deficiência de endonuclease EXO-3 de PA causa atraso no desenvolvimento e organogênese vulvar anormal, Pvl, através da ativação do ponto de verificação iniciado pela glicosilase do DNA em Caenorhabditis elegans

O nível de expressão das endonucleases AP aumenta após o estágio L4

Após eclosão, C. elegans se desenvolvem em adultos através de quatro estágios larvares (L1-L4), cada um pontuado por moldagem da cutícula. Os estádios adultos ainda são subdivididos em dois estágios: o estágio adulto jovem e o estágio adulto grávido. Para se conhecer o papel das endonucleases AP após a embriogênese, medimos a mudança temporal no nível de expressão do mRNA do exo-3 ou apn-1. Às 0, 24 e 48 horas, quando a maioria dos vermes N2 está no estágio ovo, estágio L1 e estágio L4, respectivamente, não foi encontrada diferença no nível de expressão do mRNA tanto para exo-3 quanto para apn-1 (Fig. 1a,b). Às 60 horas, quando a maioria dos vermes N2 está no estágio de adulto jovem, os níveis de expressão exo-3 e apn-1 foram aproximadamente 13 vezes e 2,3 vezes maiores do que aqueles às 0 horas, respectivamente (Fig. 1a,b). O nível de expressão nas 72 horas, quando a maioria dos vermes N2 está no estágio adulto grávido, foi o mesmo nas 60 horas (Fig. 1a,b). Estes resultados sugerem que as endonucleases AP são necessárias após a embriogênese, especialmente após o estágio L4.

Efeitos da deficiência de endonucleases AP no desenvolvimento larvar de vermes em condições normais de cultivo. (a,b) Em cada momento após o nascimento, os vermes N2 foram colhidos, e o RNA total isolado dos vermes foi submetido a análise de PCR em tempo real usando conjuntos de iniciadores específicos para exo-3 (a) e apn-1 (b). Como controlo interno, foi utilizado o Y45F10D.4. Os valores representam a média ± S.E. (n = 3/cada ponto temporal). (c) Esquema experimental. (d-f) Imagens representativas dos vermes em cada fase de desenvolvimento. L4 larvas (d). Adultos jovens (e). Adultos gravidez (f). Setas pretas indicam a posição vulvar. Os estágios de desenvolvimento foram avaliados com base na morfologia vulvar e na incubação dos ovos. (g) Proporção de vermes em cada estágio de desenvolvimento após 3 dias de incubação dos óvulos fertilizados. Os valores indicam o número de vermes em cada estágio de desenvolvimento/o número total de vermes sobreviventes.

Os mutantes exo-3 apresentam atraso no desenvolvimento

Para esclarecer a contribuição das endonucleases AP para o desenvolvimento dos vermes dos estágios L4 até os adultos, os vermes deficientes em uma ou ambas as endonucleases AP (EXO-3 e APN-1) foram incubados em condições normais de criação por 3 dias a partir do estágio de óvulos fertilizados (Fig. 1c). Os estágios de desenvolvimento entre os estágios L4, adulto jovem e adulto grávido foram distinguidos pelo estado de morfologia vulvar e choco dos ovos (Fig. 1d,f). Embora todos os vermes N2 tenham se desenvolvido em adultos grávidos, apenas 14% dos mutantes exo-3 estavam no estágio adulto grávido, 85% estavam no estágio adulto jovem e 1% estava no estágio larval (Fig. 1g), sugerindo que a deficiência de EXO-3 causa a interrupção do desenvolvimento ou atraso no desenvolvimento. Em contraste, todos os mutantes apn-1 tornaram-se adultos grávidos, e os apn-1;exo-3 mutantes estavam quase no mesmo estágio de desenvolvimento que os exo-3 mutantes (Fig. 1g). Doze horas depois, todos os mutantes exo-3 e apn-1;exo-3 atingiram o estágio adulto grávido (dados não mostrados), indicando que a deficiência de EXO-3 não causa a interrupção do desenvolvimento no estágio adulto jovem, apenas o atraso no desenvolvimento. Para investigar com precisão quanto tempo foi o atraso dos mutantes exo-3, medimos o tempo de atingimento do adulto grávido de cada verme a cada duas horas e calculamos a diferença do tempo médio entre N2 (N = 8) e os mutantes exo-3 (N = 16). A diferença foi de 6 horas.

