Evidências emergentes para o papel oposto da apolipoproteína C3 e da apolipoproteína A5 no metabolismo lipídico e na doença arterial coronária O papel da apolipoproteína C3 e da apolipoproteína A5 no metabolismo lipídico e na doença arterial coronária

Apolipoproteína C3 (apoC3) e apolipoproteína A5 (apoA5) são codificados por grupos de genes APOA1/C3/A4/A5. Evidências de estudos genéticos, epidemiológicos e experimentos básicos têm demonstrado consistentemente que o apoC3 e o apoA5 são moduladores críticos do metabolismo dos triglicerídeos plasmáticos (TG). A deficiência de apoC3 ou apoA5 levou a uma significativa diminuição ou aumento do nível de TG plasmática em humanos e camundongos . Estudos mecanicistas aprofundados revelaram que o apoC3 inibiu a hidrólise da TG plasmática, a absorção de lipoproteínas remanescentes e promoveu a secreção da TG hepática, enquanto que o apoA5 regulou os metabolismos da TG plasmática de uma maneira completamente oposta . Estudos recentes revelaram ainda o papel adicional do apoC3 e apoA5 no colesterol remanescente (RC), na lipoproteína de alta densidade (HDL) e no metabolismo da TG hepática. Além disso, estudos genéticos populacionais em larga escala indicaram que a perda de mutações funcionais nos genes APOC3 e APOA5 conferiram diminuição e aumento do risco de doença arterial coronária (DAC), respectivamente. Assim, o apoC3 e o apoA5 surgem como potenciais novos alvos para reduzir o risco cardiovascular. Este manuscrito revisou principalmente as evidências existentes sugerindo o papel oposto do apoC3 e apoA5 no metabolismo lipídico e risco de DAC, e discutiu a correlação potencial entre essas duas apolipoproteínas.

Regulação da estrutura do gene e expressão

Clusters do gene APOA1/C3/A4/A5 humanos estão localizados no cromossomo 11q23, onde o gene APOC3 está aproximadamente 35 kbp a montante do locus do gene APOA5 . As suas sequências são conservadas evolutivamente . As regiões reguladoras do gene APOC3 humano contêm um conjunto de promotores proximais com quatro elementos (- 283/+ 24) e promotores distais com seis elementos (- 890/- 500) . Estudos anteriores com animais e culturas celulares estabeleceram que o intensificador APOC3 atuava como uma seqüência regulatória comum para direcionar a expressão dos genes APOA1, APOC3 e APOA4 hepáticos e intestinais. Entretanto, foi obtida expressão suficiente do gene APOA5 específico do fígado in vivo com um fragmento de DNA XhoI de 26 kb contendo apenas o gene APOA5 e, portanto, sem o realçador APOC3 . Gao et al. confirmaram ainda que o realçador APOC3 não afetou a expressão do APOA5 em ratos transgênicos . Na verdade, dois elementos na região promotora do APOA5 foram considerados críticos para direcionar sua expressão nas linhas de células hepáticas humanas .

A iniciação da expressão gênica é executada pela ligação específica dos fatores de transcrição aos elementos reguladores do gene, e as moléculas que afetam este processo podem regular a expressão gênica correspondente. A estrutura concreta e os mecanismos de regulação da expressão gênica do APOC3 e APOA5 foram revistos em outros lugares, e nos concentraremos aqui nos reguladores que são compartilhados pelo APOC3 e APOA5. De fato, várias moléculas foram implicadas na mesma direção na regulação da expressão do APOC3 e APOA5, incluindo upregulação com fator nuclear hepatócito 4-α (HNF4-α) e glicose , e downregulation com proteína quinase ativada por AMP, insulina e fator de necrose tumoral-α (TNF-α) . Notavelmente, essas substâncias, exceto a TNF-α, são componentes importantes diretamente envolvidos no metabolismo da glicose, sugerindo que a desregulação com APOC3 e APOA5 pode contribuir para a dislipidemia diabética. A regulação de direção oposta também foi encontrada no receptor peroxisome ativado pelo proliferador-α (PPAR-α) e receptor farnesóide ativado pelo X (FXR), promovendo APOA5 enquanto inibia a expressão APOC3 . Em contraste com o APOA5, o promotor do gene humano APOC3 não contém elementos de resposta positiva PPAR-α e FXR. Na verdade, esses dois receptores nucleares agiram indiretamente ao interferir na ligação de outros fatores transcripcionais, como HNF4-α, a elementos específicos do APOC3, inibindo ainda mais a transcrição do gene APOC3 . Assim, o efeito de redução do plasma TG de fibratos, um tipo de agonistas PPAR-α, pode ser parcialmente mediado pelo aumento da concentração circulante de apoA5 e/ou diminuição dos níveis de apoC3. De fato, estudos recentes mostraram que tanto a terapia com fenofibrados quanto a terapia com ácidos graxos polinsaturados ômega-3 diminuíram significativamente os níveis de apoC3 no plasma em humanos .

