Entendendo a base estrutural da restrição do HIV-1 pelo comprimento total do domínio duplo…domínio APOBEC3G

Características estruturais gerais do fl rA3G

Uma das maiores barreiras nos estudos estruturais das proteínas do fl de domínio duplo APOBEC tem sido a solubilidade pobre – as formas do tipo selvagem são frequentemente purificadas como oligómeros não homogéneos ou grandes agregados com maior concentração. A fim de obter uma fl A3G bem comportada para a determinação estrutural, nós selecionamos homólogos A3G de diferentes espécies de primatas e descobrimos que A3G de macaco rhesus (rA3G) tinha melhorado a solubilidade. Duas construções mutacionais fl rA3G (denominadas FKL e E/Q) produziram proteínas e cristais bem-comportados em diferentes condições (Tabela Complementar 1) que difrataram para 2,47 e 2,40 Å, respectivamente, (Tabelas Complementares 1 e 2, Fig. Complementar 1). Alterações adicionais nestas duas construções melhoraram a solubilidade e o rendimento do rA3G, incluindo a substituição de uma alça CD1 8 de 8-resíduos pela alça CD1 8 de 4-resíduos do hA3G-CD2 (como nas construções E/Q e FLK, Tabela Suplementar 1, Suplemento Fig. 1). 1), outras mutações F126Y no laço CD1 7, K180S/L184S no CD1 h6, e 8-residue delete do laço CD2 3 (como na construção FKL, Tabela Suplementar 1, Suplementar Fig. 1B). Deve-se notar que K128 do rA3G que atua como barreira para a transmissão de espécies cruzadas é mutado para um resíduo de ácido aspártico (D128) como no A3G humano (hA3G)36. As construções também contêm o catalisador E259 a mutação Q/A para evitar toxicidade potencial durante a expressão da proteína recombinante. Os resíduos mutantes e suas localizações na estrutura são mostrados na Fig. 1B suplementar. Em ambas as estruturas, CD1 e CD2 são dobrados em domínios isolados ligados por um pequeno linker de 5 resíduos (resíduos R194 a D198) (Fig. 1a, b). As duas estruturas, apesar da semelhança estrutural geral (Fig. 1a, b), mostram diferenças óbvias nas conformações CD2 e na orientação da embalagem entre CD1 e CD2 (Fig. 1c, Suplemento Fig. 2A).

As estruturas rA3G FKL e E/Q têm a mesma estrutura canônica CD1 e se sobrepõem bem uma sobre a outra (Fig. 2B Suplementar, rmsd de 0,445 Å). As diferenças conformacionais muito maiores em cada domínio CD2 resultam em uma sobreposição rmsd de 0,862 Å. Ao alinhar as estruturas FKL e E/Q através de seu domínio CD1, o domínio CD2 da estrutura E/Q mostra uma rotação de ~29° em relação ao CD2 da estrutura FKL, fazendo com que o domínio E/Q CD2 se desloque ~15 Å para baixo e ~8 Å para CD1, resultando em uma interação de empacotamento muito mais próxima com CD1 (Figura Complementar 2A). A interface geral de empacotamento CD1-CD2 tem uma superfície enterrada de ~623 Å2 para a estrutura FKL e ~700 Å2 para a estrutura E/Q. O empacotamento mais apertado CD1-CD2 na estrutura E/Q leva apenas a uma área de superfície enterrada ligeiramente maior do que a estrutura FKL, provavelmente devido à redobramento e à falta de densidade da interface de localização dos elementos estruturais (h2-loop3) do seu CD2.