O atraso de desenvolvimento dos mutantes exo-3 é dependente da glicosilase NTH-1

É razoável inferir que o fenótipo de atraso de desenvolvimento dos mutantes exo-3 é causado pelo acúmulo de sites AP ou 3′-bloqueado SSB no DNA, pois estes são substratos para EXO-315. Estas estruturas no DNA podem ser geradas por glicosilases de DNA. Das duas glicosilases de DNA conservadas em C. elegans, a UNG-1 gera locais de AP através da atividade monofuncional da glicosilase do DNA no uracil no DNA, e a NTH-1 produz SSB bloqueada 3′ através da atividade bifuncional da glicosilase do DNA em lesões oxidativas da pirimidina no DNA. Portanto, examinamos a dependência do atraso nos mutantes exo-3 em UNG-1 e NTH-1. Três dias após o desenvolvimento a partir dos ovos, 9% dos mutantes ung-1; os mutantes exo-3 estavam no estágio adulto grávido, 86% estavam no estágio adulto jovem e 5% estavam no estágio larval, e essas proporções foram quase as mesmas mostradas pelos mutantes exo-3 (11% no estágio adulto grávido, 85% no estágio adulto jovem e 4% no estágio larval) (Fig. 2), sugerindo que o atraso é independente da UNG-1. Em contraste, 94% dos nth-1;exo-3 mutantes estavam no estágio adulto grávido e 6% estavam no estágio adulto jovem. Os nth-1;ung-1;exo-3 mutantes apresentaram resultados semelhantes (Fig. 2), sugerindo que o atraso é dependente de NTH-1.

Efeitos da deficiência de DNA glicosilase no desenvolvimento larvar de vermes mutantes exo-3 (tm4374) em condições normais de cultivo. Proporção de vermes em cada fase de desenvolvimento após 3 dias de desenvolvimento dos ovos. Os valores indicam o número de vermes em cada estágio de desenvolvimento/o número total de vermes sobreviventes.

O atraso de desenvolvimento dos mutantes exo-3 é aumentado por MMS e NaHSO3

Para esclarecer se os agentes geradores de AP podem causar atraso de desenvolvimento, realizamos um ensaio de desenvolvimento usando MMS e bissulfito de sódio (NaHSO3) (Fig. 3a). Sabe-se que o MMS cria indiretamente locais de AP20,21 e mostrou induzir lesões de DNA no genoma de C. elegans22. Em 3,5 dias após a postura dos ovos em placas contendo 0,94 mM MMS, 97% dos N2 estavam no estágio adulto grávido e 3% estavam no estágio larval, enquanto 61% dos mutantes exo-3 estavam no estágio adulto grávido, 34% estavam no estágio adulto jovem e 5% estavam no estágio larval (Fig. 3b), sugerindo que os sítios da PA induzida por MMS causam maior atraso no desenvolvimento dos mutantes exo-3 do que no N2. Por outro lado, 93% dos mutantes apn-1 estavam no estágio adulto grávido, 6% estavam no estágio adulto jovem e 1% estavam no estágio larval, o que é semelhante aos resultados para N2 (Fig. 3b). NaHSO3 danifica o DNA principalmente através da desaminação da citosina para o uracilo23. Quatro dias após o desenvolvimento a partir do estádio ovo, todos os mutantes exo-3 não tratados com NaHSO3 desenvolveram-se em adultos grávidos, mas 33% daqueles tratados com NaHSO3 10 mM estavam no estádio adulto grávido, 12% estavam no estádio adulto jovem e 55% estavam no estádio larval (Fig. 3c), indicando que o NaHSO3 induziu atraso no desenvolvimento dos mutantes exo-3. Esse atraso foi aliviado nos mutantes ung-1;exo-3, pois 79% dos tratados com NaHSO3 10 mM estavam no estágio adulto grávido, 14% estavam no estágio adulto jovem e 7% estavam no estágio larval (Fig. 3c), sugerindo que o atraso de desenvolvimento induzido pelo NaHSO3 foi devido à atividade UNG-1. Em conjunto, os sítios AP podem causar atraso no desenvolvimento, assim como 3′-bloqueado SSB gerado por NTH-1.

Efeitos dos agentes geradores de AP no desenvolvimento larvar de vermes. (a) Esquema experimental. (b,c) Proporção de vermes em cada estágio de desenvolvimento 3,5 e 4 dias após o desenvolvimento a partir dos ovos abaixo de 0,94 mM MMS (b) e 10 mM NaHSO3 (c) condições, respectivamente. Os valores indicam o número de vermes em cada estágio de desenvolvimento/o número total de vermes sobreviventes.

