Estudo Comparativo do Efeito da Baicalina e seus Análogos Naturais nos Neurônios com Deprivação de Oxigênio e Glicose Envolvendo Reação Imune Inata de TLR2/TNF𝛼

Abstract

Este trabalho consiste no estudo da baicalina e seus três análogos, baicalina, wogonoside e wogonin, sobre o efeito protetor do neurônio da privação de oxigênio-glicose (OGD) e da expressão do receptor 2 de toll-like (TLR2) nos danos causados pelo OGD. Os resultados mostraram que a baicalina e seus três análogos protegeram os neurônios dos danos causados pelo OGD e do nível de proteína TLR2 desregulado. O ácido D-Glucopiranosidurônico no local 7 na estrutura jogou um núcleo de citotoxicidade destes análogos flavonóides. O grupo metoxil no carbono 8 da estrutura tinha a relação com a expressão da proteína TLR2, bem como a anti-inflamação. Além disso, detectamos a capacidade de caspase3 e antioxidação, para investigar o efeito de quatro análogos na apoptose celular e a competência antioxidação total no modelo OGD.

1. Introdução

Scutellariae radix, um medicamento chinês, tem vários efeitos farmacológicos tais como antibacterianos, antivírus, anti-inflamatórios, antioxidantes e anti-choque em clínica. Seu princípio ativo é uma espécie de flavones, consistindo de baicalin, baicalein, wogonin e wogoniside brevemente (Figura 1) . É relatado que Scutellariae radix protege os neurônios da lesão de isquemia e reperfusão . A baicalina, o principal componente dos flavones, foi confirmada com a neuroproteção dos danos por isquemia e reperfusão e a ação sobre o sistema nervoso central . Recentemente, a baicaleína foi estudada com um efeito promissor de neuro-ação em múltiplos locais . Entretanto, nenhum relatório apresentou o efeito da baicalina e da expressão TLR2 sobre os neurônios. Algumas pesquisas relataram que o wogonin e o wogonoside agiram sobre os neurônios . A baicalina e a baicaleína foram estudadas como um antioxidante; em alguns modelos a baicaleína foi ainda mais forte que a baicalina na redução de várias cargas livres. Comparando-as, a baicaleína e a baicalina atenuaram significativamente a lesão celular induzida pelo peróxido de hidrogênio, mas o wogonin e o wogonoside agiram de forma mais fraca . Sugere-se que deve haver outros mecanismos de wogonin e wogonoside na neuroproteção.

Figura 1

Estruturas químicas da baicalina e seus análogos naturais, baicaleína, wogonoside e wogonin.

Como a anti-inflamação de baicalina e baicaleína foi confirmada, as pesquisas sobre a resposta imune inata foram estudadas na reperfusão de isquemia cerebral e apresentaram a razão, em parte, porque a anti-inflamação de baicalina e baicaleína foi um dos principais ensaios para a proteção do cérebro do dano de reperfusão de isquemia. Vários receptores foram indicados como os principais alvos da lesão de reperfusão isquêmica na glia, tais como os receptores toll like (TLRs) e os NODs (nucleotide-binding oligomerisation domain) . Nossa experiência anterior mostrou que a baicalina atenuou a expressão do NOD2 e TNFα em neurônios com a lesão de isquemia e reperfusão in vivo e in vitro . Wogonoside foi relatado com inibição da angiogênese induzida por lipopolissacarídeos através da transdução do sinal do receptor 4 (TLR4) . Entretanto, TLR2 não foi investigado pela baicalina e seus análogos naturais.

Baseado nas informações mencionadas anteriormente, investigamos o comportamento de regulação da baicalina e seus análogos através de um tipo de célula neuronal PC12 a fim de explorar os possíveis alvos da baicalina e seus análogos nas reações imunes inatas durante a privação de oxigênio e glicose (OGD) e as relações entre a estrutura química e o efeito entre a baicalina e seus análogos naturais. Como TLR2 é um dos receptores iniciais na imunidade inata e a ativação inflamatória, assim como o TNFα, pode ser inibido pela baicalina nas células pulmonares, a expressão proteica de TLR2 e TNFα foram testados para descobrir o papel da baicalina e seus análogos neste modelo de lesão nervosa. Enquanto isso, a caspase3 é um conhecido índice de apoptose, e vários estudos relataram que alguns flavones poderiam induzir apoptose de células inflamatórias , então detectamos a expressão da proteína caspase3. Adicionalmente, o efeito dos quatro análogos sobre a capacidade total de antioxidação das células no modelo OGD também foi detectado neste trabalho, que comparou ainda toda a competência desses flavones .