Dois tipos de interações de domínio CD1 e CD2

Embora a estrutura FKL mostre uma dobra canônica de seu domínio CD2 (Figura Complementar 2C), a estrutura E/Q mostra uma alteração significativa na conformação CD2 (Figura Complementar 2D), com grandes alterações na hélice 2 (h2), loop 3, loop 4, e o centro Zn-activo. A h2 longa do CD2 na estrutura FKL (Suplemento Fig. 2C) tornou-se uma hélice curta 310 (h2′) na estrutura E/Q (Suplemento Fig. 2D), resultando em uma desordenação do trecho de 14-resíduos que abrange partes do loop 3 e h2 (resíduos A246 a E259) (Suplemento Fig. 1A). A mudança para uma estrutura de bobina curta 310 h2 e aleatória estendida é necessária para evitar o choque nesta conformação estanque da embalagem (Fig. 1e). Entretanto, isso também perturba a conformação do centro ativo CD2 Zn dentro das regiões de h2 e loop 3 que ficam desordenadas, resultando em nenhuma coordenação Zn (Suplemento Fig. 2D). A ausência de coordenação Zn é observada em apenas um outro APOBEC, a estrutura APOBEC3F (A3F) CD246,47. Entretanto, as estruturas Zn contendo ou ausentes A3F-CD2 são essencialmente idênticas, as quais também se alinham bem com várias outras estruturas APOBEC (Suplemento Fig. 2E), enquanto que o E/Q CD2 é único em seus laçadas h2 redobradas 3 e 4 e a conformação Zn-center (Suplemento Fig. 2E, F).

Embora seja possível que a perda de Zn e a redobramento do CD2 na estrutura E/Q possa ser o resultado das mutações nesta construção, investigamos se a variante E/Q tem atividade catalítica defeituosa. A reversão de E259Q na construção E/Q para o catalisador WT E259 (construção E/Q*) retornou a atividade completa da variante no ensaio de desaminação usando lisados de expressão de células HEK293T (Suplemento Fig. 3). Além disso, E/Q* com mutações individuais F126Y, K180S/L184S, ou CD2Δloop3 (como na estrutura FKL) estão todos ativos, embora a atividade da construção FKL* (com E259A revertida de volta para E259) com as mutações combinadas seja menor que E/Q* e WT. Estes resultados sugerem que mesmo que a estrutura cristalizada E/Q, sem Zn no domínio CD2, represente um estado estrutural A3G catalítico inativo, revertendo o resíduo catalítico de volta para E259 pode restaurar totalmente sua atividade de deaminase comparável ao WT. Mutações combinadas em FKL afetam parcialmente sua atividade catalítica.

De acordo com a diferença de ~29° no ângulo relativo de rotação na embalagem entre cada domínio nas estruturas FKL e E/Q, as interações moleculares detalhadas entre CD1 e CD2 diferem entre as duas estruturas. Os domínios CD1 e CD2 na estrutura FKL interagem entre si principalmente através de h3, h4 e loop 7 de CD1 e h1, h2, β2, e loop 3 de CD2 (Fig. 1a, d). Na estrutura E/Q, os dois domínios interagem principalmente através de h3, h4 e h6 do CD1 com h2′, β2, loop 4 e loop 10 do CD2 (Fig. 1b, e). Como resultado, cerca de 40% dos resíduos que interagem entre CD1 e CD2 diferem nas duas estruturas (veja uma lista completa dos resíduos que interagem na Fig. 4 Complementar), e mesmo quando os mesmos resíduos estão participando dessa interação, eles frequentemente fazem contatos de ligação diferentes devido à mudança no ângulo de empacotamento entre os dois domínios. A capacidade de embalar os domínios CD1 e CD2 com diferentes ângulos e interações de resíduos indica um certo grau de plasticidade na disposição do domínio fl A3G.

Dímero rA3G de comprimento total e características da área de dimerização

A construção E/Q foi cristalizada em diferentes condições de pH e sal (Tabela Suplementar 1), mas consistentemente mostrou a mesma estrutura e dimerização via interações CD1-CD1 (Fig. 2a, b), principalmente através da embalagem direta de vários resíduos em h6 (K180, L184, A187), loop 1 (I26) e loop 7 (F126, W127) de ambas as subunidades (Suplemento Fig. 5A, B). Curiosamente, essas interações são idênticas àquelas relatadas anteriormente apenas para o domínio rA3G-CD118, apesar da inclusão da mutação K128D que é crítica para tornar o rA3G do HIV-1 Vif insensível à degradação. Vale ressaltar que tal dimerização do fl rA3G leva apenas a um pequeno aumento da maior dimensão de 85 Å de um monômero para 95 Å de um dimer (Fig. 2a, b).

