materiais e reagentes médicos

Gecko japonicus foi comprado da BozhouYonggang Medicinal Herbs Factory Co., Ltd. (Anhui, China). A linha de células humanas HCC HepG2 foi apresentada pelo Medical Science ResearchInstitute of Henan (Henan, China).

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)e Hoechst 33258 foram comprados da Sigma (St. Louis, MΟ, EUA). O kit Caspase Activity Assay foi comprado do BeyotimeInstitute of Biotechnology (Beijing, China). O fator indutor da apoptose (AIF) foi comprado da BosterInc. (Wuhan, Hubei, China), e o β-actin antibody foi comprado da Proteintech (Wuhan, Hubei, China). O anticorpo primário do citocromo c (Cyt c) e o anticorpo secundário do citocromo c (Cyt c) foram comprados da Zhongshan GoldenBridge Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China).

O leitor de microplaca foi o produto da BioTekInstruments, Inc. (Beijing, China).

O leitor de microplaca foi o produto da BioTekInstruments, Inc. (Winooski, VT, EUA). A fluorescência BX41 e microscópios invertidos foram o produto da Olympus (Tokyo, Japão).

Preparação de GPM

Pó de Gecko (100 g) foram misturados com 400 mldouble-distilled água e feitos em um homogeneizado. Após a centrifugação a 5.600 × g durante 5 min, a precipitação foi coletada e embebida em 400 ml de solução de etanol a 55%. O sobrenadante foi obtido após centrifugação a 5.600 × g por 5 min, e foi evaporado sob pressão reduzida a 55°C. Posteriormente, os pós amarelos foram coletados após liofilização do líquido residual. A cromatografia de filtração em gel (SephadexG-25) foi utilizada para purificar os pós amarelos e, finalmente, o GPM foi coletado.

Cultura de células e observação morfológica

Células HepG2 foram cultivadas no meio de Dulbecco modificadoEagle suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mlpenicilina e estreptomicina a 37°C em uma incubadora umidificada de 5%CO2. O meio de cultura foi substituído a cada 2 dias e as células na fase de crescimento logarítmico foram utilizadas para os experimentos seguintes. As células HepG2 (3,0×104 células/ml) foram incubadas com várias concentrações de GPM durante 24h. As células foram observadas e as imagens capturadas por um microscópio de contraste de fase invertido para detectar as alterações morfológicas.

ensaio MTT

Células HepG2 foram semeadas em uma placa de 96 poços com densidade de 6,0×103 células/poço. Após incubação durante 20, 44 e 68 h, respectivamente, foram adicionados 20 µl de reagente MTT (5 mg/l) por poço e incubados durante mais 4h. O sobrenadante foi substituído por 200 µl de dimetil sulfóxido e a absorvância (A) a 490 nm foi medida com um leitor ELX800 UniversalMicroplate. A taxa de inibição da proliferação celular (RI) foi como se segue: IR = (1-AGPM/Acontrole) ×100%.

Hoechst 33258 coloração

Cultura nocturna numa placa de 6 poços, as célulasHepG2 foram tratadas com várias concentrações de GPM (0,0,06 ou 0.08 mg/ml) e 0,003 mg/ml 5-Fu em meio de cultura fresco a37°C por 24 h. As células foram lavadas duas vezes com tampão fosfato (PBS) e coradas com solução de coloração Hoechst 33258 (10µg/ml). Após 15 minutos de incubação no escuro, as células foram lavadas duas vezes com PBS fria e examinadas com o fluorescencemicroscópio.

Análise da atividade da caspase-6402>

Determinação da atividade da caspase-3 e caspase-9 foi realizada com o kit Caspase Activity Assay, seguindo o protocolo do fabricante. Após exposição a várias concentrações de GPM (0, 0,06 ou 0,08 mg/ml) e 0,003 mg/ml 5-Fu durante 24 h, as células foram colhidas e ressuspendidas em tampão de lise. Subsequentemente, as células foram incubadas em tampão de lise durante 20 min e foram submetidas a uma lavagem de 16.000 × g a 4°C durante 3 min. Os sobrenadantes foram coletados e os níveis de proteína foram determinados pelo método de Bradfordmethod, e as atividades de caspase-3 e caspase-9 foram medidas pelo tampão de reação (contendo ditiotreitol) e pelos substratopeptídeos de caspase Ac-DEVD-pNA e Ac-LEHD-pNA, respectivamente. Os valores obtidos em densidade óptica a 405 nm foram expressos como:AGPM/AControl.