2. Materiais e Métodos

2.1. Químicos e Materiais

Baicalina (a pureza foi de 98%) foi apresentada pela Dra. Lujun Zhang, Laboratório de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Tsinghua. Wogonoside (pureza de 98%) foi apresentado pelo Dr. Xiuwei Yang, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Pequim. Baicalein e wogonin, todos com pureza de 98% (número de lote 111595-200604 e 111514-200403), foram adquiridos do China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Instituto Nacional de Controle de Produtos Farmacêuticos e Biológicos da China). A água desionizada foi utilizada durante toda a experiência. Outros solventes e reagentes orgânicos foram de grau analítico-reagente. O tampão PBS com pH7,4 foi preparado em nosso laboratório. As células PC12 foram fornecidas pelo Banco de Células do Instituto de Medicina Fundamental, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Pequim, China). O soro fetal bovino (FBS) e o meio RPMI 1640 foram adquiridos de GIBCO. Os anticorpos anti-TLR2/TNFα/caspase3/β-actin foram comprados da Santa Cruz Company (EUA). O anticorpo secundário foi comprado da Zhongshan Company (Beijing, China). O kit de detecção da capacidade total de antioxidação (T-AOC) foi adquirido do Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China).

2.2. Cultura celular

PC12 células foram ajustadas para cerca de 1 × 106 células/mL com 2 mL de inoculação em cada poço de 6 placas de poços (Costar) em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 5% de soro de cavalo e penicilina/streptomicina (100 U/mL cada). As células foram cultivadas em uma incubadora umidificada (5% CO2) (Sanyo, Japão) a 37°C e permitidas para fixação por pelo menos 48 h.

2.3. Os ensaios de citotoxicidade In Vitro

As dosagens seguras de baicalina e os seus três análogos às células foram avaliados pelo ensaio MTT (metiltiazol tetrazolium) in vitro. Após 24 h de incubação de células em placas de 96 poços, a baicalina e seus análogos foram adicionados com a dosagem de 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. 24 h depois dos compostos adicionados, o meio de cultura em placas de 96 poços foi incubado com MTT (5 mg/mL, 200 μL por poço) a 37°C durante 4 h. Depois o meio foi cuidadosamente aspirado, e 200 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) por poço foi adicionado para dissolver os produtos de formazan azul. Os valores de absorvância a 490 nm foram medidos utilizando um leitor de microplacas (Modelo 550，Bio-Rad，USA). Os resultados da absorvância dos poços de teste foram expressos como células vivas. A concentração de citotoxicidade a 50% (CC50) foi calculada .

2,4. Células para a privação de oxigênio-glicose

Para a privação de oxigênio-glicose (OGD), substituímos o meio de crescimento por meio de cultura livre de glucose (2 mL por poço) e colocamos as placas em uma incubadora (YCP-30Q, Changsha, China) cheia de 95% N2/5% CO2 a 37°C por 120 min. Em seguida, as células foram devolvidas ao meio de alimentação normal e incubadas em condições normais a 37°C (Sanyo, Japão) durante o tempo específico para experiências posteriores. As culturas de células controle não privadas de oxigênio e glicose foram incubadas em condições normais no meio com glicose.

Para efeito de proteção dos compostos de danos causados pelo OGD, o ensaio de vida celular foi realizado como descrito anteriormente. Após 24 h de incubação das células em placas de 96 poços, a baicalina e seus análogos foram adicionados com as dosagens de 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. 24 h depois da adição dos compostos, o meio de cultura em placas de 96 poços foi incubado com MTT (5 mg/mL, 200 μL por poço) a 37°C durante 4 h. O meio foi cuidadosamente aspirado, e 200 μL DMSO por poço foi adicionado para dissolver os produtos de formazan azul. Os valores de absorvância a 490 nm foram medidos utilizando um leitor de microplaca. Os resultados da absorvância dos poços de teste foram expressos como células vivas. A concentração efetiva de 50% (EC50) foi calculada. Combinado com a citotoxicidade (CC50) dos compostos, os índices de segurança (SIs) foram calculados pelo EC50/CC50 .

