Efeitos Antiasmáticos da Decocção Sanglong Pingchuan através da Indução de uma Resposta Imunológica Equilibrada Th1/Th2

Abstract

Objectivo. Investigar os efeitos antiasmáticos da Decocção Sanglong pingchuan (SLPCD) e explorar os seus mecanismos de acção. Métodos. O soro, o líquido de lavagem broncoalveolar (BALF) e os tecidos pulmonares de ratos asmáticos induzidos por OVA foram recolhidos 24 h após a última administração. Alterações patológicas pulmonares foram observadas pela coloração de H&E. As células inflamatórias no BALF foram contadas por citometria de fluxo. Os níveis de IgE total no soro e citocinas no BALF foram determinados por ELISA. Os níveis de expressão de mRNA de citocinas no pulmão foram testados pelo qRT-PCR. Resultados. O SLPCD inibiu significativamente a inflamação das vias aéreas, reduziu as células inflamatórias no BALF, reduziu os níveis de IgE total no soro e de citocinas Th2 (IL-10 e IL-13) no BALF, e diminuiu os níveis de expressão de mRNA de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) no pulmão de camundongos asmáticos. Entretanto, o SLPCD elevou notavelmente o nível de citocinas Th1 IFN-γ no BALF e upregulou os níveis de expressão de mRNA de citocinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) no pulmão de camundongos asmáticos. Conclusão. O SLPCD poderia atenuar a inflamação das vias aéreas e aliviar a patogênese em camundongos asmáticos através da indução de uma resposta Th1/Th2 equilibrada e poderia atuar como uma droga eficaz no tratamento da asma.

1. Introdução

A asma é uma doença respiratória complexa e crônica que é caracterizada por hiperresponsividade brônquica, inflamação e remodelação das vias aéreas, obstrução do fluxo aéreo e infiltração de diferentes tipos de células inflamatórias induzidas por citocinas e outros mediadores . A asma é causada por fatores ambientais, como alergênios, vírus e exposições ocupacionais em indivíduos geneticamente predispostos; entretanto, sua causa definitiva não é clara. A incidência da asma tem aumentado significativamente em todo o mundo, especialmente em crianças pequenas, para se tornar uma das doenças respiratórias mais comuns . Estima-se que 300 milhões de indivíduos são afectados pela asma entre diferentes países .

Correntemente, os corticosteróides são os medicamentos mais eficazes para o tratamento da asma . Embora estes medicamentos possam melhorar os sintomas da asma, eles não curam esta doença . Estes agentes também têm efeitos secundários graves, particularmente em crianças, incluindo supressão imunológica, infecções secundárias, atrofia muscular, osteopenia, osteoporose, catarata e glaucoma . Portanto, a busca contínua por medicamentos novos, seguros e eficazes é da maior importância.

Muitos medicamentos tradicionais chineses são usados no tratamento da asma há séculos e ainda são amplamente utilizados em países asiáticos . Recentemente, o mecanismo de ação de numerosas fórmulas herbais usadas no tratamento da asma alérgica tem sido relatado . Vários produtos naturais derivados de plantas com propriedades anti-inflamatórias também foram testados para potencial aplicação no tratamento da asma .

Sanglong pingchuan decoction (SLPCD) é uma preparação hospitalar prescrita pelo Professor Qing Chang, um médico veterano nacional da medicina tradicional chinesa, mentor de estúdio herdado, no Shaoxing Hospital of Traditional Chinese Medicine. O SLPCD é derivado de Shegan Mahuang Tang por adição e subtração. Shegan Mahuang Tang é uma conhecida medicina tradicional chinesa de prescrição médica mencionada pela primeira vez em Jin Kui Yao Lve. Como a formulação representativa de dissipar o frio, aliviar a síndrome exterior, aquecer os pulmões, eliminar o catarro e aliviar a asma, Shegan Mahuang Tang é amplamente utilizado para o tratamento da asma, bronquite infantil, asma brônquica, pneumonia, bronquite aguda e crônica de idosos, enfisema e rinite alérgica. A fórmula do SLPCD consistiu em treze medicamentos chineses tradicionais listados na Tabela 1. Um estudo randomizado demonstrou que o SLPCD é eficaz no tratamento da asma, especialmente na redução da taxa de exacerbação. Contudo, a eficácia da SLPCD não foi comprovada por experimentos controlados.

