EMBL – Laboratório Europeu de Biologia Molecular
Informações sobre a forma e a conformação de uma proteína, bem como a interacção entre macromoléculas podem ser obtidas a partir dos coeficientes de sedimentação e difusão obtidos a partir de uma experiência de velocidade de sedimentação. Os coeficientes de sedimentação são particularmente úteis para monitorar mudanças na conformação de uma proteína. O modelo resultante para a forma geral da proteína ou complexo proteico pode ser comparado com imagens obtidas por microscopia eletrônica para avaliar como essas imagens são aplicáveis ao comportamento dessas partículas em solução.
Associação
Outros métodos para o estudo de processos de ligação, o método de equilíbrio de sedimentação é particularmente sensato para o estudo de associações relativamente fracas com constantes de associações (Ka) na ordem de 10-100 M-1. No entanto, também podem ser estudados processos de ligação com valores de Ka significativamente superiores a 107 M-1.
O Instrumento
A ultracentrifugadora analítica que temos no EMBL é uma Beckman Optima XL-A. O instrumento gira a amostra de proteína sob vácuo a uma velocidade e temperatura controladas enquanto regista a distribuição de concentração em tempos definidos. Dependendo do rotor, a velocidade pode ser de até 60.000 rpm (que equivale a 250.000 x g). Para as medições são utilizadas células especiais para suportar o alto campo gravitacional e que permitem a passagem de luz através da amostra. A amostra real é colocada numa cavidade em forma de sector, colada entre duas janelas de quartzo (ver figura 1). Esta cavidade está localizada numa peça central de liga de alumínio ou epóxi reforçado. As células de sector duplo também são utilizadas para poder corrigir a absorção do solvente da amostra. Estas células também permitem a medição das diferenças do coeficiente de sedimentação e dos coeficientes de difusão. As peças centrais têm um comprimento de onda de 3 a 12 mm que combinado com com comprimentos de onda selecionáveis permite o exame de uma ampla gama de concentrações da amostra. Para saber como montar uma célula, vá para o protocolo de montagem.