Descoberta, actividade e caracterização de uma polissacarídeo oxigenase lítica AA10 do simbionte Teredinibacter turnerae

Expressão e caracterização enzimática da LPMO AA10 de T. turnerae

A gama-proteobactéria T. turnerae é o único endosymbiont encontrado dentro das brânquias do Shipworm gills a ter sido isolado com sucesso, cultivado e teve seu genoma mapeado. Através de anotações automáticas e buscas manuais BLAST do proteoma T. turnerae previsto, identificamos um gene (NCBI Reference Sequence: WP_019602454.1) codificado para um LPMO AA10 (doravante TtAA10A). A sequência de proteínas prevista apresenta um peptídeo de sinal N-terminal, o domínio LPMO e uma região de ligação rica em serina seguida por um módulo de ligação de carboidratos (CBM) de domínio 10 (Fig. 1a). AA10s foram encontrados com os domínios anexos CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 e CBM73 (comunicação pessoal Bernard Henrissat) e são conhecidos por serem ativos em celulose ou quitina. Acredita-se que os domínios CBM10 são vinculados à celulose e, portanto, podem proporcionar o reconhecimento da celulose que dificilmente será associada a um evento catalítico. Embora diferente das CBMs comumente encontradas ligadas a proteínas AA10 , sua presença na estrutura de domínio do gene TtAA10A dá uma indicação de que esta proteína pode ser principalmente ativa em polissacarídeos à base de glicosídeos.

Após múltiplas tentativas de expressar o gene com várias afinidades, marcas de solubilidade e diferentes sinais de secreção, proteína suficiente para análise foi finalmente obtida através da produção de um domínio catalítico LPMO com marcação C-terminal (de His25 a Gly228) em E. coli (Fig. 1b). A proteína marcada purificada foi carregada com excesso de cobre, descalcificada através de cromatografia de exclusão de tamanho, analisada para pureza através de SDS-PAGE (Fig. 1c) e ID de proteína baseada em espectrometria de massa (não mostrado), e utilizada para experimentos subseqüentes.

Recombinante TtAA10A (domínios catalíticos, 25-228, apenas) exibe as marcas de um AA10 corretamente dobrado. A análise de deslocamento térmico (Thermofluor) do TtAA10A purificado, Cu-loaded, indica uma temperatura de fusão (Tm) de 50,4 °C. A remoção do cobre com 10 mM EDTA baixa o Tm para 42,5 °C, sugerindo um efeito estabilizador da proteína pelo co-fator metálico, como relatado na literatura anterior para outras LPMOs (por exemplo, Fig. 1d). Também notamos uma variabilidade nos preparados protéicos, com alguns preparados contendo um único Cu (centro ativo), enquanto outros continham dois átomos de Cu, descritos abaixo.

Os ensaios de actividade, tanto em amostras de Cu simples como de Cu duplo, foram realizados em diversos substratos comerciais de polissacarídeos (Avicel, β-chitin da lula, α-chitin da concha do camarão, cellohexaose, amido de milho, pachyman, xilano de faia, glucomanano, xiloglucano, líquen, galactano, galactomanano e mannano) na presença do co-factor redutor, ácido gálico. As amostras foram analisadas após 24 h por MALDI-TOF MS e os picos de massa dos produtos de reação comparados com dados previamente publicados, revelando um padrão de oxidação misto C1-C4, exclusivamente sobre celulose, e dependente da presença do doador de elétrons (Fig. 2a, b). Os produtos não foram detectados em nenhum dos controles negativos (arquivo adicional 1: Figura S1). A análise MALDI-TOF MS do extrato bruto de ensaios de atividade realizados com TtAA10A carregado com Cu- na presença de EDTA 10 mM não detectou a liberação de produtos (dados não mostrados), indicando que, como esperado, o cobre é essencial para a atividade.

Experimentos de sinergia foram realizados pela co-incubação de TtAA10A e hidrolases glicosídicas comerciais (GH6 e GH9) na presença de Avicel e ácido gálico, e os mono e oligossacarídeos resultantes foram quantificados usando cromatografia de troca aniônica de alto desempenho (HPAEC). Enquanto as reações contendo LPMO ou GH liberaram quantidades desprezíveis de açúcares livres, as reações de co-incubação mostraram um forte efeito sinérgico, potencializado ainda mais pela presença do doador de elétrons (Fig. 2c, d, arquivo adicional 2: Figura S2). Vale ressaltar que ambos os GHs comerciais (GH6 e GH9) testados durante estes experimentos pertencem a famílias que foram identificadas como estando entre as mais abundantes no proteoma digestivo de minhocas, reforçando a relevância biológica dos ensaios de atividade acima mencionados no contexto da digestão da madeira no meio das minhocas.

Espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica

Nossa primeira evidência de que algumas preparações protéicas continham dois locais de Cu veio de análises EPR. A solução congelada (165 K) de banda X CW-EPR do espectro Cu saturado de TtAA10A (Fig. 3) exibiu dois conjuntos de picos hiperfinos na região paralela do espectro, indicando a presença de duas geometrias distintas de coordenação do cobre, decorrentes quer de diferentes ambientes de coordenação dentro de um único local (por exemplo, diferenças nos estados de protonação dos ligandos), quer de um segundo local distinto de ligação do cobre. Na verdade, uma simulação precisa da região paralela do espectro poderia ser obtida com duas espécies diferentes, cada uma das quais com um conjunto diferente de parâmetros hamiltonianos de spin, gz = 2,267 e |Az| = 425 MHz (espécie 1), e gz = 2,314 e |Az| = 465 MHz (espécie 2), Tabela 1, com uma relação entre as espécies 1 e 2 de aproximadamente 3:2. O valor de gz da espécie 2 é alto comparado com o que se poderia esperar para a típica coordenação de cobre AA10 LPMO no local ativo (espectroscopia de LPMOs recentemente revisada na Ref. ), com base na qual atribuímos a espécie 1 a um cobre ligado ao local ativo da histidina canônica. Os seus valores de Hamiltonian spin são típicos de uma geometria de coordenação axial Cu que contém uma mistura de ligantes N e O-donantes. (Note-se que a espécie 2 não pode ser de uma espécie de cobre livre em solução uma vez que todas as espécies de moléculas pequenas são removidas durante a preparação da proteína; por isso, todos os sinais de cobre na EPR surgem do cobre ligado à proteína.)

Para determinar se os dois sinais surgiram de um único local de ligação de cobre com diferentes geometrias de coordenação, ou de dois locais distintos de cobre, foi realizado um experimento de titulação com banda X CW-EPR. A proteína foi pré-tratada com EDTA (10x a concentração de proteína) para remover qualquer cobre e depois trocada por tampão para remover qualquer EDTA. Esta amostra de proteína sem cobre foi testada e, como esperado, não mostrou nenhum sinal baseado em cobre. A adição de 0,2 equivalentes de cobre (comparado com a concentração proteica) mostrou um único sinal na região paralela, atribuído ao íon cobre (II) dentro do local ativo da histidina (espécie 1). Adições adicionais de cobre aumentaram este sinal de cobre de histidina, com crescimento concomitante do sinal para a espécie 2, já evidente após 0,4 equivalentes de cobre (arquivo adicional 3: Figura S3). Estas experiências de titulação foram realizadas a um pH fixo e mostram que as duas espécies no espectro EPR do TtAA10A saturado de cobre representam dois locais diferentes de ligação do Cu com afinidades de ligação do cobre ligeiramente diferentes, onde a espécie 1 é o local de maior afinidade. Além disso, a amostra de TtAA10A com 0,4 equivalentes de Cu foi deixada a 4 °C durante 48 h, e o seu espectro EPR foi reexaminado. Esta amostra não mostrou diferença na proporção de espécies de cobre, demonstrando que os diferentes locais de ligação não surgiram devido a grandes diferenças na cinética da ligação do cobre.

Notavelmente, em várias preparações que produzimos, uma amostra de TtAA10A foi isolada, apresentando apenas um único sinal de cobre no espectro EPR. As razões para esta diferença na estequiometria de cobre da proteína isolada não são claras, uma vez que estas amostras foram ostensivamente preparadas usando condições idênticas às que proporcionaram o TtAA10A com dois sinais Cu distintos no espectro EPR da banda X (espécie 1 e espécie 2). Não fomos capazes de detectar quaisquer diferenças de actividade para estas preparações de cobre ocupadas individualmente em relação às amostras anteriores, mas pudemos aproveitar estas amostras para medir tanto os espectros da banda X como os da banda Q CW-EPR para o centro-activo Cu do TtAA10A (Fig. 4) com apenas a cinta histidina ocupada, como julgado por referência aos espectros anteriores. Esta amostra, portanto, nos permitiu realizar um ajuste simultâneo dos espectros da banda X e da banda Q para obter parâmetros hamiltonianos de spin mais precisos para o íon de cobre no local ativo da cinta histidina (espécie 1). Estes valores estão relatados na Tabela 2. A adição de PASC ao TtAA10A não causou nenhuma alteração dos espectros de EPR (dados não mostrados).

3D estrutura do TtAA10A

Para obter mais informações sobre a base molecular das propriedades bioquímicas do TtAA10A, e para sondar esta estrutura, potencialmente incomum, de Cu duplo, determinamos a estrutura cristalina para a proteína recombinantemente expressa com resolução de 1,4 Å (arquivo adicional 4: Tabela S1). A estrutura geral revelou uma dobra tipo imunoglobulina decorada por laços e um feixe helicoidal como tipicamente observado para as enzimas desta família (Fig. 5). De fato, as comparações estruturais utilizando o servidor DALI revelam as combinações estruturais mais próximas ao Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) e Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) com RMSDs de 2,4 Å e 2,3 Å acima de 180 e 170 Cα-posições, respectivamente, representando apenas 30% de identidade ao nível da sequência. Dada a alta atividade do TtAA10A na celulose, pode ser um pouco surpreendente que as duas combinações estruturais mais próximas dessa enzima sejam AA10s quitina-ativos. A terceira correspondência estrutural mais próxima, contudo, foi a AA10 de Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ) que é um AA10 específico da celulose dando um RMSD de 2,5 Å mais de 160 átomos Cα. O TtAA10A e o ScAA10 partilham apenas 26% da identidade da sequência, apesar de estarem activos no mesmo substrato, o que realça ainda mais a dificuldade em relacionar a especificidade do substrato LPMO com base apenas na sequência e na estrutura geral (discutida mais detalhadamente no contexto do AA9 na Ref. ).