No presente estudo, fornecer base experimental para a aplicação clínica do SLPCD no tratamento da asma e explorar seus mecanismos de ação, utilizando o modelo de rato asmático induzido por OVA, Os efeitos anti-inflamatórios da SLPCD foram investigados pelo exame histológico, enumeração de células imunes no líquido de lavagem broncoalveolar (BALF), quantificação da IgE total no soro, citocina no BALF, e a expressão do mRNA da citocina nos tecidos pulmonares.

2. Materiais e Métodos

2.1. Materiais e Reagentes Vegetais

Cortex Mori (número do lote: 140901), Pheretima Aspergillum (número do lote: 150406), Herba Ephedrae (número do lote: 150302), Rhizoma Belamcandae (número do lote: 141213), Sémen Armeniacae Amarum (número do lote: 150312), Fructus Perillae cozido com agitação (número do lote: 150115), Scorpio (número do lote: 150126), Semen Descurainiae (número do lote: 150312): 150208), Flos Farfarae fritos com mel (número do lote: 150301), Herba Houttyniae (número do lote: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (número do lote: 150308), Radix Angelicae Sinensis (número do lote: 150126): 150213), e Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (número do lote: 140917) foram adquiridos no Shaoxing Hospital of Chinese Medicine e foram autenticados pelo Professor Yonghai Jiang do Shaoxing Institute for Food and Drug Control, Zhejiang, China. Os padrões de ácido clorogênico e rutina foram comprados do Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou, China, e a pureza de ambos os compostos foi superior a 98%.

Ovalbumin (OVA) foi comprado da Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, EUA; o mouse IL-10, IL-13, e os kits ELISA detectores IFN-γ foram comprados da Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd., Hubei, China; o kit ELISA de IgE de rato era da RayBiotech Inc., Norcross, GA, EUA, o soro fetal de bezerro (FCS) era de Gibco, Grand Island, NY, EUA. O anti-rato purificado CD16/CD32 (Fc Bloco Receptor), Ly-6G-FITC (clone: RB6-8C5), antígeno F4/80 PE-Cy5 (clone: BM8), Ly-6C-APC (clone HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alfa (FceR1)-APC (clone: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, clone: 2B8), e siglec-F-PE (clone: E50-2440) foram adquiridos anticorpos da eBioscience, Inc, San Diego, CA, EUA. O reagente Trizol foi adquirido de Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA; revert Aid™ M-MLV reverse transcriptase foi de Fermentas, Amherst, NY, EUA; ribonuclease inhibitor e oligo(dT)18 foram de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., China; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) foi de Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA. Aluminum hydroxide gel (Alum) foi comprado da China Animal Husbandry Industry Co., Ltd., Beijing, China; dexamethasone (Dex) foi da Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, China.

2.2. Preparação de SLPCD

Prescrição de medicamentos de SLPCD (440 g) foram macerados em 8 alíquotas de água destilada por 30 min e depois fervida por 1 h. Após a primeira decocção, as borras foram fervidas em 6 alíquotas de água destilada por mais 30 min. O sobrenadante obtido da dupla decocção foi filtrado através de uma gaze esterilizada e concentrado por um rotavapor (Buchi, Suíça) sob pressão reduzida a 65°C até uma concentração final de 1,1 g de droga bruta/ml. A decocção concentrada foi armazenada a -20°C e subsequentemente diluída por água destilada para várias concentrações diferentes antes do uso.

2.3. Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) Análise de SLPCD

HPLC foi realizada utilizando uma coluna Diamon C18 (250 mm × 5 mm, 5 μm) e um detector PDA Waters 2996 no instrumento de HPLC Water 600E. A fase móvel foi uma mistura de acetonitrilo (A) e ácido fosfórico 0,1% (B). Uma eluição linear de gradiente foi conduzida da seguinte forma: 0-8 min a 2% A, 8-35 min a 6% A, 35-40 min a 8% A, 40-45 min a 13% A, 45-70 min a 14% A, 70-80 min a 17% A, e 80-90 min a 17-2% A. A vazão foi de 1 ml/min e o volume de injeção foi de 10 μl. A temperatura da coluna foi constantemente mantida a 30°C. A análise por HPLC dos padrões (ácido clorogênico e rutina) e das amostras foi realizada sob a condição experimental estabelecida como mencionado acima.

