Efeitos citotóxicos e genotóxicos do acefato no esperma humano

Abstract

O uso extensivo de pesticidas organofosforados (OPs) poderia alterar a qualidade do sémen e o DNA do esperma em diferentes estágios da espermatogênese. O acefato é um OP altamente tóxico amplamente utilizado e, por isso, o nosso objectivo era avaliar os efeitos do acefato na qualidade do sémen humano e na integridade do ADN espermático. Os espermatozóides recolhidos em machos saudáveis foram expostos a 0, 50, 100 e 200 μg/mL de acefato e incubados durante 1 h, 2 h e 3 h. Posteriormente, foram examinados a motilidade, vitalidade, integridade funcional da membrana plasmática, a capacidade espermática e os danos no ADN. Os resultados mostraram um declínio significativo da motilidade em 100 μg/mL após 3 h e em 200 μg/mL após 1 h, 2 h e 3 h. A viabilidade foi significativamente reduzida em 200 μg/mL após 2 h e 3 h. A integridade funcional foi significativamente afectada em 100 μg/mL após 3 h e em 200 μg/mL dose após 2 h e 3 h. Da mesma forma, a capacidade espermática foi significativamente afectada a 200 μg/mL após 1 h, 2 h e 3 h e a 100 μg/mL após 3 h. Os danos no ADN aumentaram significativamente apenas em 200 μg/mL após 3 h. O estudo sugere que a exposição ao acefato pode resultar em alterações da estrutura e função espermática, contribuindo assim para a deterioração da qualidade do sémen humano, desencadeando a infertilidade.

1. Introdução

Nos últimos decénios, vários estudos têm demonstrado uma função reprodutiva destrutiva em animais e em humanos, devido a produtos químicos e outros tóxicos produzidos pelo homem. Infelizmente, relativamente poucos estudos têm abordado sistematicamente o impacto da exposição ambiental sobre a saúde reprodutiva humana. De acordo com estudos recentes, globalmente, todos os anos os casais que sofrem de infertilidade (não conseguem conceber após 12 meses de relações sexuais regulares sem protecção) são responsáveis por cerca de 60-80 milhões de pessoas. Noventa e oito por cento dos casos de subfertilidade masculina podem ser atribuídos principalmente à qualidade deficiente dos espermatozóides. Contudo, a subfertilidade pode ser considerada idiopática e pode ser o resultado de factores de risco como os desreguladores endócrinos ambientais, incluindo pesticidas.

Os pesticidas organofosforados são ésteres de ácidos fosfóricos e tiofosfóricos e a sua toxicidade tem estado relacionada com a sua capacidade de inibir a acção da acetilcolinesterase, levando à acumulação de acetilcolina nas junções nervosas . Muitos estudos epidemiológicos têm reconhecido a associação entre a exposição a pesticidas organofosforados (OPs) e distúrbios reprodutivos, tais como infertilidade, defeito de nascença, resultados adversos da gravidez e mortes perinatais . Suspeita-se que os pesticidas organofosforados alteram a função reprodutiva reduzindo a atividade da acetilcolinesterase cerebral afetando a gonadotropina pituitária, causando infertilidade . Os efeitos na qualidade do sémen podem ser avaliados por parâmetros como a concentração de esperma, percentagem de esperma móvel e percentagem de esperma com morfologia normal, juntamente com os parâmetros de movimento do esperma. Vários estudos revelaram que homens expostos à OP tinham alto risco de desenvolver parâmetros anormais de sêmen, incluindo diminuição da concentração de esperma, diminuição da motilidade espermática, diminuição da contagem de esperma e maior aneuploidia dos cromossomos sexuais no esperma. Um estudo realizado na China com diferentes OP mostrou uma clara relação entre a presença de metabólitos inseticidas urinários e a concentração de esperma e a motilidade espermática em homens recém casados . Estudos in vitro realizados com OP forneceram evidências de que estes pesticidas poderiam danificar o DNA no esperma humano, causando assim efeitos genotóxicos .