Western blot analysis

HepG2 cells were treated with GPM (0, 0.06 or 0.08mg/ml) and 0.003 mg/ml 5-Fu for 24 h, respectivamente. Resumidamente, as células foram tratadas com tampão de lise sobre gelo durante 30 min, e foram centrifugadas a 13.000 × g durante 30 min a 4°C. A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford. As proteínas foram separadas por 12% SDS-PAGE e transferidas para a membrana PVDF. A membrana PVDF foi bloqueada com 5% de leite seco sem gordura em PBS por 1h a 37°C, lavada 3 vezes com soro fisiológico com tampão Tris contendo 0,1%Tween-20 (TBST) por 15 min, e foi seguida de incubação com os anticorpos primários: Caspase-3 (cat. no. sc-7148; 1:200, policlonalrabbit anti-humano), caspase-9 (cat. no. sc-8355; 1:200, policlonalrabbit anti-humano), Cyt c (cat. no. sc-13156; 1:500,monoclonal rato anti-humano), AIF (cat. no. PB0388; 1:200,policlonal coelho anti-humano) e β-actin (cat. no. 66009-1-Ig;1:5,000, monoclonal rato anti-humano) durante a noite a 4°C.Posteriormente, as amostras foram lavadas com TBST durante 30 min, e a membrana foi incubada com os correspondentes anticorpos secundários durante 1 h. A quimioluminescência foi detectada com ECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology).

Análise estatística

Os dados experimentais são representados como média ± desvio padrão. As diferenças entre os grupos foram analisadas com análise de variância unidirecional usando o SPSS 19.0system (IBM Corp., Armonk, NY, EUA). P<0,05 foi considerado para indicar uma diferença estatisticamente significante.

Resultados

GPM inibe a proliferação de células HepG2

O efeito do GPM no crescimento de células HepG2 foi avaliado pelo ensaio MTT. Os resultados mostraram que o GPM inibiu significativamente a proliferação de células HepG2 de forma dose- e tempo-dependente (Fig. 1). Após tratamento com GPM por 24, 48 ou 72 h, os valores deIC50 foram de 0,154, 0,133 e 0,051 mg/ml, respectivamente. As células tratadas com GPM apresentaram morfologia arredondada, retração e perda de fixação (Fig. 2).

Efeitos do GPM na morfologia nuclear

A morfologia apoptótica das células foi identificada pela coloração Hoechst 33258. Como mostrado na Fig.3, alterações morfológicas nas características apoptóticas, tais como condensação antinuclear, condensação cromossômica e corpos granularapoptóticos em células tratadas com GPM também foram observadas por microscopia de fluorescência.

Efeitos do GPM na caspaseactividade

Como os iniciadores e executores da morte celular, as proteases cisteína têm um papel importante no processo apoptótico(12). Como mostrado na Fig. 4, o tratamento com GPM causou um aumento significativo na atividade caspase-3 e caspase-9, sugerindo um efeito apoptótico do GPM em células HepG2.

Efeitos do GPM nos níveis de expressão das proteínas apoptóticas

Como mostrado na Fig. 5,o western blotting demonstrou que a liberação de Cyt c eAIF das mitocôndrias para o citosol aumentou, enquanto os níveis de expressão da caspase-3 e da caspase-9 não foram preestabelecidos pelo tratamento de GPM de forma dose-dependente. As alterações nas proteinas foram significativamente diferentes quando comparadas ao grupo controle (Fig. 6)(P<0,05).

Discussão

Nos últimos decênios, a incidência de câncer aumentou acentuadamente, o que causa sérios danos à saúde humana(13). Embora as estratégias terapêuticas contemporâneas tenham demonstrado evidente capacidade anticancerígena, os efeitos colaterais graves permanecem inevitáveis. A busca de novos agentes antitumorais mais eficazes, porém menos tóxicos, tem atraído atenção crescente (14). A extração de peptídeos de medicamentos naturais para terapia do câncer tem sido amplamente relatada em todo o mundo e é promissora no tratamento do câncer. Os peptídeos podem ter um papel de várias formas, como inibir a proliferação de tumores, parar o ciclo celular, suprimir a angiogênese tumoral e induzir a apoptose (15). A Gecko tem sido amplamente utilizada na medicina chinesa intradicional há centenas de anos. Em nossos estudos anteriores, os peptídeos brutos da osga mostraram uma eficaz antitumoractividade em ratos portadores de H22 e na linha celular HepG2 (16,17). Portanto, o objetivo do presente estudo foi de revelar o mecanismo molecular subjacente pelo qual o GPM induz aapoptose na linha de células HepG2.