2,4. Animais Experimentais

Ratos BALB/c fêmeas com 5 semanas de idade foram adquiridos no Centro Animal Experimental de Shanghai da Academia Chinesa de Ciências, Shanghai, China (certificado no. SCXK 2007-0005). Os ratos foram aclimatados durante 1 semana antes de serem utilizados. A comida de laboratório e a água da torneira foram fornecidas ad libitum e mantidas sob condições controladas com uma temperatura de 24 ± 1°C, umidade de 50 ± 10%, e um ciclo luz/escuro de 12/12-h. Todos os procedimentos estavam em estrita conformidade com a legislação PR China sobre o uso e cuidado de animais de laboratório e com as diretrizes estabelecidas pelo Institute for Experimental Animals da Universidade de Zhejiang e foram aprovados pelo comitê da universidade para experimentos com animais.

2.5. Sensibilização, Desafio e Tratamento de Ratos

Ratos BALB/c fêmeas foram divididos em seis grupos: grupo controle normal (NC), grupo controle modelo (MC), grupo controle positivo (tratado com Dex, 2 mg/kg) e grupos SLPCD (5,5, 11, e 22 g/kg). Cada grupo consistiu em dez ratos. A inflamação das vias aéreas do rato foi induzida por OVA. Os animais foram imunizados por injeção intraperitoneal de uma solução contendo 50 μg de OVA e 200 μg de hidróxido de alumínio por 3 dias. No 14º dia foi realizada uma sensibilização de reforço. Uma semana após a última sensibilização, os ratos foram expostos a 2% de OVA aerossolizado utilizando o nebulizador PARI TurboBOY N (1205) (PARI GmbH, alemão) durante 1 h por dia durante 8 dias. Quatro dias antes de serem desafiados, os ratos sensibilizados foram administrados oralmente com SLPCD nas doses de 5,5, 11 e 22 g/kg ou injetados intraperitonealmente com 2 mg/kg de dexametasona (Dex) todos os dias durante 12 dias. Os grupos de controle dos modelos receberam o mesmo volume de soro fisiológico. A dose de volume foi de 0,2 ml/10g de peso corporal. Dez ratos como grupo controle normal foram apenas sensibilizados e desafiados com soro fisiológico. Os procedimentos empregados para a sensibilização e desafios com OVA, assim como o tratamento com SLPCD, foram mostrados na Figura 1.

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Figura 1

Protocolo experimental para modelo asmático induzido por OVA e processos de tratamento.

2.6. Histopatologia Pulmonar

Os tecidos pulmonares foram coletados 24 h após a última administração e depois fixados com paraformaldeído a 4%, embebidos em parafina, e seccionados em 5 espessuras μm. Uma série de micro-secções foi corada com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliação histológica.

2,7. A coleta do fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) e a citometria de fluxo

BALF foi coletada por lavagem do pulmão com solução tampão fosfato (PBS) fornecida através de um cateter endotraqueal 24 h após a última administração. O BALF foi centrifugado durante 5 min e as células foram lavadas com PBS gelada contendo 2% de FCS. As células foram bloqueadas com 0,5 μg de anticorpo anti-rato CD16/CD32 (bloqueio FcR) purificado por 10 min em gelo para inibir a coloração inespecífica e depois coradas com a combinação de anticorpos anti-rato Ly-6G-FITC, antigénio F4/80-PE-Cy5 e Ly-6C-APC, ou FceR1-APC, CD117-FITC e Siglec-F-PE à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. As células coradas foram lavadas com PBS gelada e ressuspendidas em PBS. Cem mil células viáveis por tratamento foram analisadas usando um citômetro de fluxo BD FACScan usando o software CellQuest.