Bolbmetobolismo lipídico da plasma

Distribuição de lipoproteínas

Alclc3 e apoA5 foram principalmente associados com a proteína rica em triglicerídeos (TRL) e HDL . Estudos mostraram que o apoC3 e o apoA5 eram intercambiáveis entre o TRL e a HDL . No estado de normolipidemia de sujeitos humanos, a maioria do apoC3 plasmático estava vinculada ao HDL . Pelo contrário, em indivíduos com hipertrigliceridemia (HTG), o apoC3 foi maioritariamente encontrado em lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL) . Com o aumento da concentração de TG nas emulsões artificiais de TG, uma fração maior do apoC3 passou das lipoproteínas plasmáticas nativas para as emulsões artificiais . Glangeaud et al. encontrados durante a hidrólise mediada de lipoproteínas (LPL) de VLDL, o apoC3 redistribuído de VLDL para o estudo in vitro HDL, com a quantidade proporcional à magnitude da hidrólise de TG em VLDL, e o apoC3 foi subseqüentemente transferido de volta para partículas VLDL recém-sintetizadas de TG enriquecidas com VLDL . Da mesma forma, Nelbach et al. demonstraram que o apoA5 estava predominantemente associado ao HDL em ratos transgênicos APOA5, que tinham TG-raro VLDL, mas foi rápida e eficientemente redistribuído para VLDL rico em TG isolado de ratos nocturnos APOA5 no momento da incubação. Shu et al. também relataram que a injeção intravenosa de APOA5 contendo HDL reconstituído em camundongos nocauteados com APOA5 mostrou o mesmo padrão de troca de APOA5 entre HDL reconstituído e VLDL, e o APOA5 ainda permaneceu associado ao VLDL rico em TG devido ao rompimento da hidrólise VLDL.

Estes achados sugeriram que as distribuições de lipoproteínas do APOC3 e APOA5 estavam intimamente associadas com o conteúdo de TG em TRL. A maioria do apoC3 e apoA5 estava em HDL quando havia baixos níveis de TG no TRL. Uma grande parte do apoC3 e apoA5 foi redistribuída de partículas HDL para TRL quando as quantidades de TG aumentaram em TRL, e gradualmente voltaram para HDL com o processamento da hidrólise em TRL. Entretanto, a função biológica e o mecanismo de regulação do processo de troca não foram bem elucidados.