Um exame detalhado dos resíduos alinhados em ambos os lados da área da interface dimérica revela duas características salientes. Primeiro, um total de 18 resíduos positivos/polares e hidrofóbicos são alinhados ao redor da junção rA3G do dímero de uma maneira adequada para interação com ácidos nucléicos de cadeia única como RNA (Inset B na Fig. 2). Estes 18 resíduos são organizados em dois conjuntos, com o primeiro conjunto no sentido horário começando pelo monômero superior (em verde), R24, H181, N177, N176, K180, e continuando para o monômero inferior (em azul claro) W127, Y125, Y124, e S28, e então com o conjunto espelhado destes mesmos resíduos. Em segundo lugar, através da dimerização, o R24 e os resíduos positivos próximos K180 e H181 de cada monômero são posicionados bem próximos no espaço, com cerca de 7 Å de distância entre os dois resíduos R24. Esta disposição espacial aumenta significativamente os potenciais eletrostáticos locais (EP) de cerca de +1,9 kT/e como monômero para +8,3 kT/e como dímero (Fig. 2c e Inset C, Fig. 2d e Inset D). A presença de resíduos bem alinhados adequados para ligação de ácidos nucléicos de cadeia única, bem como o EP positivo melhorado (PEP) ao redor da junção do dímero observado implica fortemente que esta área pode ligar RNA como um dímero, e sugere que a ruptura desta interface de dimerização A3G pode impactar a ligação do RNA através da ruptura da PEP aumentada (Fig. 2c) para a PEP baixa como em forma monomérica (Fig. 2d e Inset D). 2d).

Efeito da mutação do dímero na associação e multimerização do RNA

Nosso estudo anterior no domínio CD1 sugeriu que os resíduos da interface do dímero FWKL (F126, W127, K180, L184) podem estar envolvidos tanto na dimerização quanto na ligação do RNA, seja através da interação direta com o RNA ou indiretamente através da geração de uma superfície de ligação do RNA via dimerização18. A inspeção da estrutura do dímero fl rA3G revela que, enquanto os resíduos FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) participam diretamente das interações de dimerização (Figura Complementar 5A), apenas W127 é acessível para o pi-stacking ou ligação de hidrogênio com uma base de ácido nucléico, sugerindo que é W127 que tem o duplo papel crítico na dimerização e/ou ligação do RNA, o que também tem sido sugerido por estudos mutacionais anteriores15,18,40,48.

Loop 7 de rA3G está localizado próximo à interface de dimerização e contém um conjunto de resíduos hidrofóbicos (Y124, Y125, e F126) que embalam com e provavelmente estabilizam W127 (Fig. 5B Suplementar). Para abordar se a dimerização é necessária para a associação do RNA e também para considerar o possível papel duplo de W127, projetamos um conjunto de mutantes de interface dimerizada de rA3G que deixaram o loop 7 inalterado (Tabela Suplementar 3, Suplementar Fig. 5A, B). Como tal, apenas resíduos de interface enterrados fora do loop 7 foram mutantes, gerando os mutantes rM10, rM11 e rM15 (Tabela Suplementar 3). Como controle, também incluímos um rM9 mutante com alterações tanto no loop 7 quanto no h6 do CD1 (F126A-W127A-A187Y) que se esperava que resultasse em um fenótipo similar ao anteriormente relatado mutante FWKL do CD1 sozinho18; ou seja, ruptura tanto da dimerização quanto da associação do RNA. Também foi incluído um rA3G (WT) do tipo quase selvagem, com comutação do loop CD1 com melhora da solubilidade e seu correspondente mutante catalítico inativo (construir E/Q) (Tabela Suplementar 3). A associação do RNA e oligomerização destes mutantes após expressão recombinante em E. coli foram examinados.