Para o estudo TLR2/TNFα e caspase3, a concentração mínima de segurança da baicalina e seus análogos foi pedida como 10 μg/mL. Estes compostos (10 μg/mL) foram adicionados quando o meio de cultura foi trocado com solução glicosada e as células foram cultivadas em condições normais. As células foram coletadas para experimento proteico no tempo específico de reperfusão (0,5, 1, 3, 6 h) após a adição da baicalina e seus análogos. No controle, o meio foi utilizado como veículo e as células foram capturadas no tempo de reperfusão de 6 h.

2.5. Preparação das Amostras

Dois grupos sem medicamentos foram empregados como controle. Um grupo de células foi semeado no meio com meio de crescimento normal durante todo o processo experimental sem privação de oxigênio-glicose. O segundo grupo foi semeado no meio com processo de privação de oxigênio-glicose como modelo de controle. Em cada momento, a amostra de células foi preparada da mesma forma que na descrição anterior. O meio foi retirado de cada poço e as células foram lavadas três vezes com PBS frio (pH 7,4) e utilizadas com 100 μL RIPA para a coleta de proteína total para o blotting ocidental.

2,6. Western blotting

ensaio Western blotting para expressão da proteína de β-actin, TLR2, TNFα, e Caspase3 foi referenciado com minimodificação da seguinte forma: amostras carregadas no gel (10%), foi executado até o marcador (comprado de Fermentas Republic da Lituânia) e foi para o final do gel. A transferência deve ser semidrial durante 60 min a 12 volts e 280 mA. Em seguida, a membrana foi bloqueada com 10% de leite em PBST (1 × PBS + 0,1% Tween20) durante 60 min agitando lentamente à temperatura ambiente. A membrana foi colocada em 1 mL PBST com anticorpos em uma diluição de 1 : 1000, incubada por 60 min à temperatura ambiente no agitador, e lavada por 3 vezes usando PBST após a incubação dos anticorpos primários. Depois disso, a membrana foi incubada durante 60 min em PBST com o anticorpo secundário com a concentração 1 : 3000. A membrana foi lavada 3 vezes com PBST finalmente.

2.7. Total Antioxidation Capability Detection

O princípio desta experiência foi detectar a mudança de cor após a redução de Fe3+ para Fe2+ pelos componentes redutores nas amostras. Os componentes redutores podem incluir as moléculas enzimáticas e não enzimáticas como a vitamina E lipossolúvel e os antioxidantes hidrossolúveis vitamina C, bilirrubina e ácido úrico. Então a densidade óptica foi medida a 520 nm com um leitor de microplaca . A amostra de célula foi preparada da mesma forma que a descrição anterior e colhida no tempo específico de reperfusão (6 h) após a adição da baicalina e seus análogos. O meio foi retirado de cada poço, e as células foram lavadas três vezes com PBS fria (pH 7,4). Estas células da placa foram resolvidas com PBS (1 mL/bolo) por congelamento e descongelamento repetidos. O sobrenadante foi coletado para o teste T-AOC após centrifugação de 12 000 rpm/min.

2,8. Análise dos dados

Todos os valores foram expressos como média ± D.S. Os dados foram analisados estatisticamente pela ANOVA. As comparações Newman-Keuls foram usadas para determinar a fonte das diferenças significativas, quando apropriado. Valores de P abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significantes. O software do CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) foi utilizado para o cálculo de CC50 e EC50.

3. Resultados

3.1. Perfil de crescimento celular

As células foram semeadas nas placas do meio com 10% de FBS durante 48 h. Elas não seriam usadas para os experimentos até que crescessem bem e se prendessem bem umas às outras no plano das placas de múltiplos alvéolos.

3.2. Testes MTT de Citotoxicidade

Para examinar a citotoxicidade e determinar as dosagens seguras de baicalina e seus análogos, o ensaio MTT foi conduzido em células PC12 in vitro. Com base nos experimentos, 10 μg/mL de baicalina e wogonoside foi a maior concentração de segurança em células PC12 normais, e 1 μg/mL de baicalein e wogonoside foi a maior concentração de segurança em células PC12 normais (Figura 2).