Plasma TG

ApoC3 e apoA5 são determinantes críticos da concentração plasmática de TG, como evidenciado pelas observações genéticas em humanos. A perda de mutações funcionais no gene APOC3 humano conferiu um baixo perfil plasmático da TG, enquanto pacientes com deficiência de APOA5 apresentaram níveis extremamente altos de TG plasmática. Anormalidades no apoC3 e apoA5 foram associadas a diferentes formas de HTG, tais como hiperquilomicronemia familiar, hiperlipidemia combinada familiar e disbetalipoproteniemia familiar. Curiosamente, estudos recentes mostraram a existência de um único local de glicosilação em Threonine 74 da proteína apoC3, dando origem a quatro proteoformas principais no plasma. A forma selvagem que não contém uma cadeia de glicosilanos é comumente referida ao apoC30a. Os outros três têm uma cadeia de glicanos de núcleo feita de uma galactose dissacarídeo ligado a N-acetilgalactosamina. ApoC30b é o proteofórmio que contém apenas o núcleo de glicano, enquanto apoC31 e apoC32 contêm um e dois resíduos adicionais de ácido siálico, respectivamente. Além disso, quatro proteoformas principais do apoC3 estão diferentemente correlacionadas com os níveis de TG de jejum. Foi descoberto que, usando a medida de imunoensaio espectrometria de massa, o apoC30a, apoC30b, e apoC31 tiveram relação positiva enquanto o apoC32 teve relação negativa com a TG plasmática de jejum, sugerindo que a análise de isoformas individuais do apoC3 poderia fornecer informações mais abrangentes do que apenas a concentração total do apoC3 plasmático.

Consistentemente, os ratos nocturnos APOC3 tinham diminuído a concentração de TG (- 30%) em comparação com os aleitólogos selvagens, enquanto os ratos transgênicos APOC3 mostraram um aumento do nível sérico de TG (+ 200% a 2000%) . Por outro lado, os nocauteados APOA5 tiveram um aumento (+ 400%) nos níveis de TG, enquanto os ratos transgênicos APOA5 apresentaram redução significativa (- 70%) neste parâmetro lipídico .

Estudos mecanicistas aprofundados revelaram que os níveis de TG plasmática regulada apoC3 e apoA5 através de múltiplas vias. O apoC3 inibiu a hidrólise de TRL mediada pelo LPL, circulando o resíduo de TRL e promovendo a secreção de TG hepática. Curiosamente, o apoA5 regulou o metabolismo da TG plasmática de uma maneira completamente oposta. Nomeadamente, o apoA5 acelerou a hidrólise de TRL, a absorção de restos de TRL pelo fígado enquanto inibiu a secreção hepática de TG (Fig. 1).

Plasma RC

RC é definido como o conteúdo total de colesterol do TRL, incluindo VLDL e lipoproteínas de densidade intermediária (IDL) no estado de jejum, e VLDL, IDL, e restos de quilomicron no estado sem jejum. Evidências crescentes indicaram que a RC é um fator de risco causal independente de doença cardíaca isquêmica. Além disso, níveis elevados de RC foram associados ao aumento da mortalidade por todas as causas em pacientes com doença cardíaca isquêmica .

Desde os metabolismos de TRL regulados apoC3 e apoA5, não é inesperado descobrir que as variantes dos genes APOC3 e APOA5 foram associadas aos níveis de RC. Em uma meta-análise de 137.895 indivíduos, a RC foi 43% menor em APOC3 heterozigotos com perda de função versus heterozigotos não portadores . Ao contrário, combinações genotípicas de variantes comuns do APOA5 (c.-1131 T > C, S19 W, e c.*31C > T) associadas a aumentos na RC de até 56% . Assim, visar apoC3 ou apoA5 parece ser uma abordagem potencial para reduzir os níveis plasmáticos de RC, que poderia ser testemunhada em futuros ensaios.

HDL

HDL exerce várias propriedades ateroprotetoras, incluindo efluxo mediador do colesterol, protegendo o endotélio vascular, efeitos anti-inflamatórios e anti-apoptóticos . O HDL com deficiências nestas propriedades é referido como HDL disfuncional, o que por sua vez contribui para a progressão da DAC. Estudos de observação humana indicaram que estas propriedades eram defeituosas sob distúrbios patológicos. Por exemplo, a capacidade de efluxo de colesterol comprometido foi encontrada com HDL de pacientes urêmicos . Riwanto et al. encontraram que o HDL de pacientes com DAC não ativa as vias endoteliais anti-apoptóticas, mas estimula potenciais vias endoteliais pró-apoptóticas. Por espectrometria e análises bioquímicas, estudos indicaram ainda comprometimento da função do HDL correlacionado com a alteração na sua composição proteômica, entre as quais alterações do apoC3 e apoA5 ganharam muitas atenções.