entre as OPs amplamente utilizadas e tóxicas no Sri Lanka, o acefato (O,S-dimetilfosforamidotioato de acetilo) é um inseticida, utilizado na agricultura e em fins domésticos devido à sua propriedade inseticida de amplo espectro. O acefato é um inseticida sistêmico com ação de contato e estômago. O mecanismo tóxico do acefato é atribuído não só à inibição da acetilcolinesterase (AchE), mas também à ação como um agente neurotóxico retardado. Sing e Jiang relataram que o acefato é um potente composto neurotóxico, mutagênico, carcinogênico e citotóxico. Da mesma forma, Farag et al. revelaram que doses de 14 e 28 mg/kg/dia de acefato diminuíram a motilidade espermática e a contagem de espermatozóides em camundongos adultos do sexo masculino. Outros dois estudos confirmaram que o acefato diminui significativamente a fertilidade, a dinâmica espermática, o peso dos órgãos sexuais e os hormônios sexuais em ratos albinos machos. Portanto, similar a outros OPs, há um risco potencial deste composto para a saúde reprodutiva de humanos.

O acefato é amplamente utilizado por agricultores no Sri Lanka, que estão em sua idade fértil. Nas últimas duas a três décadas, tornou-se claro que a exposição ocupacional a pesticidas pode afetar a fertilidade dos homens, indicando assim altos riscos de exposição desses jovens agricultores. A regulamentação dos pesticidas baseia-se principalmente em modelos animais e os dados sobre a exposição humana e a qualidade do sémen continuam a ser esparsos e limitados. Portanto, o presente estudo foi realizado para investigar os efeitos do acefato na fertilidade masculina humana e na integridade do DNA de espermatozóides in vitro.

2. Materiais e Métodos

2.1. Material de teste

Acefato não-formulado (nome comercial: Surrender; fórmula molecular: C4H10NO3PS; peso molecular: 183,16 g/mol; pureza: 99,0%; dosagem de campo recomendada pelo fabricante: 1 g de acefato em 1 L de água) foi obtido da Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Como o acefato é facilmente solúvel em Biggers Whitten Whittingham (BWW), ele foi usado como controle.

2.2. Colheita e Preparação de Sémen

Amostras de sémen foram colhidas de doadores masculinos saudáveis (idade 20-30 anos) da Universidade do Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, num frasco de amostra estéril. Antes da coleta de sêmen, os doadores receberam uma folha de informação e um formulário de consentimento, buscando sua disposição para participar do estudo. Todos os sujeitos participantes foram convidados a abster-se de qualquer actividade sexual durante 3 a 5 dias antes da colheita de sémen. Foram selecionados para o estudo homens (idade média de ) com concentração de esperma normal, motilidade, morfologia, viscosidade, tempo de liquefação, pH e ausência de formas imaturas e leucócitos. Os parâmetros espermáticos (motilidade, vitalidade, teste de inchaço hipoosmótico e morfologia) foram avaliados de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde. Como os efeitos do acefato poderiam aumentar com espermatozóides anormais, é importante selecionar doadores com qualidade de esperma aceitável para o estudo.

Aprovação ética (Ethical clearance ref. nnumber: 712/13) foi obtida pelo Comitê de Revisão Ética, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2,3. Determinação dos níveis de dose

Para determinar os níveis de dose, foi realizado o valor LD50 de acefato para a motilidade do esperma. Assim, foi preparada uma amostra com 1 mg de acefato em 1 mL de BWW, o que equivale à dose de campo recomendada (1 g de acefato em 1 L de água) de acefato. As amostras preparadas foram subsequentemente diluídas com BWW para obter diferentes concentrações de acefato. As suspensões espermáticas (fixadas a 50 × 106 espermatozóides/mL) foram colocadas em tubos Eppendorf e o volume desejado de BWW ou solução de teste foi adicionado (o volume final do tubo é igual a 1 mL). As amostras foram cuidadosamente misturadas e incubadas durante 1 h numa incubadora humidificada (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japão) a 37°C em 5% de CO2. Após a incubação, a motilidade percentual de espermatozóides foi determinada em cada concentração por dois observadores independentes sob o microscópio Olympus com óptica de contraste de fase (X 400; Olympus Corporation, Japão). Com base neste levantamento piloto para determinar indicações de doses tóxicas para amostras de sémen, foi revelado que o valor de LD50 para acefato é de 200 μg/mL. Assim, concentrações subletais abaixo de LD50 incluindo o valor de LD50 foram utilizadas no presente estudo.