Após purificação da coluna de afinidade dos lisados de células E.coli, a associação do RNA da proteína de fusão sumo-rA3G foi analisada desnaturalizando a urea-PAGE (Fig. 3a-c). Enquanto o WT e E/Q mutante (faixas 7, 8 na Fig. 3b, c) tinham associação de RNA semelhante, todos os mutantes de interface dimerizada (rM10, rM11, rM15 nas faixas 2, 3, 5, respectivamente, na Fig. 3b, c) tiveram associação de RNA muito reduzida (pista 7) antes ou depois do tratamento RNase A, com rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) e o RNA mutante de controle rM9 mostrando pouco RNA detectável após passar pelo mesmo processo de purificação (pistas 1, 2, 5). A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) revelou que o rM10 e o rM15, assim como o rM9 de controle mutante, eluem predominantemente como monômero antes e depois do tratamento com RNase A (Fig. 3d, e; Suplemento Fig. 6A, B), confirmando a interrupção da dimerização/multimerização. Assim, esses resultados sugerem que sob as condições experimentais os resíduos mutantes enterrados na interface não apenas interrompem a dimerização, mas também afetam a associação do RNA mesmo quando o loop 7 está inalterado, provavelmente devido à perda da PEP aumentada como resultado da interrupção da dimerização (Fig. 2c, d).

Porque não pudemos realizar o mesmo tipo de ensaio bioquímico para avaliar mutantes similares em A3G humano (hA3G) devido a sua baixa solubilidade, geramos uma quimera mutante rA3G-hA3G (quimera h6) na qual o rA3G CD1 h6 é substituído por hA3G CD1 h6 (ver Tabela Suplementar 3). Esta quimera h6 comportou-se de forma semelhante ao rA3G WT durante a purificação em termos de dimerização/multimerização antes ou depois do tratamento RNase A (Suplemento Fig. 7A, B), assim como a associação de RNA, especialmente depois do tratamento RNase A (Suplemento Fig. 7C, D). Vale ressaltar que, como mostrado no Suplemento Fig. 7A, B, enquanto a proteína quimérica H6 também mudou para frações de dímeros (D) e monômeros (M) após o tratamento com RNase A (gel SDS-PAGE no Suplemento Fig. 7D), seu perfil SEC mostra picos mais heterogêneos que o do rA3G WT, possivelmente porque a proteína quimérica tem três resíduos (Y181, I183, I187) do hA3G que são mais hidrofóbicos que os do rA3G (H181, T183, A187), e portanto menos estáveis/solúveis. Estes resultados sugerem a possibilidade do CD1 h6 poder ser intercambiável entre rA3G e hA3G, o que leva à presença da mesma área de PEP que tem essencialmente o mesmo conjunto de resíduos superficiais em ambas as proteínas.