2.8. Medição do anticorpo IgE total no soro

O soro foi coletado 24 h após a última administração. O anticorpo IgE total foi detectado em amostras individuais de soro pelo kit RayBio® IgE ELISA do rato. As amostras de soro diluídas 1:1250 ou padrão IgE foram adicionadas a placas de 96 poços revestidas com anticorpo anti-rato IgE específico. As placas foram incubadas durante 2,5 h à temperatura ambiente e depois lavadas quatro vezes. O anticorpo de detecção foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 h antes da adição de ABC conjugado com peroxidase de rábano silvestre. Após a incubação por 45 min, as placas foram lavadas e desenvolvidas com TMB por 30 min à temperatura ambiente. A reação foi interrompida com a adição de 20 μl de solução de parada. A absorvância foi medida no leitor ELISA (BIO-RAD 680) a 450 nm.

2.9. As concentrações de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) e Th1 (IFN-γ e IL-2) em BALF foram detectadas usando kits ELISA comerciais como anteriormente .

2,10. Os níveis de expressão do mRNA Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13) e Th1 (IFN-γ e IL-2) de citoquinas em tecidos pulmonares foram determinados usando qRT-PCR. O RNA total foi isolado dos tecidos pulmonares homogeneizados usando o reagente Trizol de acordo com o protocolo do fabricante, e a transcrição reversa foi realizada como anteriormente . Em seguida, a amplificação foi realizada em 20 μl reação usando FastStart Universal SYBR Green Master. A PCR em tempo real foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real ABI 7400. Primers para qRT-PCR foram sintetizados pela Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (China), e as sequências foram listadas na Tabela 2. O ciclo qPCR foi realizado da seguinte forma: desnaturação inicial a 95°C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de desnaturação a 95°C durante 10 s, recozimento a 60°C durante 1 min. O GAPDH foi utilizado como controle endógeno. A eficiência e especificidade da amplificação dos primers foram verificadas para cada conjunto de primers. Os níveis de expressão dos genes testados em relação ao GAPDH foram determinados usando o método e como indução de pregas.

Gene Sequência de primer Tamanho do produto (bp) GAPDH 5′-AGCCTCGTCCCGTAGACAA-3′ 104 >5′-AATCTCCACTTTGCCACTGC-3′ IL-2 5′-CCCAAGCAGGCCACAGAATTGAAA-3′ 81 5′-AGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG-3′ IFN-γ 5′- TCTTGAAAGACAATCAGGCCATCA -3′ 233 5′- GAATCAGCAGCAGCGACCTCTCTTCC -3′ IL-4 5′-CAAACGTCCTCAGCAACCCATCAACG-3′ 203 >5′-CTTGGACTCATTCATGGTGC-3′ IL-5 5′- GCTGGCCTCAAACTGGTAATGTA -3′ 100 >5′- GGCAATTACTGTGATGTAACCTC -3′ >IL-10 5′- GCTCTTACTGTACTGATGATGATGAG -3′ 105 5′- CGCAGCTCTAGGAGCATGTG -3′ IL-13 5′- GCTTGCCTTGGTCTCGCC -3′ 175 5′- GGGCTACACAGAACCCGCCA -3′

> Tabela 2

>Sequências de prensagem usadas para qRT-PCR.

2.11. Análise estatística

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) e examinados para sua significância estatística de diferença com ANOVA e um teste pós-hoc de Tukey. -Valores inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

3. Resultados

3,1. Perfil HPLC do SLPCD

Os conteúdos de ácido clorogênico e rutina no SLPCD foram analisados por HPLC. Em comparação com os compostos de referência padrão, ácido clorogênico e rutina foram identificados e determinados (Figura 2). As equações de regressão da curva de calibração dos padrões foram A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) e A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) para o ácido clorogênico e a rutina, respectivamente. As concentrações de ácido clorogênico e rutina no SLPCD foram de 1,4 mg/g e 0,15 mg/g, respectivamente.

