Efeitos das estatinas na Angiogênese e Vasculogênese | Revista Española de Cardiología

INTRODUÇÃO

As estatinas inibem a atividade da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, uma enzima que catalisa a síntese do mevalonato, a etapa limitante da biossíntese do colesterol.1 A redução resultante no colesterol intracelular leva a um aumento compensatório na absorção de colesterol pelos receptores de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e a uma diminuição do colesterol plasmático. A descoberta das estatinas e sua aplicação em indivíduos com altas concentrações de colesterol tornou possível melhorar muito a prevenção primária e secundária da doença arterial coronariana.2,3 Recentemente, a eficácia das estatinas na prevenção primária e secundária da doença arterial coronariana também tem sido observada em indivíduos com níveis mais baixos de colesterol.4-6 Além de reduzir o colesterol LDL (C-LDL), as estatinas têm uma série de efeitos pleiotrópicos em vários componentes da aterosclerose, incluindo a função endotelial, migração celular, inflamação e a tendência trombótica da placa.7-12 Em animais normocholesterolemicos tem sido demonstrado que as estatinas têm um efeito protetor contra lesões de isquemia-reperfusão do músculo cardíaco, provavelmente através de mecanismos relacionados à produção de óxido nítrico (NO) pelo endotélio.13

A proteína serina/teronina quinase Akt ou proteína quinase B (PKB) é um regulador intracelular multifuncional de sobrevivência celular, crescimento e metabolismo 14 (Figura 1). Em relação às suas funções cardiovasculares, o Akt/PKB atua na via intracelular estimulada pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)14,15 e pela angiopoietina16-18, promovendo a sobrevida celular e garantindo o desenvolvimento vascular adequado.19 A ativação constitutiva da sinalização do Akt protege os cardiomiócitos contra apoptose nas lesões de isquemia-reperfusão.20 Além de seu efeito citoprotetor, o Akt atua como ativador da produção de NO pelo endotélio em resposta ao VEGF e cisalhamento através de sua capacidade de fosforilatar a óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) em serinas 1179 ou 1177,21,22, controlando assim o tônus vasomotor.23 Por outro lado, o Akt é essencial na migração das células endoteliais para o foco produtor de VEGF.24 Portanto, a capacidade do Akt de mediar a sobrevivência celular, a produção de NO e a migração induzida por VEGF sugere que a proteína quinase Akt pode mediar a resposta endotelial a estímulos angiogênicos.

Fig. 1. Estatinas, sinalização Akt e angiogénese/vasculogénese. Angiopoietina 1 (Ang-1), VEGF e fator de crescimento do fibroblasto (FGF), quando ligados aos seus receptores de membrana, induzem a conversão do 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2) em fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) por fosfatidilinositol 3-cinase (PI3K). A formação de PIP3 é necessária para a fosforilação da proteína kinase do Akt pelo PDK-1 kinase. O tratamento com estatina aumenta a fosforilação do Akt, enquanto que a wortmanin (um inibidor da proteína PI3K) a impede. O Mevalonate, o produto da HMG-CoA redutase, também inibe a PI3K e a subsequente fosforilação do Akt. Portanto, as estatinas, ao inibirem a HMG-CoA redutase e a produção do mevalonato, aumentam a fosforilação do Akt e, ao mesmo tempo, a fosforilação e ativação da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), a síntese do óxido nítrico (NO) e uma variedade de efeitos fisiológicos induzidos na angiogênese e vasculogênese. O Akt também previne a apoptose das células endoteliais.

Foi demonstrado recentemente que as estatinas também estimulam a via de sinalização intracelular da proteína cinase Akt/PKB25-27 em células endoteliais25 e as células progenitoras endoteliais (EPC) da medula óssea,26,27 induzindo assim tanto a angiogênese25 como a vasculogênese.26 Os efeitos das estatinas na cinética da EPC também foram demonstrados em humanos por Vasa et al.28 Este artigo revisa o efeito das estatinas na indução de angiogênese25 e vasculogênese26 através de mecanismos relacionados à ativação do Akt.25-27

ANGIOGENESE E VASCULOGENESE

Angiogênese e vasculogênese são responsáveis pelo desenvolvimento do sistema vascular no embrião.29-32 Vasculogênese é o processo de formação de vasos sanguíneos a partir de células progenitoras endoteliais (angioblastos) que migram e se fundem com outras células progenitoras endoteliais e se diferenciam em células endoteliais enquanto formam novos vasos sanguíneos. Em contraste, a angiogênese é o processo de extensão dos vasos sanguíneos que se formaram pela formação de novos capilares através da migração e proliferação de células endoteliais previamente diferenciadas (Figura 2).