(a)

(b)

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Figura 2

Cytotoxcity of baicalin, wogonoside, baicalein, e wogonin em células PC12 normais (ensaio MTT). Após 24 h de incubação de células em placas de 96 poços, os produtos químicos foram adicionados com a dosagem de 10 mg/mL a 0,001 mg/mL. *𝑃<0,05 em relação ao controlo normal. Os dados foram apresentados como média ± D.S. de sete experimentos independentes.

Em células PC12 tratadas com privação de oxigênio-glicose, apenas menos de 40% das células sobreviveram com comparação do controle normal (𝑃<0,05). Em comparação com o modelo controle, a concentração mínima efetiva (CEM) de baicalina e wogonina foi de 10 μg/mL, enquanto a CEM de ambos, wogonoside e baicalein, foi a mesma em 1 μg/mL. A concentração máxima efetiva (MAXEC) de baicalina e woronin foi a mesma a 1 mg/mL, implicando na mesma segurança dos mesmos. A MAXEC do wogonoside foi de 1 mg/mL, mas a MAXEC da baicaleína foi apenas de 10 μg/mL. Foi sugerido que a baicaleína era mais citotóxica do que a do wogonoside. Todos estes compostos não foram mostrados de forma distinta na concentração-dependente (Figura 3).

(a)

(b)

(c)

(d)

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3.3. Efeito sobre as Expressões de TLR2, TNFα, e Caspase3

Lesões por OGD, as proteínas de TLR2 e TNFα nas células foram expressas distintamente, o que significa que o OGD estimulou a reação imune inata, causando inflamação. A proteína caspase3 no modelo OGD foi upregulada em algum grau, mas não houve um valor estatístico significativo (Figura 4). A Baicalina atenuou a expressão da proteína TLR2 e TNFα 3 horas após a administração. Quando a baicalina teve efeito por 0,5 h, a expressão de TLR2 mostrou significância estatística não importando quando comparada com a normal ou comparada com o modelo (𝑃<0,05), e a expressão de TLR2 de 1 h aumentou (comparada com a normal, 𝑃<0,05); entretanto, sua expressão de 3 h ou 6 h não mostrou diferença óbvia comparada com a normal (comparada com o modelo, 𝑃<0,05). A expressão do TNFα de 0,5 h ainda foi superior à do controle (𝑃<0,05), e suas expressões de 1 h, 3 h e 6 h foram obviamente desreguladas, o que mostrou diferença significativa em relação ao modelo (𝑃<0,05). A Baicalina aparentemente não afetou a expressão da proteína caspase3, o que foi mostrado na Figura 4(a).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
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Figura 4

Efeito dos quatro análogos nas expressões proteicas de TLR2, TNFα, e caspase3 em células PC12 com privação de oxigénio-glucose (OGD). O nível de proteína foi medido por Western blot. Modelo significa tratamento com privação de oxigénio-glicose. 0,5, 1, 3 e 6 h significam o tempo do processo de reperfusão após o OGD. (a) significa efeito baicalin; (b) significa efeito wogonoside; (c) significa efeito baicalein; (d) significa efeito wogonin. Baicalina, wogonoside e wogonin foram usados numa concentração de 10 μg/mL, e o baicalein foi usado numa concentração de 1 μg/mL. *𝑃<0.05 em relação ao controle normal. #𝑃<0,05 versus grupo modelo. Os dados foram apresentados como média ± DP de três experimentos independentes.

Após a adição de wogonoside (10 μg/mL), TLR2 e TNFα foram aparentemente desregulamentados. A expressão de TLR2 foi muito inferior à do modelo, mesmo que o nível normal (𝑃<0.05). Assim, a expressão do TNFα foi inibida pelo wogonoside aparentemente a partir de 0,5 h após sua administração até o timepoint de 6 h (𝑃<0,05). Wogonoside também não mostrou efeito óbvio na expressão da caspase3 (Figura 4(b)).