(a)

(b)

(a)
(b)

3.2. SLPCD Attenuated Airway Inflammation in Asthmatic Mice

O efeito do SLPCD na inflamação pulmonar em ratos asmáticos induzidos por OVA foi observado através da coloração H&E, e os resultados foram mostrados na Figura 3. Os ratos modelo asmáticos apresentaram infiltração mais grave de células inflamatórias intersticiais, peribronquiolares e perivasculares no pulmão, em comparação com os ratos de controle normal. Como controle positivo, Dex aliviou significativamente a infiltração de células inflamatórias intersticiais, peribronquiolares e perivasculares no pulmão em camundongos asmáticos. Os infiltrados inflamatórios nos pulmões dos camundongos com AOV também foram significativamente atenuados pelo SLPCD em comparação com o modelo de controle.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

3,3. SLPCD Células Inflamatórias Reduzidas em BALF de Camundongos Asmáticos

Para verificar os efeitos do SLPCD na infiltração de células inflamatórias no pulmão de camundongos asmáticos induzidos por OVA, a contagem das células inflamatórias incluindo eosinófilos (Sigilec F+), basófilos (CD117+), neutrófilos (Ly-6C+y-6), macrófagos (F4/), monócitos (Ly6G-Ly6C+) e mastócitos (FcER1+) em BALF foi realizada por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4, os números de eosinófilos (1756 vezes), macrófagos (114 vezes), neutrófilos (110 vezes), basófilos (91,7 vezes), monócitos (45,8 vezes) e mastócitos (6,9 vezes) no BALF de camundongos asmáticos foram marcadamente elevados em comparação com os camundongos de controle normal. Dex diminuiu significativamente os números de uma variedade de células inflamatórias testadas no BALF de camundongos asmáticos (), quase perto dos níveis de camundongos normais. O número dessas células inflamatórias no BALF de camundongos asmáticos foi significativamente reduzido por SLPCD em comparação com o grupo controle modelo (, , ou ).

Figura 4

Efeito do SLPCD sobre o recrutamento de células inflamatórias em BALF em camundongos com asma induzida por OVA. O BALF foi coletado 24 h após a última administração e a composição celular foi analisada pela FACS descrita no texto. Os valores são apresentados como média ± DP (). As diferenças significativas em relação ao grupo controle do modelo asmático (MC) são designadas como , e . Dex: dexametasona (controle positivo), NC: grupo controle normal.

3.4. SLPCD Diminuição dos níveis de IgE total no soro de ratos asmáticos

Os efeitos do SLPCD sobre os níveis de IgE total no soro de ratos asmáticos foram mostrados na Figura 5. Os níveis séricos de anticorpos IgE totais em ratos asmáticos foram significativamente mais elevados do que os níveis em ratos de controlo normal (). Como medicamento positivo, Dex diminuiu significativamente os níveis séricos totais de anticorpos IgE em camundongos asmáticos induzidos por OVA (). Os níveis séricos de anticorpos IgE total nos camundongos asmáticos foram significativamente diminuídos por SLPCD em comparação com o grupo controle do modelo ().

Figura 5

Efeitos do SLPCD sobre os níveis de IgE total no soro de camundongos com asma induzida por OVA. O soro foi coletado 24 h após a última administração e os níveis de IgE total foram medidos usando os kits ELISA descritos no texto. Os valores são apresentados como média ± DP (). As diferenças significativas em relação ao grupo de controle do modelo asmático (MC) são designadas como . Dex: dexametasona (controle positivo) e NC: grupo controle normal.

3,5. SLPCD Modulated the Levels of Cytokines in BALF of Asthmatic Mice

Os níveis de Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13) e Th1 (IFN-γ e IL-2) cytokines in BALF foram medidos por ELISA. Como mostrado na Figura 6, o desafio OVA levou ao aumento significativo do nível de IL-10 e IL-13 e diminuição do nível de IFN-γ no BALF dos ratos asmáticos em comparação com o grupo controle normal ( ou ). Entretanto, o conteúdo de IL-4, IL-5 e IL-2 no BALF dos modelos de camundongos-controle foi considerado muito baixo e próximo do limite de detecção. A administração de SLPCD em três doses e Dex diminuiu significativamente os níveis de IL-13 e IL-10, além de elevar notavelmente o de IFN-γ no BALF de camundongos asmáticos induzidos por OVA, em comparação com os camundongos-controle modelo ( ou ) (Figura 6).