Fig. 2. Representação esquemática da angiogénese e vasculogénese. (A) Vasculogênese é a agregação de angioblastos ou células progenitoras endoteliais para formar vasos sanguíneos. Os angioblastos coalescem in situ ou migram para formar vasos sanguíneos em locais distantes. (B) A angiogênese é a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes pela proliferação e migração de células endoteliais diferenciadas. (C) A angiogênese e a vasculogênese também podem ocorrer simultaneamente. (Extraído de Cleaver et al.29)

Pensava-se inicialmente que o processo vasculogênico era restrito ao desenvolvimento embrionário, enquanto a angiogênese (que também ocorre no embrião) era o único processo envolvido na neovascularização em adultos. Entretanto, o paradigma da neovascularização pós-natal foi revisto recentemente e descobriu-se que as células progenitoras endoteliais que circulam no sangue periférico33 são incorporadas por focos de neovascularização em animais adultos34 , aumentam em número em resposta à isquemia tecidual35 e promovem o desenvolvimento de vasos sanguíneos colaterais após sua expansão in vitro e posterior transplante36. Esses estudos estabeleceram que tanto a angiogênese quanto a vasculogênese são responsáveis pela neovascularização em adultos.

Um terceiro mecanismo que provavelmente contribui para o desenvolvimento dos vasos colaterais é o aumento do tamanho e do calibre das conexões arteriolares colaterais pré-existentes, um processo chamado arteriogênese.37 A presença e o número desses vasos colaterais nativos variam muito entre indivíduos e espécies. Quando um vaso se oclui, há um aumento da velocidade do fluxo sanguíneo através dos vasos colaterais pré-existentes e um aumento da tensão de cisalhamento luminal, fatores que contribuem para a maturação dos vasos colaterais, particularmente os de tamanho intermediário.

Métodos de estudo in vitro

O desenvolvimento de técnicas para o cultivo de células endoteliais tornou possível compreender os processos envolvidos na angiogênese.38 As células endoteliais em cultura retêm a capacidade de responder a fatores que estimulam ou inibem a angiogênese, bem como a capacidade de formar tubos endoteliais in vitro. Os ensaios de proliferação celular permitem analisar o efeito de uma determinada substância sobre a proliferação celular endotelial. A migração das células endoteliais para uma solução contendo uma determinada substância, separada por uma membrana permeável, pode ser examinada em uma câmara de Boyden. Os mecanismos de formação endotelial tubular e o efeito de uma determinada substância sobre os túbulos podem ser estudados através de ensaios bidimensionais ou tridimensionais. Com estas técnicas, os processos de formação da luz endotelial e a influência da matriz extracelular no desenvolvimento capilar são analisados.38 Finalmente, culturas de células endoteliais permitem o estudo das vias moleculares envolvidas nos processos de angiogênese.

Recentemente, usando técnicas de seleção celular e meios especiais de cultura, técnicas desenvolvidas para estudar células endoteliais diferenciadas têm sido usadas para estudar células progenitoras endoteliais.33-36

Métodos de estudo in vivo

Embora as técnicas in vitro permitam uma análise preliminar da angiogénese e vasculogénese, muitos factores que podem influenciar ou modular estes processos in vivo.38 A fim de estudar os mecanismos de formação de vasos sanguíneos in vivo, diferentes sistemas biológicos foram desenvolvidos para quantificar ou demonstrar o efeito de uma determinada substância: modelos de córnea de camundongo, membrana corioalantóide embrionária de galinha ou implantes esponjosos.38 Estes sistemas requerem o sacrifício do animal para que apenas capturem o efeito em um momento específico. A fim de estudar a evolução temporal dos eventos em um único tecido, foram desenvolvidas técnicas de microscopia intravital para a pele do dorso ou crânio do camundongo.39 Finalmente, o desenvolvimento de técnicas de engenharia genética tornou possível estudar o efeito da supressão (knock-out) ou adição (knock-in) de um gene aos processos de vasculogênese e angiogênese.