Riwanto et al. encontraram que houve significante aumento do apoC3 na partícula HDL de pacientes com DAC em relação aos controles saudáveis. Além disso, o uso do apoC3 neutralizador de anticorpos nestes HDL melhorou a função de apoptose anti-endotelial mediada pelo HDL. Cho KH mostrou aumento do conteúdo do apoC3 em HDL reconstituído artificial, reduzindo sua capacidade de ativação da lecitina acyltransferase (LCAT). Curiosamente, Luo M et al. demonstraram que o conteúdo de ApoC3 no HDL estava negativamente associado à capacidade de efluxo de colesterol mediado pelo HDL, porém, o mecanismo subjacente é desconhecido. Em contraste, a superexpressão mediada por adenovírus da APOA5 em ratos levou ao aumento do apoA5 na HDL, associado ao aumento da capacidade de efluxo do colesterol . HDL reconstituído sintetizado com mais apoA5 tinha maior tamanho de partícula, mais conteúdo lipídico e melhor capacidade antioxidante contra LDL in vitro .

O papel definido do apoC3 e apoA5 na função HDL precisa ser mais bem examinado. Tem sido relatado que o apoC3 em HDL pode se ligar ao receptor de catador B1 (SR-B1) , com domínio de estrutura descaracterizada. O SR-B1 é conhecido como um elemento importante no transporte reverso do colesterol, em parte para facilitar a absorção seletiva dos ésteres de colesterol do HDL pelo fígado. Se essa interação do apoC3 com SR-B1 influenciaria o transporte reverso do colesterol é indeterminada.

Secreção VLDL hepática

Uma das principais funções do fígado é sintetizar e secretar VLDL. VLDL é composto por um núcleo de lipídios neutros, principalmente TG, e várias apolipoproteínas . Das quais, a apolipoproteína B100 (apoB100) é a mais importante e fornece estabilidade estrutural à partícula VLDL. Existem dois passos para a biogénese da VLDL. Inicialmente, a formação da VLDL começa com a síntese do apoB100 no retículo endoplasmático (ER). O apoB100 nascente é então parcialmente lapidado para formar uma partícula VLDL primordial pobre em lípidos, que é facilitada pela proteína de transferência de triglicérides (MTP) do microssomo. Na segunda etapa da formação do VLDL, a partícula primordial VLDL funde-se com partículas ricas em triglicéridos para formar VLDL maduras e ricas em TG. Evidências crescentes indicaram que o apoC3 e o apoA5 regularam a lipidação VLDL e afetaram o conteúdo de TG hepática (Fig. 1).

Dados de cultura celular, experimentos com animais e estudos humanos confirmaram que o apoA5 inibiu a secreção de VLDL-TG e promoveu o armazenamento de TG em gotículas de lipídios citosólicos. McA-RH7777 células estavelmente transfectadas com APOA5 humanos secretam VLDLs que eram menores que as células de controle, mas tinham maior nível de TG celular e gotas de lipídios maiores. Em contraste, Ress et al. relataram que a derrubada de APOA5 em células HepG2 levou a uma diminuição no conteúdo de TG celular. Os fígados de ratos transgênicos APOA5 tinham um aumento do nível de TG hepática em comparação com os de animais selvagens. Qin et al. encontraram pacientes com doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) com expressão elevada de APOA5 em comparação com os controles saudáveis. No entanto, ainda há alguns enigmas que precisam de ser esclarecidos. Em primeiro lugar, onde uma porção de APOA5 escapa do caminho de secreção no sangue e se torna associada a gotas lipídicas citosólicas? Adicionalmente, como o apoA5 promove o armazenamento de TG hepática em gotículas lipídicas (LD) ao invés de secreção na forma de VLDL.