Figura 6

Efeitos da SLPCD sobre os níveis de citocinas em BALF de ratos asmáticos induzidos por OVA. O BALF foi coletado 24 h após a última administração. Os níveis de citoquinas Th1 (IL-10 e IL-13) e Th1 (IFN-γ) no BALF foram medidos utilizando os kits ELISA descritos no texto. Os valores são apresentados como média ± SD (). As diferenças significativas em relação ao grupo de controle do modelo asmático (MC) são designadas como e . Dex: dexametasona (controle positivo) e NC: grupo controle normal.

3,6. SLPCD Regulou os níveis de expressão do mRNA das citocinas em tecidos pulmonares de camundongos asmáticos induzidos por OVA

Os efeitos do SLPCD na expressão do mRNA das citocinas do tipo Th1 e Th2 em tecidos pulmonares de camundongos asmáticos induzidos por OVA foram detectados usando o qRT-PCR, e os resultados foram mostrados na Tabela 3. Em comparação com os ratos controle normais, os níveis de expressão de Th2 citocinas mRNAs (IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13) foram marcadamente upregulados e os de Th1 citocinas mRNAs (IL-2 e IFN-γ) foram significativamente desregulados nos tecidos pulmonares de ratos asmáticos (P < 0,001). A administração de SLPCD em três doses e Dex resultou em significativa downregulação dos níveis de expressão de mRNA das citocinas Th2 IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 e upregulação das citocinas Th1 IL-2 e IFN-γ nos tecidos pulmonares de camundongos asmáticos em comparação com os grupos do modelo asmático (P < 0,05, P < 0,01, ou P < 0,001).

> Grupo Dose IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 IL-2 IFN-γ > NC – > 1.00±0.14 1,00±0,23 1,00±0,19 1,00±0,31 1,00±0,19 1,00±0,13 MC – 38.91±2.96 5.22±0.64 7.49±0.23 142.3±14.6 0.73±0.13 0.59±0.15 CTX (mg/kg) 50 19,08±2,62 2,56±0,42 5,07±0.67 44,00±7,74 1,20±0,20 2,14±0,34 SLPCD (g/kg) 5.5 21.70±4.64 4.06±0.38 6.68±0.68 71.26±10.62 1.28±0.20 1.12±0.20 11 21.30±3.71 3.74±0.37 6.21±0.44 65.4±11.99 1.33±0.26 1.53±0.21 22 23.09±3.27 3.07±0.34 6.03±0.65 61.51±8.77 1.49±0.34 1.71±0,23

Os tecidos pulmonares foram coletados 24 h após a última administração e os níveis de expressão do mRNA de GAPDH e citocinas foram detectados pelo qRT-PCR usando primers específicos. O gene homekeeping GAPDH foi utilizado como controle endógeno. Os valores são apresentados como média ± SD (). As diferenças significativas em relação ao grupo controle do modelo asmático (MC) são designadas como , e . Dex: dexametasona (controle positivo) e NC: grupo controle normal.

Tabela 3

Efeito do SLPCD sobre os níveis de expressão do mRNA das citocinas nos tecidos pulmonares de camundongos asmáticos induzidos por OVA.

4. Discussão

A asma tornou-se um problema de saúde pública em todo o mundo, especialmente em países desenvolvidos . Os glicocorticoides são a terapia de primeira linha para o tratamento e controle da asma. Embora estes medicamentos pudessem melhorar os sintomas da asma, foram rigorosamente controlados para uso persistente devido aos seus graves efeitos secundários . Portanto, novas abordagens terapêuticas asmáticas são necessárias. Muitos medicamentos tradicionais chineses exibem várias atividades biológicas, incluindo antibacterianos, antifúngicos, anti-inflamatórios, anti anafilaxia e efeitos imunomoduladores, que têm potencial para o tratamento da asma. Foram descritos vários modelos de inflamação broncopulmonar alérgica em ratos experimentais. O modelo de rato asmático induzido por OVA replica muitas características da asma humana, que tem ganho grande aceitação . Portanto, investigamos os efeitos antiasmáticos do SLPCD e exploramos seus mecanismos moleculares usando este modelo.