Efeito da mutação da PPE na associação do RNA e multimerização

Nós então investigamos se a superfície melhorada da PEP formada ao redor da junção do dímero (Fig. 2. Inset b) é importante para a associação do RNA. Quatro resíduos positivos/polares centrados ao redor de R24 foram mutados para gerar rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, Tabela Suplementar 3). Um mutante contendo apenas R24T também foi incluído. A associação do RNA do rM12 foi reduzida em relação ao R24T e WT (faixas 4, 6, 7 na Fig. 3b, c), indicando um papel desses resíduos dentro da área da PEP no aumento da ligação do RNA. Entretanto, quando comparado ao rM9 (F126A/W127A/A187Y), o rM12 ainda tinha uma quantidade substancial de associação do RNA antes e depois do tratamento com RNase A (faixas 1, 4 na Fig. 3b, c), possivelmente devido ao rompimento parcial da ligação do RNA à área da PEP, mas não a outras áreas do rA3G. Inesperadamente, a análise da SEC revelou que o rM12 teve um pico monomérico importante mesmo antes do tratamento com RNase A (Fig. 3d, e, Suplemento Fig. 6A, B), indicando ruptura da dimerização/multimerização sem mutar diretamente a interface de dimerização. Este efeito negativo da mutação da PEP na associação do RNA e da dimerização/multimerização foi ainda confirmado por mais dois mutantes rA3G contendo mutações PEP, rM13 e rM14 (Tabela Complementar 3, Suplemento Fig. 7). Esses dois mutantes apresentaram níveis diferentes de interrupção da associação do RNA (Suplemento Fig. 7A) e dimerização/multimerização mesmo antes do tratamento com RNase A sob a condição testada (perfis SEC e géis no Suplemento Fig. 7C).

Interessantemente, apesar de R24T mutante simples e WT apresentarem quantidades semelhantes de RNA associado detectadas por géis de RNA na Fig. 7C. 3b, c, a análise detalhada SDS-PAGE de suas frações de pico SEC antes do tratamento RNase A revelou que a maior parte da proteína R24T distribuída nas frações se espalhou ao redor da localização do pico monomérico (M) (Suplemento Fig. 6A), o que é contrário ao WT que se distribui principalmente nas frações de volume vazio (V). Esses resultados indicam mudança de associação do RNA e comportamento de multimerização com uma única mutação R24T dentro da área da PEP, o que é consistente com estudos prévios de mutações R24A14,30,38,40. Em conjunto, esses resultados demonstram que, sob essas condições de ensaio, os resíduos dentro da área de PEP aumentada da junção do dímero (R24/S28/N176/N177) desempenham um papel importante na mediação da associação do RNA, e a associação do RNA através desses resíduos é, inversamente, necessária para a estabilização da dimerização e subseqüente multimerização de maior ordem.

Efeito das mutações de PEP/dímeros na ligação in vitro do RNA/DNA

As estruturas fl rA3G revelam áreas adicionais com resíduos com carga positiva fora da área PEP melhorada, como mostrado na Fig. 2c. Embora esses resíduos com carga positiva fora da área da PEP possam não desempenhar um papel importante na formação de complexos A3G-RNA estáveis como observado a partir dos lisados de células E. coli, eles ainda podem contribuir para a ligação dos substratos definidos de ssRNA e ssDNA. Para testar isso, cada amostra de proteína purificada foi submetida a um extenso tratamento com RNase para remover o máximo possível de RNA ligado, e a afinidade de ligação com 50 nt de oligômeros de ssRNA ou ssDNA foi testada usando um ensaio de gel shift. Todos os mutantes apresentaram ligação a 50 nt ssRNA ou ssDNA, e as constantes de dissociação estimadas (Kd, Tabela Suplementar 3) indicaram que a maioria dos mutantes tinha ligação reduzida quando comparados com o WT e E/Q. Estes resultados indicam que neste sistema reconstituído onde altas concentrações de proteínas e ácidos nucléicos estavam presentes, estes vários mutantes rA3G de interface dimer e área de PEP ainda são capazes de se ligar ao RNA e ssDNA através de outros resíduos fora da área de PEP na junção dimer.

Overall, a redução da ligação destes mutantes é mais severa para ligação do ssDNA do que para ligação do RNA. Curiosamente, o ensaio de deaminase usando as proteínas purificadas desses mutantes rA3G (rM9-rM12 e rM15) revelou que esses mutantes de interface dimer-interface e mutantes de ligação ao RNA mostraram atividade de deaminase reduzida em comparação com o WT (Figura Suplementar 8). A diminuição da ligação ssDNA desses mutantes poderia ser responsável, pelo menos parcialmente, pelos vários níveis de redução da atividade de deaminase. No entanto, o grau de ligação do ssDNA diminuído não parece ter uma correlação estrita com o nível de perturbação da atividade de deaminase. Por exemplo, o rM12 apresentou a ligação mais baixa de ssDNA (Tabela Suplementar 3), mas não é aquele com menor atividade de deaminase (Suplementar Fig. 8).