O atraso de desenvolvimento dos mutantes exo-3 é induzido pelo CHK-2

Em seguida, colocamos a hipótese de que o atraso de desenvolvimento dos mutantes exo-3 iniciado pela glicosilase do DNA foi devido à ativação do ponto de verificação de danos no DNA, impulsionado pelos produtos de clivagem produzidos pelas glicosilases do DNA. Os genes dos pontos de verificação de danos de DNA, tais como chk-2 e clk-2, foram descritos em C. elegans24. Para testar nossa hipótese, o ensaio de desenvolvimento foi conduzido sob condições de chk-2 (RNAi) ou clk-2 (RNAi) (Fig. 4a). Embora 14% dos vermes exo-3;control (RNAi) estivessem no estágio adulto grávido e 84% no estágio adulto jovem, e os vermes exo-3;clk-2 (RNAi) demonstrassem proporções semelhantes (18% no estágio adulto grávido e 82% no adulto jovem), 93% dos vermes exo-3;chk-2 (RNAi) estivessem no estágio adulto grávido (Fig. 4b). Assim, a derrubada do chk-2 resgatou o atraso de desenvolvimento nos mutantes exo-3, sugerindo que CHK-2 induz o atraso de desenvolvimento nos mutantes exo-3.

Efeitos da falta de kinases no desenvolvimento larvar dos vermes exo-3 (tm4374) mutantes. (a) Esquema experimental para o ensaio de desenvolvimento. (b) Proporção de vermes em cada fase de desenvolvimento 3 dias após o desenvolvimento a partir dos ovos. Os valores indicam o número de vermes em cada estágio de desenvolvimento/o número total de vermes sobreviventes.

EXO-3 previne a formação de dut-1 (RNAi)-induced Pvl

DUT-1 é uma deoxiuridina trifosfato nucleotidohidrolase (dUTPase), que hidrolisa dUTP em dUMP. Portanto, o dut-1 (RNAi) leva ao aumento do dUTP no pool de nucleotídeos, que é incorporado ao DNA através da replicação do DNA ao invés do dTTP, causando o acúmulo de uracil no DNA25,26. Foi relatado que o dut-1 (RNAi) induz organogênese vulval anormal, Pvl, em vermes do tipo selvagem N2, e que o dut-1 (RNAi)-induzido Pvl é dependente do UNG-127. Especulamos que a deficiência de EXO-3 causa um aumento na incidência de dut-1 (RNAi)-induzido Pvl porque EXO-3 é necessário para reparar locais de AP após a clivagem do uracilo no DNA por UNG-1. Para confirmar isto, a formação de dut-1 (RNAi)-induzido Pvl foi observada em mutantes endonucleares com deficiência de AP (Fig. 5a-c). Dos adultos sobreviventes 4 dias após o desenvolvimento dos ovos, 52% eram mutantes exo-3 com dut-1 (RNAi)-induzidos e 13% eram vermes N2 com Pvl (Fig. 5d), sugerindo que a deficiência de EXO-3 causa um aumento do dut-1 (RNAi)-induzido no Pvl. Por outro lado, 15% dos mutantes apn-1 tinham Pvl, o que é semelhante à proporção de vermes N2 com Pvl (Fig. 5d). Os apn-1; exo-3 mutantes e exo-3 mutantes foram semelhantes em proporção, com 52% tendo Pvl (Fig. 5d).

Efeitos da deficiência de endonuclease AP em dut-1 (RNAi)-induced Pvl. (a) Esquema experimental. (b,c) Imagens representativas da vulva de vermes controle (b) e dut-1 (RNAi)- vermes Pvl induzido (c). (d) Proporção de vermes de Pvl 4 dias após o desenvolvimento a partir dos ovos. Os valores indicam o número de vermes Pvl/o número de vermes adultos.

O aumento de dut-1 (RNAi)-induzido Pvl nos mutantes exo-3 é dependente da UNG-1 independentemente da NTH-1

Para examinar se o aumento de dut-1 (RNAi)-induzido Pvl nos mutantes exo-3 ocorreu através da atividade UNG-1, investigamos a dependência do fenótipo na UNG-1. A porcentagem de mutantes ung-1;exo-3 com Pvl foi de 2%, que foi a mesma dos mutantes ung-1 com Pvl (1%) (Fig. 6a), sugerindo que o aumento de Pvl nos mutantes exo-3 se deve apenas à expressão UNG-1.

Efeitos da deficiência de DNA glicosilase e falta de kinases em dut-1 (RNAi)-induzido Pvl no exo-3 (tm4374) vermes mutantes. Proporção de vermes Pvl 4 dias após o desenvolvimento a partir dos ovos. Os valores indicam o número de vermes Pvl/o número de vermes adultos. (a) Efeitos da mutação ung-1 (tm2862). (b) Efeitos do chk-2 (RNAi) e clk-2 (RNAi).