SLPCD consiste em 13 medicamentos chineses tradicionais. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum e Herba Ephedrae são o componente primário que dispersa o pulmão e alivia a asma. O sémen Armeniacae Amarum, Fructus Perillae cozido, Semen Descurainiae e Flos Farfarae fritos com mel são componentes auxiliares que reduzem a catarro, aliviam a tosse e a asma. Os componentes adjuvantes incluem Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae e Rhizoma Fagopyri Dibotrydis que eliminam o mal do calor e expulsam os males superficiais, assim como Scorpio e Radix Angelicae Sinensis que dispersam a estase sanguínea, draga colateral, espasmo e param a asma. O Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmoniza todas as drogas. Em conjunto, todos os componentes se complementam para alcançar os resultados de dispersar o pulmão, baixar o Qi, e aliviar a tosse e a asma. O controle de qualidade do SLPCD utilizado neste estudo foi realizado por HPLC, e duas substâncias químicas de referência (ácido clorogênico e rutina) foram identificadas como componentes principais do índice (Figura 2).

Asma alérgica é definida como uma doença inflamatória aguda a crônica das vias aéreas com recrutamento eosinofílico característico, hiperplasia das células da taça, hipersecreção de muco, deposição de colágeno, hipertrofia das células musculares lisas, e fibrose subepitelial. Neste estudo, os efeitos do tratamento SLPCD sobre a inflamação pulmonar em camundongos asmáticos com OVA foram avaliados através da coloração H&E. O típico acúmulo alérgico e infiltração de células inflamatórias foram observados nos tecidos pulmonares de ratos modelo asmáticos. O tratamento do SLPCD reduziu os infiltrados inflamatórios nos tecidos pulmonares de camundongos asmáticos (Figura 3), sugerindo que o SLPCD aliviou acentuadamente a inflamação das vias aéreas.

As células imunes inflamatórias desempenham um papel fundamental na patogênese e na gravidade da asma . As células inflamatórias recrutadas dos linfonodos regionais para as vias aéreas poderiam secretar citocinas e quimiocinas, resultando em hiper-reactividade das vias aéreas . A redução das células inflamatórias das vias respiratórias é uma forma eficaz de tratar a asma . Para confirmar que o SLPCD pode inibir a infiltração de células inflamatórias, contamos ainda eosinófilos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, monócitos e mastócitos em BALF. A inalação de OVA levou a aumentos significativos na contagem desses seis tipos de células inflamatórias no BALF (Figura 4). As dobras de aumento foram 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 e 6,9 dobras para eosinófilos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, monócitos e mastócitos, respectivamente, indicando um estabelecimento satisfatório de um modelo exacerbado de asma neste estudo. O tratamento com SLPCD diminuiu significativamente e dose-dependentemente o número dessas células inflamatórias, especialmente eosinófilos, no BALF em comparação com ratos asmáticos (Figura 4). Estes resultados sugeriram que a SLPCD reduziu a infiltração da célula inflamatória no pulmão em camundongos asmáticos induzidos por OVA, sendo consistente com os resultados da observação histopatológica.

É bem conhecido que a elevação dos níveis de anticorpos IgE foi correlacionada com a inflamação alérgica das vias aéreas e a hiper-reactividade brônquica em camundongos modelo asmáticos . Coyle et al. relataram que anticorpos anti-IgE atenuaram a inflamação eosinofílica das vias aéreas e a hiper-reactividade brônquica em ratos asmáticos. O IgE induzido por alergênio desencadeou eosinófilos, basófilos e mastócitos para secretar citocinas IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 . Portanto, avaliamos os níveis séricos de IgE total e descobrimos que a SLPCD poderia baixar significativamente os níveis séricos de IgE total em camundongos asmáticos com OVA (Figura 5).