Após a administração de baicalein, TLR2 ainda foi significativamente upregulada 0,5 h e 1 h após a adição de baicalein (𝑃<0,05), e diminuiu para o normal às 3 h e 6 h. Em comparação com o modelo, o TNFα foi upregulado às 0,5 h e diminuiu gradualmente mais tarde. Assim como TLR2, foi expresso para o normal às 3 h e 6 h (Figura 4(c)).

No grupo wogonin, os dois fatores diminuíram aparentemente. TLR2 diminuiu para o normal após 0,5 h da adição de wogonin (em comparação com o modelo, 𝑃<0,05), e permaneceu em um nível mais baixo durante o curso do experimento. Nos pontos 0,5 h e 1 h de tempo, TNFα foi expresso mais que o normal (𝑃<0,05), mas menos que o modelo (𝑃<0,05), e às 3 h e 6 h, aproximou-se do nível normal como a expressão TLR2 (Figura 4(d)).

Similar aos grupos baicalina e wogonoside, a expressão caspase3 não mostrou alteração significativa nos grupos baicalein e wogonoside (Figuras 4(c) e 4(d)).

3.4. Ensaio de Competência Antioxidante Total (T-AOC)

Utilizando o kit T-AOC, constatamos que a competência antioxidante das células normais era de cerca de 2,5 U/mg, e uma das células tratadas pela privação de oxigênio-glicose estava muito abaixo de 0,5 U/mg. No grupo da baicalina, o valor de detecção foi de 1,8 U/mL, mostrando uma diferença significativa, independentemente da comparação com o normal ou da comparação com o modelo OGD. Nos grupos wogonoside, baicalein e wogonin, os valores foram de 1,6, 0,8 e 0,6 U/mg, respectivamente, que mostraram uma diferença significativa em comparação com o normal ou com o modelo (Figura 5).

Figura 5

Efeito da baicalina e seus três análogos na competência total antioxidante das células PC12 tratadas com privação de oxigênio-glicose. Modelo significa tratamento com privação de oxigénio-glicose. Baicalina, wogonoside e wogonin foram utilizados em uma concentração de 10 μg/mL, a baicaleína foi utilizada em uma concentração de 1 μg/mL. **𝑃<0.01 em relação ao controlo normal. ##𝑃<0.01 em relação ao grupo modelo. ##𝑃<0.01 versus grupos baicalin e wogonoside. Os dados foram apresentados como média ± D.S. de oito experimentos independentes.

4. Discussões

Baicalina é um composto glicosilado derivado da baicaleína, e tem um grupo funcional de ácido D-glucopiranosidurônico no local 7 da baicaleína (Figura 1), de modo que exibirá mais função biológica. A estrutura básica da baicalina consiste de benzopirano com três grupos hidroxila no local 5, 6 e 7 e um grupo fenila no outro lado do benzopirano (local 2). A baicalina também tem uma estrutura de enol no anel do benzopirano para manter a conjugação. As duas diferenças entre baicalina e wogonina estão no grupo metoxil no carbono 8 de wogonina e no grupo hidroxil no carbono 6 de baicaleína. A constituição de três grupos hidroxila na baicalina pode ser responsável por mais caracteres hidrofílicos. Além disso, o wogonósido é uma forma glicosilada de wogonina com ácido D-glucopiranosidurônico sobre o carbono 7. Todos os quatro compostos partilham um esqueleto de carbono semelhante com uma estrutura benzopirana e também um grupo hidroxila no carbono 5; a baicaleína e a baicalina têm grupos hidroxila no carbono 6, enquanto que o wogonin e o wogonósido não têm; baicaleína e wogonina têm grupos hidroxila no carbono 7, enquanto wogonósido e baicalina são ambos glicosilados no grupo hidroxila no local 7; por último, wogonina e wogonósido têm grupos metoxila no carbono 8, mas baicaleína e baicalina não têm os grupos funcionais .

Pelo resultado da citotoxicidade e neuroproteção, o ácido D-glucopiranosidurônico no local 7 foi importante para reduzir a citotoxicidade, no qual a baicalina era menos citotóxica que a baicaleína e o wogonósido era menos citotóxico que o wogonoside. O grupo metoxil no carbono 8 e o grupo hidroxil no carbono 6 foram o principal fator influenciando o efeito neuroprotetor, pelo qual o EC50 de baicalina e baicaleína foi menor que o de wogonoside e wogonina (Figura 1 e Tabela 1) após a administração dos mesmos.

