Brainbow
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As técnicas de Brainbow dependem da recombinação Cre-Lox, na qual a proteína Cre recombinase conduz a inversão ou excisão do DNA entre locais loxP. O método Brainbow original inclui tanto Brainbow-1 como Brainbow-2, que utilizam diferentes formas de recombinação cre/lox. Brainbow-3, uma versão modificada do Brainbow-1, foi desenvolvida em 2013. Para todos os subtipos Brainbow, a expressão de um determinado XFP é um evento estocástico, ou aleatório.
Brainbow-1 usa construções de DNA com diferentes genes de proteínas fluorescentes (XFPs) separadas por formas mutantes e canônicas de loxP. Isto cria um conjunto de possibilidades de excisão mutuamente exclusivas, uma vez que a recombinação mediada por cremes ocorre apenas entre locais idênticos de loxP. Após a recombinação ocorrer, a proteína fluorescente que é deixada diretamente após o promotor é expressa de forma única. Assim, uma construção com quatro XFPs separados por três locais diferentes de loxP, três eventos de excisão e a construção original pode produzir quatro proteínas fluorescentes diferentes.
Brainbow-2 usa a excisão e inversão de Cre Cre Cre Creme para permitir múltiplas possibilidades de expressão em uma dada construção. Em um segmento de DNA com dois XFPs de orientação oposta, Cre irá induzir um evento de inversão aleatório que deixa uma proteína fluorescente na orientação adequada para a expressão. Se duas dessas sequências inversíveis estiverem alinhadas, três eventos de inversão diferentes são possíveis. Quando eventos de excisão também são considerados, uma das quatro proteínas fluorescentes será expressa para uma determinada combinação de excisões e inversões de Cre.
Brainbow-3 retém o formato Brainbow-1 loxP, mas substitui os genes RFP, YFP e CFP por mOrange2, EGFP, e mKate2. mO2, EGFP e mK2 foram escolhidos tanto porque seus espectros de excitação fluorescente e emissão se sobrepõem minimamente, quanto porque compartilham uma homologia de seqüência mínima, permitindo o desenho de anticorpos seletivos que podem ser usados para detectá-los em protocolos imunohistoquímicos. Brainbow-3 também aborda a questão do preenchimento desigual dos neurônios com XFPs usando derivados farnesilados dos XFPs, que são traficados mais uniformemente para as membranas neuronais.
Brainbow é implementado in vivo através do cruzamento de duas cepas de organismos transgênicos: uma que expressa a proteína Cre e outra que foi transfectada com várias versões de uma construção loxP/XFP. O uso de múltiplas cópias do transgene permite que os XFPs se combinem de uma forma que pode dar uma de aproximadamente 100 cores diferentes. Assim, cada neurônio é rotulado com um matiz diferente baseado em sua expressão combinatória e estocástica de proteínas fluorescentes.
Para elucidar padrões de expressão XFP diferenciais em uma forma visível, as fatias do cérebro são imitadas com microscopia confocal. Quando exposto a um fóton com seu comprimento de onda de excitação particular, cada fluoróforo emite um sinal que é coletado em um canal vermelho, verde ou azul, e a combinação de luz resultante é analisada com um software de análise de dados. A sobreposição de neurônios de cores diferentes permite o desarranjo visual de circuitos neurais complicados.
Brainbow tem sido testado predominantemente em camundongos até hoje; entretanto, a técnica básica descrita acima também foi modificada para uso em estudos mais recentes desde o advento do método original introduzido em 2007.
MiceEdit
O cérebro do rato tem 75.000.000 neurónios e é mais semelhante a um cérebro humano do que a drosófila e outros organismos comumente usados para modelar esta técnica, como o C. elegans. Ratos foram os primeiros organismos em que o método Brainbow de neuroimagem foi empregado com sucesso. Livet et al. (2007) desenvolveram duas versões de ratos Brainbow usando Brainbow-1 e Brainbow-2, que são descritos acima. Ao usar estes métodos para criar um mapa completo e rastrear os axônios de um músculo do mouse, é necessário coletar dezenas de milhares de imagens e compilá-las em pilhas para criar um esquema completo. É então possível traçar cada axônio motor e seus contatos sinápticos para construir um conectivo completo do músculo.
Mais exemplos de neurônios examinados usando a técnica Brainbow em ratos transgênicos estão localizados nos músculos nervosos motores inervantes do ouvido, nos axônios do tronco cerebral e no giro dentado hipocampal.
DrosophilaEdit
A complexidade do cérebro Drosophila, consistindo de cerca de 100.000 neurônios, o torna um excelente candidato para implementar técnicas neurofisiológicas e neurocientíficas como Brainbow. De fato, Stefanie Hampel et al. (2011) combinaram Brainbow em conjunto com ferramentas de direcionamento genético para identificar neurônios individuais dentro do cérebro Drosophila e várias linhagens neuronais. Uma das ferramentas de focalização genética foi um sistema de expressão binária GAL4/UAS que controla a expressão do UAS-Brainbow e tem como alvo a expressão de pequenos grupos de neurônios. A utilização de métodos ‘Flip Out’ aumentou a resolução celular da construção do repórter. A expressão de proteínas fluorescentes, como no Brainbow original, dependia da recombinação de Creme correspondente aos locais de loxo combinados. Hampel et al. (2011) também desenvolveram sua própria variação de Brainbow (dBrainbow), baseada na etiquetagem de anticorpos de epitopos e não de fluorescência endógena. Duas cópias de sua construção produzem seis cores brilhantes e separáveis. Isto, juntamente com simplificações na atribuição de cores, permitiu-lhes observar as trajetórias de cada neurônio em longas distâncias. Especificamente, eles traçaram os neurônios motores desde o lobo antenal até as junções neuromusculares, permitindo-lhes identificar os alvos musculares específicos de cada neurônio.
Ultimamente, esta técnica fornece a habilidade de mapear eficazmente os circuitos neuronais em Drosophila para que os pesquisadores possam descobrir mais informações sobre a estrutura cerebral deste invertebrado e como ele se relaciona com seu comportamento posterior.