O estudo da vasculogênese pós-natal e o efeito de certas substâncias nos processos de vasculogênese tem sido possível graças ao uso de técnicas de citometria de fluxo, seleção celular ativada por fluorescência (FACS), técnicas especiais de cultivo de células progenitoras endoteliais (EPC) do sangue periférico e modelos de transplante de medula óssea murina.33-36 FACS é usado para detectar e quantificar EPC no sangue periférico usando anticorpos contra os antígenos de superfície destas células. A influência de medicamentos ou fatores de crescimento no número dessas células no sangue periférico pode ser analisada desta forma. As técnicas especiais de seleção e cultura de células desenvolvidas pelo nosso grupo também possibilitaram a detecção e quantificação da EPC. No modelo murino de transplante de medula óssea, as células da medula óssea de um doador de camundongos são transplantadas para um receptor de camundongos com um gene que codifica a elaboração de uma substância que permite a sua detecção posterior (Figura 3). No nosso caso o gene codificou a elaboração da beta-galactosidase por células endoteliais. A expressão seletiva é obtida porque este gene é regulado por um promotor específico de células endoteliais, Tie-2, no doador de camundongos. Portanto, somente as células endoteliais da medula óssea do doador do animal expressarão a beta-galactosidase que pode ser detectada no receptor do animal. Se os experimentos biológicos descritos acima forem realizados após o transplante de medula óssea no receptor animal, podemos analisar a influência de determinada substância na vasculogênese quantificando o número de células progenitoras endoteliais derivadas da medula óssea.

Fig. 3. Modelo murino de transplante de medula óssea para o estudo da vasculogênese. Os doadores de medula óssea utilizados são ratos transgênicos que expressam constitutivamente o gene LacZ (que codifica a beta-galactosidase) regulado por um promotor endotelial específico, o Tie-2. A medula óssea é extraída e transplantada para um receptor de rato cuja medula óssea tenha sido subleticamente irradiada. Após um período de 4 semanas para conseguir a reconstituição da medula óssea transplantada, uma ou mais intervenções são feitas no receptor do rato (o caso mostrado é um modelo córneo) para estimular a neovascularização. Após estas intervenções, os animais são sacrificados e é feito um estudo histológico para detectar a expressão da beta-galactosidase. Com a coloração X-GAL, as células que expressam a beta-galactosidase adquirem uma cor azulada. O uso de um promotor específico para células endoteliais permite que as células azuis que foram incorporadas em focos de neovascularização sejam identificadas como células de linhagem endotelial.

Efeito das estatinas na INDÚSTRIA DA ANGIOGENESE E VASCULOGENESE

Investigações feitas em nosso laboratório e em outros lugares têm demonstrado que as estatinas estimulam a via de sinalização intracelular da proteína cinase Akt/PKB,25-27 que promove tanto a angiogênese25 quanto a vasculogênese.26 Além disso, Vasa et al também têm sido capazes de demonstrar em humanos os efeitos das estatinas na cinética da EPC.28

Efeitos in vitro das estatinas

As estatinas ativam rapidamente a proteína cinase Akt/PKB em células endoteliais25 e EPC,26,27 aumentando assim a fosforilação da eNOS e a subsequente produção de NO. A ativação do Akt pelas estatinas promove a proliferação, migração e sobrevivência celular das células endoteliais e da EPC, bem como a formação da estrutura vascular. Além disso, a inibição do Akt pelo uso de adenovírus que codificam as formas negativas dominantes de Akt causa inibição dos efeitos induzidos pelas estatinas. O potencial das estatinas nos processos de regeneração tecidual foi demonstrado anteriormente nos osteoblastos. Nessas células, as estatinas aumentaram a proliferação e o nível de atividade, conseqüentemente aumentando a formação óssea.40

Embora os mecanismos de ativação do Akt pelas estatinas não sejam conhecidos com precisão, é provável que a sinalização do fosfatidilinossitol 3-quinase (PI3K) esteja envolvida, pois esse processo é bloqueado pelo wortmanin e LY294002, dois inibidores da enzima (Figura 1). Além disso, a inibição da HMG-CoA redutase é necessária, pois a ativação do Akt pela sinvastatina foi inibida pela adição de mevalonate à incubação (Figura 1). O mevalonato é necessário, não apenas para a biossíntese do colesterol, mas também na produção de ubiquinona, dolicols e isoprenoides, que são essenciais em vários processos celulares. Embora as estatinas estabilizem o RNA mensageiro (mRNA) da eNOS modificando a síntese de isoprenoides41 , não observamos alterações nos valores de eNOS da síntese protéica. Neste sentido, é importante ressaltar que o aumento na concentração de mRNA foi posterior (24 h) à ativação da fosforilação da eNOS pelo Akt (15 min). Este menor tempo de ativação é consistente com as mudanças induzidas pelas estatinas na produção de NO e na vasodilatação observada nos anéis aórticos ex vivo.42