Efeitos das mutações da interface PEP/dímero na restrição do HIV

A mutação W127A no A3G humano (hA3G) é conhecida por perturbar o acondicionamento do virião e, portanto, a restrição do HIV, provavelmente pela abolição da ligação do RNA mediada por esse resíduo. Entretanto, estudos que induziram o empacotamento de mutantes hA3G W127 através de uma fusão de peptídeo Vprtideo identificaram deficiências na restrição do HIV15. Para obter mais informações sobre o mecanismo de restrição do HIV-1 por hA3G, projetamos mutantes hA3G adicionais guiados pela estrutura rA3G e dados mutacionais. A intenção dessas mutações hA3G (Tabela Suplementar 4) era perturbar as interações intramoleculares CD1-CD2 (M2, M3, M4) (Suplementar Fig. 9A, B), interromper a ligação do RNA ao redor da junção do dímero através da mutação de números crescentes de resíduos polares/carregados (M12, M13, M14), ou interromper as interações do dímero proteína-proteína através da mutação de números crescentes de resíduos enterrados (M6, M10, M11) (Suplementar Fig. 9C).

Como esperado, o WT hA3G não tinha atividade de restrição do HIV-1 na presença do Vif, mas totalmente restrito ao HIV-1 na ausência do Vif, e o Vif-resistente M1 (D128K) constrói infecção pelo HIV totalmente restrita com ou sem Vif (Fig. 4a-c). Por outro lado, o W127A contendo mutante M9 (com mutações F126A/W127A/I187Y, Suplemento Fig. 9C) conhecido por perturbar tanto a ligação do RNA quanto a dimerização, não tinha atividade de restrição independentemente da presença do Vif (Fig. 4a-c). Isto é consistente com a literatura anterior que afirma que a W127 é importante para a atividade de restrição do HIV devido à sua capacidade de ligação do RNA, necessária para o acondicionamento do virião hA3G e restrição de transcrição reversa independente da desaminação14,15. De fato, apesar de sua sensibilidade à degradação Vif parecer ter sido reduzida (Suplemento Fig. 10A), ~5 a 10 vezes menos a proteína mutante M9 foi embalada em virion na presença ou ausência de Vif em comparação ao WT hA3G (Fig. 4a, b). Estes resultados de WT e mutantes de controle M1 e M9 de hA3G demonstraram plena atividade ou falta de atividade em nosso estudo.

Para os mutantes projetados para afetar as interações intramoleculares CD1-CD2, múltiplos resíduos próximos ou dentro da interface interdomínio no lado CD2 foram mutados para M2 e M3 e no lado CD1 para M4 (Suplemento Fig. 9A, B). M2 e M3 tiveram ambas atividade de restrição do HIV-1 significativamente menor na ausência do Vif (Fig. 4c). M2 carregando mutações nos loops CD2 1 e 3 ao redor da interface com o CD1 mostraram uma perda completa da atividade catalítica (Fig. 4e), provavelmente porque alguns desses resíduos mutantes, como o H216, são importantes para a interação do substrato ssDNA49. M3 carregando mutações na interface CD2 com CD1, a partir dos resíduos de linker R194/H195 (Suplemento Fig. 9A, B), teve apenas ~10% de atividade de deaminase WT (Fig. 4e), possivelmente devido à perda da interação CD2 adequada com CD1 para afetar a ligação coordenada do substrato de ssDNA para uma atividade catalítica eficiente. M4 carregando múltiplas mutações ao redor da interface interdomínio em CD1 apresentou características similares ao WT indicando que essas mutações não têm efeito óbvio na capacidade de restrição. Curiosamente, esta mutação teve atividade catalítica completa (Fig. 4e), sugerindo certa plasticidade entre as interações da interface CD1-CD2 para funções.