Next, examinamos se os produtos de clivagem produzidos pela UNG-1 são necessários para induzir o Pvl, ou seja, se os sítios AP são transformados em SSB bloqueado 3′ através da atividade de lise AP do NTH-1. A porcentagem de mutantes exo-3 com Pvl foi comparável à do nth-1;exo-3 mutantes (Fig. 7b), sugerindo que a NTH-1 não é necessária para a dut-1 (RNAi)-induced Pvl.

Efeitos dos agentes nocivos ao DNA oxidativo no dut-1 (RNAi)-induzido Pvl em exo-3 (tm4374) e exo-3 (tm4374);nth-1 (ok724) vermes mutantes usando a técnica de duplo knockdown. (a) Esquema experimental. (b) Proporção de vermes Pvl 4 dias após o desenvolvimento a partir dos ovos. Os valores indicam o número de vermes Pvl/o número de vermes adultos. Os valores representam a média ± SD (n = 3). *P < 0,05; ANOVA unidirecional com o teste de Tukey para comparações múltiplas.

O aumento de Pvl induzido por dut-1 (RNAi)- nos mutantes exo-3 é conduzido pelo CHK-2

Posicionamos a hipótese de que o aumento de Pvl induzido por UNG-1 nos mutantes dut-1 (RNAi)- nos mutantes exo-3 pode ocorrer através da ativação do ponto de checagem de DNA conduzido por produtos de clivagem produzidos por UNG-1, além do atraso no desenvolvimento. Também foi relatado que o dut-1 (RNAi)-induzido Pvl é causado pelo ponto de verificação kinase CLK-227. Portanto, examinamos se o aumento do dut-1 (RNAi)-induzido Pvl nos mutantes exo-3 era dependente do CHK-2 e CLK-2. Apesar de 49% dos vermes exo-3; controle (RNAi) terem Pvl dut-1 (RNAi)-induzido, apenas 10% dos vermes exo-3; chk-2 (RNAi) o tinham (Fig. 6b). Por outro lado, a proporção de vermes exo-3;clk-2 (RNAi) com Pvl era quase a mesma (44%) que a dos vermes exo-3;control (RNAi). Portanto, a derrubada do chk-2 resgatou o aumento do dut-1 (RNAi)-induced Pvl nos mutantes exo-3, como observado para o atraso no desenvolvimento. Esses resultados sugerem que o aumento da dut-1 (RNAi)-induzido Pvl nos mutantes exo-3 ocorre através da expressão CHK-2.

Os agentes nocivos ao DNA oxidativo aumentaram a proporção de Pvl nos mutantes exo-3 somente quando combinados com dut-1 (RNAi)

Para investigar outros agentes nocivos ao DNA que causam um aumento de Pvl nos mutantes exo-3, avaliamos se a formação de Pvl é aumentada por agentes nocivos ao DNA oxidativo como o ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) e metil viologen (MV). NDX-1 e NDX-2 hidrolisam 8-oxo-dGDP em 8-oxo-dGMP24,28. Assim, o ndx-1 (RNAi) e o ndx-2 (RNAi) levam a um aumento de 8-oxo-dGDP na piscina de nucleotídeos. A presença do 8-oxo-dGDP reduz a atividade de 8-oxo-dGTPase do NDX-4, fazendo com que o 8-oxo-dGTP se acumule no pool24. O 8-oxo-dGTP é incorporado ao DNA durante a replicação do DNA, resultando no acúmulo de 8-oxoG no DNA24,28. A VM gera radicais superóxidos, que subsequentemente causam lesões oxidativas no DNA29. Entretanto, o tratamento único com ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) ou VM não teve efeito na incidência de Pvl nos mutantes exo-3. (dados não mostrados). Em seguida, examinamos se, quando combinado com o tratamento dut-1 (RNAi), cada agente nocivo ao DNA oxidativo aumentou ainda mais o aumento da Pvl nos mutantes do exo-3 (Fig. 7a). Cada tratamento testado aumentou o aumento do dut-1 (RNAi) induzido pelo Pvl nos mutantes exo-3 em aproximadamente 10% (Fig. 7b), sugerindo que lesões oxidativas no DNA também podem causar um aumento no Pvl.

Em experimentos in vitro, a NTH-1 foi encontrada possuindo atividade fraca de DNA glicosilase em direção a 8-oxoG no DNA, além de sua atividade muito mais alta em direção a lesões oxidativas de pirimidina30. Assim, suspeitamos que o maior aumento do dut-1 (RNAi) induzido pelo Pvl pelos agentes oxidantes adicionais depende da atividade da NTH-1. Embora tenhamos confirmado a dependência do fenótipo da NTH-1, a deficiência de NTH-1 não alterou a proporção de vermes que exibem Pvl (Fig. 7b).