Dados abaixo estão os níveis de dose selecionados para o presente estudo: Dose alta: 200 μg/mL (equivalente ao valor de LD50). Dose média: 100 μg/mL. Dose baixa: 50 μg/mL. Além disso, decidimos estender os pontos de tempo de 1 h para 2 h e 3 h para determinar os efeitos prolongados da exposição ao acefato.

2.4. Incubação de pesticidas

Amostras de sémen fresco () foram diluídas com BWW para obter uma concentração final de esperma de 40 × 106 espermatozóides/mL. Posteriormente, as amostras foram incubadas com pesticida em concentrações de 50, 100 e 200 μg/mL ou com BWW. As incubações foram realizadas em 1 mL de volume final para 1, 2, e 3 h a 37°C em uma incubadora (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japão) em atmosfera de 5% CO2 e 95% O2.

2.5. Determinação da Motilidade dos Espermatozóides

Total espermatozóides móveis foram estimados (aproximadamente 100 células) por dois observadores independentes sob óptica de contraste de fase (X 400; Olympus Corporation, Japão). A motilidade percentual para frente foi calculada.

2,6. Ensaio de Citotoxicidade

A viabilidade dos espermatozóides foi avaliada usando a técnica de coloração Eosin Y e os espermatozóides mortos e vivos foram calculados. Percentagem de viabilidade = (número total de células – número de células coradas/número total de células) × 100. Número total de células = 100,

2,7. Determinação da Integridade Funcional da Membrana Plasmática de Espermatozóides

A integridade funcional da membrana plasmática de espermatozóides foi avaliada usando o teste de Hipoosmotic Swelling (HOS) descrito por Jeyendran et al. . Pelo menos 100 espermatozóides foram contados por preparação.

2,8. Determinação da Capacitação

Uma alíquota de 150 μL do meio de cultura de PVB foi colocada em um prato de cultura pré-aquecido (35 × 10 mm, Corning, Nova York, EUA) e coberto com uma lamela pré-aquecida de 22 × 22 mm. Uma alíquota de 20 μL de amostra de esperma foi adicionada a um canto da lamela. O prato de cultura foi colocado num microscópio invertido (Diaphot, Nikon, Londres, Reino Unido) equipado com um armário aquecido a ar controlado termostaticamente (Nikon, Londres, Reino Unido), equilibrado a 37°C. O estado de capacidade de esperma foi avaliado com base na hiperactivação pelo método fotográfico objectivo usando um microscópio de contraste de fase Olympus IX71. Como a hiperactivação é um fenómeno de flagelo, é possível avaliar visualmente a hiperactivação com base na motilidade do esperma; os padrões de movimento de flagelo foram avaliados para a contagem de esperma não hiperactivado e hiperactivado. Os experimentos foram realizados em duplicata e repetidos independentemente quatro vezes.

2,9. Determinação de danos de DNA em espermatozóides

Espermatozóides foram preparados em lâminas microscópicas limpas e a percentagem de espermatozóides com DNA normal foi determinada contando 500 espermatozóides sob microscopia de fluorescência (BH-2, Olympus Ltd., Japão) com excitação de 490 nm. O período de tempo de observação para um único campo levou menos de 40-50 segundos. O esperma que exibia amarelo a vermelho foi pontuado como ADN desnaturado e o esperma que exibia verde foi pontuado como ADN normal .

2,10. Análise estatística

Contagem de esperma de machos adultos foram normalmente distribuídos e comparados entre grupos com análise de variância bidirecional (ANOVA) usando o pacote de software Minitab (Minitab Co., EUA) para o efeito principal de pesticidas. Quando um efeito de tratamento significativo foi encontrado, as diferenças entre as médias dos grupos individuais foram testadas por “Tukey 95%”. Os dados são expressos como média ± Média de Erro Padrão (SEM). o valor foi definido como .