M12 e M13 foram projetadas para interromper apenas a ligação do RNA à área da PEP na junção do dímero, e M14 contém a maioria das mutações de M12 e M13 mais quatro resíduos R/K adicionais (K52/K63/R69/K76) para eliminar a superfície restante da sola com carga positiva em A3G-CD1 (Suplemento Fig. 9C). Surpreendentemente, todos estes mutantes apresentaram ~70% de atividade de restrição do HIV-1 na ausência do Vif (Fig. 4c). Embora tenha sido difícil quantificar a sensibilidade Vif devido ao persistente baixo nível de expressão de M12, M13 e M14 no ensaio de sensibilidade Vif (Suplemento Fig. 10A), todos os três mutantes, semelhantes ao WT, não apresentaram atividade de restrição do HIV na presença do Vif (Fig. 4c), sugerindo que de fato ainda eram suficientemente sensíveis à degradação mediada pelo Vif. A razão para apenas 70% de atividade de restrição do M12-14 para HIV-1 não foi devido aos seus níveis mais baixos de proteína em estado estacionário detectados nos lisados celulares HEK293T (Fig. 4a, b), já que a transfecção de menos plasmídeo de expressão do WT para alcançar níveis de expressão celular similares ao M12-M14 ainda resultou em ~4 vezes mais restrição do WT para HIV-1 (Suplemento Fig. 10B). Isso é consistente com a atividade de restrição independente da desaminação, uma vez que esses três mutantes interromperam a atividade de desaminação (Fig. 4d, e). Especialmente o M14 teve uma perda completa da atividade de desaminase (Fig. 4e). Consistente com isto foi a taxa de mutação de fundo do M14 com base nos resultados do sequenciamento de DNA proviral (Tabela suplementar 5). E ainda assim mostrou ~70% de atividade de restrição do HIV-1. Esses resultados demonstram claramente que os resíduos mutantes em M12-14 para interromper a ligação do RNA na PEP e áreas próximas em CD1 mostraram apenas defeito parcial na restrição do HIV, indicando que retiveram certo nível de encapsulamento do virion e restrição do HIV-1, o que contrasta com o papel da ligação do RNA mediada por mutações contendo W127 no mutante M9 que é crítico para o acondicionamento do virion e restrição do HIV (Fig. 4e). 4a-c).

Os mutantes destinados a interromper apenas as interações proteína-proteína dimer com o número crescente de mutações são de M6 a M11 (Tabela Suplementar 4, Suplementar Fig. 9C). M6 e M7 mostraram apenas perda parcial da atividade de restrição na ausência do Vif, apesar da perda de 95% da atividade catalítica para M7 devido às três mutações adicionais no CD2 (Fig. 4e). Portanto, as mutações em M6 e M7 não são críticas para a restrição do HIV. M10 mostrou fenótipo mais severo na restrição do HIV-1 na ausência do Vif, embora tenha retido alguma atividade catalítica (Fig. 4e), sugerindo que as mutações no M10 são importantes para o acondicionamento do virião e para a restrição do HIV. O M11 é semelhante ao M10 em atividade de deaminase, mas com fenótipo menos severo em termos de atividade de restrição e integração (Fig. 4c, d). É possível que o M11 tenha retido mais capacidade de ligação do RNA do que o M10 (a partir do rM10-11 da análise mutante rA3G, Fig. 3a-e), resultando em fenótipo menos severo. Em conjunto, esses resultados mostraram que os resíduos mutantes dentro da interface proteína-proteína dimerizada enterrada ainda retêm a atividade de restrição do HIV em níveis reduzidos (Fig. 4c), e a interrupção da atividade de desaminase desses mutantes (Fig. 4e) pode ser parcialmente responsável pela redução da atividade de restrição do HIV. Isto novamente contrasta com o mutante M9 que não apresentou atividade de restrição do HIV (Fig. 4a-c).