No presente estudo, o ensaio MTT revelou que o GPM poderia inibir o crescimento de células HepG2 de uma maneira dose- e dependente do tempo. Outros experimentos demonstraram que esta inibição foi devida ao tratamento com GPM, que induziu a morte de células dose-dependente com alterações morfológicas típicas. Estes dados sugerem que o GPM pode ser um agente potencialmente eficaz no tratamento do câncer. Utilizando a coloração Hoechst 33258, foi demonstrado que a morte celular induzida pelo GPM nas células HepG2, que pertence à apoptose, para os níveis de expressão da caspase-3 e caspase-9 foi aumentada após o tratamento com GPM. A análise de Western blotting também mostrou que o GPM poderia estimular a liberação de Cyt c e AIF damitocôndria para o citosol, sugerindo que a apoptose induzida por GPM nas células HepG2 é mediada pela via apoptótica mitocondrial.

Apoptose é o principal mecanismo de controle pelo qual as células morrem sob inúmeras condições, tais como a reparação incorreta dos danos ao DNA (18). O processo celular auto-destrutivo é crítico para o desenvolvimento orgânico, remodelação dos tecidos, regulação imunológica e condições de várias doenças (19). Numerosos agentes antitumorais exercem os seus efeitos terapêuticos induzindo aapoptose (20-24). A mitocôndria tem um papel essencial na regulação da apoptose celular, e existem certas proteínas que estão intimamente associadas com a apoptose celular na inter-membrana (25).

A ultraestrutura mitocondrial é normal durante a apoptose celular, mas sua função mudou significativamente.A disfunção mitocondrial induz a abertura dos poros de transição da permeabilidade mitocondrial e libera proteínas mitocondrialapoptogênicas, como AIF (26) e Cyt c (27). Normalmente as FIA e as cproteínas Cyt estão localizadas no espaço intermembrana das mitocôndrias, enquanto que sob a acção de várias FIA, são libertadas dasmitocôndrias para o citoplasma. A AIF é finalmente transferida para o dutoplasma, provocando as alterações características da apoptose. A AIF foi a primeira proteína a ser descoberta que mediou a morte celular independente da caspa (28). A AIF é libertada no citosol e induz a apoptose caspase-dependente, levando à activação de caspases e apoptose (29,30). A AIFc poderia aumentar os sinais apoptóticos promovendo a libertação mitocondrial de Cyt c. Embora a apoptose induzida pela AIF não seja dependente da caspase, existe uma acção cruzada, uma sinergia e mesmo um antagonismo entre a AIF, a caspase e a Cyt c. Devido a vários sinais de morte e tipos de células, a regulação da apoptose celular é de facto realizada através de várias interacções e de toda a rede de sinais, que requerem um estudo mais aprofundado.

Caspase, uma família de proteases cisteína, é uma secção anintegral da via apoptótica. A indução da apoptose está associada à ativação da caspase (31). A caspase-3 está a jusante da cellapoptose, e a caspase-9 é a caspase apical na via apocondrial iniciada pelamitocôndria (32). A ativação da caspase-3 está correlacionada com a ativação da caspase-9 (33). A liberação de Cyt c desencadeia a ativação da caspase-9 através da formação do apoptossoma. A ativação subseqüente da caspase-9 do iniciador causa a clivagem da caspase-3, que posteriormente ativa o DNase e causa a fragmentação do DNA no núcleo (34). Em resumo, a caspase-3 é uma caspase executora que pode ser ativada pela via mitocondrial seguinte envolvendo a ativação da caspase-9 devido à liberação de Cyt c para o citosol(35), finalmente causando morte celular programada.

Em conclusão, o GPM possivelmente induziu morte apoptocélula nas células HepG2 pela ativação da via apoptocélula mitocondrial. Estes resultados demonstram que o GPM pode ser um agente potencialmente terapêutico para o tratamento do CHC.

Avalores

O presente estudo foi apoiado por um subsídio doKey Programs for Science and Technology Development of HenanProvince (no. 142102310031).

Glossary

A abreviaturas

A abreviaturas:

GPM	Mistura de peptídeos gecko
Cyt c	cytochrome c

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