Neste estudo, verificamos que o TLR2 foi altamente expresso durante a privação de oxigênio e glicose (OGD) nas células PC12, o que sugeriu que o receptor foi ativado nos neurônios danificados (Figura 4). O TLR2 foi identificado como um mediador chave de respostas imunológicas e reações inflamatórias, e mediou respostas pró-inflamatórias através da ativação do TNFα . O receptor foi significativamente regulado para cima em comparação com o nível normal, indicando que se uniu à lesão neuronal induzida pelo OGD.

Pela literatura de pesquisa, TLR2 no sistema nervoso central (SNC) é realizado como a fonte direta do sinal prejudicial e um importante alvo terapêutico potencial. Em nossos resultados, as expressões de TLR2 e TNFα diminuíram aparentemente algumas horas após a adição dos compostos. No mesmo perfil, as expressões de TLR2 e TNFα com wogonin e wogonoside foram mais inibidas do que as expressões com baicalin e baicalein. A inibição da expressão começou a partir de 0,5 h após a administração de wogonin e wogonoside, porém a inibição da expressão TLR2 e TNFα apareceu mais tarde às 3 h após a administração de baicalin e baicalein. Portanto, o wogonin e o wogonoside foram realizados para ter preferência pelo TLR2. Combinados com suas estruturas químicas, todos os resultados implicaram que o grupo metoxil sobre carbono 8 na estrutura é a hipótese farmacófora do efeito da inibição de TLR2, relacionada à inibição da inflamação.

Condicionando a sobrepressão em TLR2 e TNFα por estes análogos, detectamos a caspase3 para confirmar se existia apoptose com a adição dos análogos. Comparando com o normal, a expressão da proteína caspase3 no modelo OGD de fato aumentou em algum grau, mas não mostrou diferença estatística. Com a administração dos quatro análogos, o nível da proteína caspase3 não mostrou alteração óbvia, embora tenha mostrado tendência a diminuir em 6 h e próximo ao controle normal (comparando com o normal ou o modelo, 𝑃>0,05). Os resultados acima sugerem que as células PC12 lesadas no modelo OGD não apresentaram apoptose aparente, e os quatro análogos também não puderam induzir apoptose nas células PC12 lesadas. De acordo com a literatura, a baicalina atenuou a lesão de reperfusão de isquemia cerebral global em gerbos por vias antioxidativas e antiapoptóticas, e a baicaleína e a wogonina poderiam ambas induzir a apoptose em células de câncer pancreático humano e em células de leucemia HL-60. Portanto, nossos resultados da apoptose por esses compostos precisam ser estudados mais a fundo.

Referindo-se à detecção de T-AOC, descobrimos que a sequência da capacidade total de antioxidação foi baicalina e wogonoside > baicaleína e wogonoside, indicando que uma forma glicosilada no local 2 de baicaleína e wogonoside desempenhou um papel fundamental na antioxidação geral.

Em conjunto, a baicalina e seus três análogos apresentaram de forma abrangente a proteção das células neuronais contra danos OGD e a inibição da expressão de TLR2 e TNFα (o fator a jusante), sugerindo a possibilidade desses compostos serem utilizados na terapia do AVC, visando o TLR2, um dos principais mecanismos do dano cerebral. Existe entre eles uma relação estrutura-actividade com a segurança, eficácia e especificidade da focalização do TLR2. Esta é a primeira vez que se estuda a baicalina e seus análogos naturais em alvos moleculares de TLR2 e TNFα, bem como T-AOC. Tudo isso terá benefício em elucidá-los e desenvolvê-los para as novas drogas.

A Contribuição dos autores

Os dois primeiros autores contribuíram igualmente.

A Agradecimentos

O autor agradece a todos os membros do seu laboratório. O estudo foi parcialmente apoiado pela National Natural Science Foundation of China (30801523, 81073092), pelo National S&T Major Special Project for New Drug R&D of China (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, e 2011ZX09101-002-11), e pela Special Foundation for Laboratory of Tsinghua University (LF 20103579).