Efeitos in vivo das estatinas

As estatinas e a ativação da sinalização intracelular do Akt promovem angiogênese em modelos de isquemia periférica desenvolvidos em coelhos normocholesterolemicos.25 Em animais que receberam estatinas, foram observadas maiores pressões de perfusão, maior número de vasos colaterais e maior densidade capilar (Figura 4). Por outro lado, as estatinas aumentam o número de células progenitoras endoteliais no sangue periférico tanto em camundongos26,27 quanto em humanos.28 Além disso, as estatinas aumentam a neovascularização corneana em camundongos normocholesterolemicos, em parte devido à vasculogênese da EPC obtida a partir da medula óssea (Figuras 3 e 5).26 Utilizando o modelo murino de transplante de medula óssea, foi possível demonstrar um maior número de EPC a partir da medula óssea nas córneas de camundongos tratados com estatinas. Portanto, as estatinas têm um efeito importante na cinética EPC, como já havia sido demonstrado anteriormente com VEGF ou fator estimulante de granulócitos e monócitos-colônia (GM-CSF),35 e a mobilização dessas células induzida por estatinas poderia aumentar a neovascularização pós-natal.

Fig. 4. Aumento da neovascularização da perna de um coelho induzido por estatina em resposta à ressecção unilateral da artéria femoral. a) A artéria femoral e seus ramos são dissecados. A transferência genética para endotélio é feita por infusão de adenovírus que codificam a beta-galactosidase (Ad-βgal) ou Akt (Ad-myrAkt) na artéria femoral distal e incubação durante 15 min enquanto se clampa temporariamente a veia femoral. b) No terceiro dia, o músculo gastrocnêmio é extraído e a coloração X-GAL é feita para determinar a distribuição transgênica em preparações histológicas coradas com hematoxilina-eosina. c) A angiografia através da ilíaca interna é feita para analisar a formação de vasos colaterais em diferentes grupos de tratamento. Nas angiografias feitas aos 40 dias, é visível um aumento na formação de vasos colaterais nos animais que receberam 0,1 mg/kg de simvastatina por injeção intraperitoneal, em comparação com os animais que intervieram, mas que foram apenas injetados soro fisiológico. A análise quantitativa dos vasos colaterais foi feita no grupo controle, no grupo tratado com simvastatina e no grupo de animais que receberam injeção intramuscular de Ad-VEGF. O escore angiográfico foi analisado nos grupos experimentais que receberam infusão de solução salina, Ad-βgal e Ad-myrAkt 31 dias após a cirurgia. d) A coloração para fosfatase alcalina no músculo adutor da perna isquêmica revelou uma maior densidade capilar no grupo de animais tratados com sinvastatina em relação ao grupo controle 40 dias após a cirurgia. Os dados de cada experimento são apresentados como média±SD (n=6 coelhos em cada um dos grupos de tratamento, *P25)

Fig. 5. Aumento da neovascularização corneana por vasculogênese induzida por estatinas. a) Fotos representativas mostrando neovascularização corneana (esquerda, veículo; direita, simvastatina). b) Coloração X-gal de córneas inteiras. Os pontos azuis são células que expressam beta-galactosidase (esquerda, veículo; direita, sinvastatina). c) Microfotografias representativas do estudo histoquímico da fluorescência em córneas com parafina de camundongos Tie2/LacZ/BMT (esquerda, veículo; direita, sinvastatina). A presença de células duplamente positivas é uma evidência de que células progenitoras endoteliais (EPC) obtidas da medula óssea foram incorporadas pelos focos de neovascularização (vasculogênese). A cor vermelha neste caso indica beta-galactosidase e a cor verde mostra o marcador endotelial específico isolectina B4. As células duplamente positivas (cor amarela) são EPC obtidas da medula óssea que foram incorporadas pelos novos vasos. d) Microfotografias representativas do estudo histoquímico da fluorescência em córneas inteiras de ratos Tie2/LacZ/BMT (esquerda, veículo; direita, simvastatina). A cor vermelha mostra beta-galactosidase e a cor verde mostra o marcador endotelial específico da lectina BS-1. e) Quantificação da EPC derivada do transplante incorporado na neovasculatura. Expresso como a razão entre o número de EPC e o número total de células endoteliais que formam os novos vasos. *P26)

CONCLUSÕES

As estatinas promovem a proliferação, migração e sobrevivência celular das células endoteliais e EPC obtidas da medula óssea através de mecanismos relacionados com a ativação da proteína serina/treonina kinase Akt ou PKB. De forma semelhante ao VEGF, as estatinas promovem a angiogênese e a vasculogênese. Portanto, a ativação do Akt pode ser responsável por alguns dos efeitos benéficos das estatinas, incluindo a neovascularização pós-natal.