O desequilíbrio de células Th1/Th2 é considerado como a causa imunológica da asma. Na asma, a atividade das células Th1 é reduzida, enquanto a atividade das células Th2 é ativada, resultando em um aumento das citocinas Th2 e uma diminuição das citocinas Th1 . As células Th2 migram para o pulmão e secretam as citocinas prototípicas do tipo Th2 IL-4, IL-5 e IL-13, resultando em hiperplasia das células da taça, broncoconstrição e eosinofilia nas vias aéreas . In vitro, a IL-13 pode mediar a produção de IgE e pode desempenhar um papel fundamental na patogênese de doenças alérgicas mediadas por IgE . A IL-13 também pode aumentar a sobrevivência dos eosinófilos e contribuir para as atividades patológicas destas células na asma . Os camundongos que superexpressam a IL-13 reproduzem várias características da asma, incluindo eosinofilia pulmonar, hiperplasia epitelial, obstrução das vias aéreas e hiper-resposta a colinérgicos.

Suprimir a produção de citocinas Th2 seria útil para a imunoterapia alergênica . Por outro lado, as células Th1 ativadas podem inibir a inflamação das vias aéreas asmáticas . As citocinas Th1, tais como IFN-γ, inibem o recrutamento de eosinófilos induzidos por alergénios e a libertação de IgE através da desregulação da expressão GATA-3, IL-4 e IL-5 nos tecidos pulmonares do modelo da asma . Neste estudo, estimamos o efeito do SLPCD sobre os níveis de citocinas no BALF a partir dos ratos asmáticos. Os resultados mostraram que o SLPCD não só reduziu os níveis de IL-13 e IL-10, mas também elevou o nível de IFN-γ no BALF dos camundongos asmáticos (Figura 6). A ação inibitória do tratamento com SLPCD na produção de citocinas Th2 foi consistente com seu efeito sobre os níveis de IgE total no soro.

Foi relatado que a IL-5 desempenha um papel importante na proliferação, diferenciação, maturação e migração para sítios teciduais de eosinófilos. Os níveis de expressão de IL-5 mRNA em biópsias brônquicas de asmáticos foram upregulados em comparação com controles não asmáticos . Os níveis de expressão do mRNA da IL-5 foram correlacionados com a gravidade clínica da asma . A provocação alérgica acumulada upregulou a expressão de IL-4 mRNA em células BALF e células T CD4+ e CD8+ periféricas . A IL-10 também foi indicada para participar da asma . A upregulação das transcrições de IL-13 em células BAL de pacientes com asma leve após a crise de baixa dose de alergênio é consistente com seu maior nível de expressão de IL-13 mRNA na mucosa brônquica . Os efeitos do tratamento SLPCD no nível de expressão do mRNA nas citocinas dos tecidos pulmonares dos ratos asmáticos foram ainda determinados usando o qRT-PCR. O tratamento SLPCD diminuiu significativamente os níveis de expressão de mRNA das citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13) e upregulou os das citocinas Th1 (IL-2 e IFN-γ) nos pulmões de ratos asmáticos. Estes resultados confirmaram ainda os efeitos regulatórios do tratamento com SLPCD nas respostas de citocinas Th1 e Th2 nos tecidos pulmonares de camundongos asmáticos.

Em conclusão, SLPCD poderia inibir significativamente a inflamação das vias aéreas, reduzir células inflamatórias no BALF, diminuir os níveis séricos de IgE total e modular o conteúdo de citocinas no BALF e a expressão do mRNA das citocinas no pulmão de camundongos asmáticos. Estes resultados sugeriram que o SLPCD poderia atenuar a inflamação das vias aéreas e aliviar a patogênese em um modelo de asma de camundongo através da indução de uma resposta Th1/Th2 equilibrada e validar seu uso clínico como uma droga eficaz no tratamento da asma.

Disclosure

O endereço atual de Binnian Zhu é ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd, Hangzhou 310030, China.

Conflitos de interesse

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

As contribuições dos autores

Binnian Zhu e Jun Dong contribuíram igualmente para este trabalho de pesquisa.

Administrações

Este trabalho foi apoiado pelo Grant-in-Aid do Projeto Shaoxing Science and Technology (no. 2014B700722).