3. resultados

3.1. Motilidade do esperma

Quando comparado com o controle, a motilidade percentual foi significativamente () reduzida (Tabela 1) na dose média (100 μg/mL) em 16% após 3 h de incubação. Em contraste, a redução altamente significativa () foi registrada em 200 μg/mL após 1 h, 2 h e 3 h de incubação, quando comparada com os controles. Além disso, a redução da motilidade é clara em cada dose com o aumento do tempo de incubação.

3.2. A citotoxicidade

Percentagem de viabilidade foi reduzida (Tabela 1) em todos os grupos de tratamento com o tempo, mas uma redução significativa (em 20%; ) foi registrada em 200 μg/mL (dose alta) após 2 h após a incubação, quando comparada aos controles. Redução altamente significativa () foi registrada em dose alta após 3 h de incubação e foi diminuída em 31% quando comparada aos controles.

3,3. Integridade Funcional da Membrana de Plasma Espermatozóide

Tabela 1 apresenta os resultados da integridade funcional das células espermáticas após 1 h, 2 h, e 3 h de incubação. Foram registradas reduções significativas () da integridade funcional em dose média por 13.5% após 3 h e também em dose alta em 26% após 2 h de incubação quando comparado com seus controles. A redução altamente significativa () foi registrada em alta dosagem (em 35%) após 3 h de incubação.

3,4. Capacitação espermática

Redução em espermatozóides capacitados foi observada em todos os grupos de tratamento (Tabela 1). A porcentagem de espermatozóides capacitados foi significativamente reduzida () em 100 μg/mL dose em 18% após 3 h de incubação e em alta dose em 32%, 36% e 38%, respectivamente, após 1 h, 2 h e 3 h de incubação.

3,5. Danos de DNA em Espermatozóides

Percentagem de DNA danificado na contagem de espermatozóides foi aumentada com o aumento da dosagem e do tempo de incubação. Mas um aumento significativo () dos danos no ADN só foi registado em doses elevadas (em 33%) após 3 h de incubação. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.

4. Discussão

Insseticidas OP são amplamente utilizados no Sri Lanka com pouca ou nenhuma proteção pelos usuários e os indivíduos estão, portanto, em alto risco de exposição. Além disso, estes agricultores em suas idades reprodutivas mais elevadas estão inevitavelmente expostos durante um longo período de tempo. O presente estudo foi concebido para demonstrar a associação entre o acefato, uma OP com qualidade de sémen, e danos no DNA do esperma em diferentes pontos do tempo de incubação. Os resultados obtidos neste estudo indicaram que o acefato prejudica a motilidade espermática, a viabilidade espermática, a integridade membranar e a capacidade espermática e induziu danos no DNA in vitro. Resultados semelhantes foram obtidos com hidrocarbonetos clorados, organofosforados e metabolitos do benzeno .

A redução significativa da mobilidade espermática observada tanto em doses médias (100 μg/mL) como altas (200 μg/mL) de acefato poderia resultar em comprometimento da capacidade de fertilização do esperma . Após 3 h de exposição à dose mais elevada, a percentagem de motilidade dos espermatozóides foi reduzida abaixo dos valores recomendados pela OMS. A motilidade dos espermatozóides é considerada um dos detectores mais sensíveis dos efeitos citotóxicos dos espermatozóides e redução da capacidade de fertilização dos espermatozóides. Alterações no potencial da membrana mitocondrial por diferentes pesticidas podem levar à redução da motilidade do esperma. A motilidade do esperma também depende da intensa transformação e do gasto energético produzido através das vias oxidativas das mitocôndrias e os pesticidas podem interferir com as vias oxidativas, produzindo um atraso na motilidade do esperma, levando eventualmente à morte celular. Além disso, os metabólitos de pesticidas poderiam interferir com as reações oxidativas mitocondriais levando à produção de excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS), diminuindo a produção de ATP, resultando em deficiências de motilidade . O estresse oxidativo tem sido relatado como sendo o mecanismo primário do organofosforado, incluindo a toxicidade do acefato. A perda de integridade pode levar a um aumento da permeabilidade da membrana e perda da capacidade de regular as concentrações intracelulares de íons envolvidos no controle do movimento dos espermatozóides . O efeito global da lesão da membrana pode ser responsável pela diminuição contínua da motilidade e viabilidade dos espermatozóides após a ejaculação .

A viabilidade é a proporção de espermatozóides vivos determinada pela avaliação da integridade celular e ou da membrana . O teste de coloração de Eosin forneceu informações sobre a integridade estrutural da membrana espermática, enquanto o teste HOS forneceu informações sobre a integridade funcional da membrana espermática . A viabilidade dos espermatozóides está associada a membranas de plasma intactas, funcionais e semipermeáveis . Pesticidas podem induzir aumento de íons de cálcio causando danos às membranas espermáticas, afetando assim a viabilidade dos espermatozóides muito antes de atingirem o oócito . Alterações na membrana plasmática observadas no presente estudo podem resultar na redução da motilidade, viabilidade e integridade da membrana dos espermatozóides .

A hiperactivação é uma indicação de conclusão da capacitação espermática e é essencial para a penetração através da massa do cúmulo e da zona pelúcida . No presente estudo foi demonstrado que os espermatozóides hiperativados diminuíram em alta concentração e diminuíram com o aumento do tempo de incubação, indicando uma diminuição da capacidade de espermatozóides. A membrana espermatozóide e as mitocôndrias são essenciais para a hiperactivação e qualquer dano na membrana espermatozóide e nas mitocôndrias espermatozóides pode levar a uma redução da capacidade espermatozóide. Sabe-se que a OP prejudica a capacidade através da inibição da AchE quando incubada com espermatozóides in vitro . No entanto, com a adição de quantidades suficientes de AchE ou AchE imitam as enzimas no meio, o efeito foi revertido, indicando assim a importância da atividade de AchE da membrana do espermatozóide para iniciar a capacitação.

O presente estudo revela um dano significativo ao DNA de dupla cadeia na dose mais alta (200 μg/mL) após 3 h de incubação. A integridade do DNA do esperma é vital para transmitir informação genética durante a reprodução e qualquer dano ao DNA poderia resultar em infertilidade . As bases de ADN e os espermatozóides fosfodiéster são particularmente susceptíveis a danos induzidos pelo stress oxidativo porque as suas membranas plasmáticas contêm grandes quantidades de ácidos gordos polinsaturados e o seu citoplasma contém baixas concentrações de enzimas necrófagos . Assim, níveis elevados de ROS poderiam resultar em quebras de DNA de dupla cadeia comumente observadas nos espermatozóides de homens inférteis . Tem sido registrado que o acefato aumenta significativamente as espécies de oxigênio reativo celular (ROS) resultando em modificações do DNA ao formar erros de par de base e quebras de cordão . Os espermatozóides fragmentados de DNA são menos móveis e menos susceptíveis ao inchaço hipoosmótico, o que indica uma menor integridade funcional da membrana do espermatozóide, levando assim a uma redução da função espermática com aumento dos danos no DNA . Pesticidas que induzem danos de DNA em leucócitos também podem levar a danos de DNA em espermatozóides .

5. Conclusões

O presente estudo sugere um possível comprometimento da função do esperma com a exposição ao acefato. A alta concentração de acefato (200 μg/mL, que é equivalente a LD50) testada neste estudo alterou a motilidade do esperma humano, viabilidade, integridade funcional da membrana plasmática e capacitação espermática e danos ao DNA induzidos in vitro. Após considerar os resultados e as respostas biológicas humanas naturais, tais como degradação e depuração de produtos químicos, poderia ser recomendado que a dose testada em doses superiores (200 μg/mL) e superiores pudesse causar um risco para a saúde humana.

A abreviaturas

BWWW:	Biggers Whitten Whittingham
HOS:	Solução hipoosmótica
NaCl:	Cloreto de sódio
OP:	Pesticida organofosforado
ROS:	Espécies reativas de oxigênio.

Aprovação ética

Aprovação ética foi obtida do comité de revisão ética, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka. O número de aprovação ética é 712/13.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação à publicação deste trabalho.

Confirmações

Assistência valiosa dada pela Professora Neelika Malavige, Departamento de Microbiologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Sri Jayewardenepura, por fornecer incubadora de dióxido de carbono e Departamento de Zoologia, Faculdade de Ciências, Universidade de Colombo, por fornecer produtos químicos para o projeto é altamente apreciada.