Estudos in vivo e in vitro mostraram que o apoC3 tem um efeito estimulante na lipidação de VLDL. A alimentação de ratos nocturnos APOC3 com uma dieta rica em gordura durante duas semanas não conseguiu estimular a produção de VLDL-TG, enquanto a reconstituição da expressão APOC3 usando o adenovírus que codifica o apoC3 humano resultou na produção robusta de VLDL-TG . O efeito estimulante do apoC3 humano na lipidação de VLDL foi recapitulado em células McA-RH7777 sob condições ricas em lipídios. Além disso, a mutação de resíduos no domínio de ligação de lipídios (K58E) do apoC3 aboliu esse efeito estimulante . Esses achados foram suportados em humanos pelas observações de que dois SNPs do APOC3 (C-482 T, T-455C), levando à diminuição da expressão do APOC3, foram correlacionados com o aumento do nível de TG hepática e maior prevalência de NAFLD na população indiana asiática .

A localização subcelular do apoA5 e apoC3 regulando a lipidação VLDL é proposta para ser o compartimento ER. Gao et al. hypothesized that apoA5 may facilitate the ER-luminal LDs budding outward to form cytosolic LD and hence reduce the TG mounted into VLDL particles . Qin et al. encontraram que o apoC3 promoveu a fusão de LD ER-luminal com partículas VLDL durante a lipidação VLDL . Estudos aprofundados focando na base molecular subjacente ao efeito do apoA5 e apoC3 na lipidação VLDL e no metabolismo do LD são necessários, o que proporcionará um novo entendimento da homeostase hepática do TG.

Associação com CAD

CAD tornou-se uma importante causa de morte em todo o mundo. O colesterol lipoproteico de baixa densidade (colesterol LDL) é bem reconhecido como tendo um papel crucial na patogênese da CAD, e a redução do colesterol LDL plasmático resulta em uma redução significativa na morbidade e mortalidade da CAD . No entanto, tem sido relatado que muitos indivíduos ainda sofrem de DAC, apesar de terem atingido o objetivo terapêutico para os níveis de colesterol LDL. Portanto, esforços estão em curso para identificar outros fatores de risco modificáveis para reduzir ainda mais o risco de DAC. Os dados genéticos da população estão livres de confusão e de causas inversas, sendo assim reconhecidos como uma importante forma de identificar novos fatores de risco potenciais de DAC.

Interessantemente, foi demonstrado que níveis plasmáticos apoC3 geneticamente reduzidos foram associados à diminuição do risco de DAC em humanos . Uma mutação sem sentido do gene APOC3, R19X, foi associada a uma redução de 50% dos níveis de apoC3 circulantes . Mais importante ainda, portadores da rara variante R19X tiveram menor incidência de calcificação coronária e menor risco de DAC em Framingham 10 anos . O efeito cardioprotetor do R19X e outras três variantes raras, duas mutações do local de emenda (IVS2 + 1G → A; IVS3 + 1G → T) e uma mutação missense (A43T) no gene APOC3, foi recentemente confirmado em dois estudos de grande escala . Em um estudo como parte do Exome Sequencing Project do National Heart, Lung, and Blood Institute, aproximadamente 1 em 150 participantes era um portador heterozigoto de pelo menos uma dessas quatro mutações, e os níveis circulantes de APOC3 em portadores eram 46% mais baixos do que os níveis em não portadores. O risco de DAC entre 498 portadores de qualquer mutação rara de APOC3 foi 40% menor que o risco entre 110, 472 não portadores. Consistentemente, em uma coorte de 75.725 participantes, as incidências cumulativas de doença vascular isquêmica e doença cardíaca isquêmica foram reduzidas em heterozigotos para mutações por perda de função em APOC3 (R19X ou A43T ou IVS2 + 1G → A) em comparação com não portadores, com reduções de risco correspondentes de 41% e 36% . Notavelmente, tem sido relatado que também houve uma tendência para menos eventos de doenças cardiovasculares adversas importantes em pacientes com proteoformas apoC32 mais altas, enquanto essas associações não foram detectadas para as outras proteoformas apoC3, sugerindo que o apoC32 é mais como uma proteoforma com perda de função .

Contrariamente, variantes do APOA5 que levam à diminuição dos níveis de apoA5 foram associadas ao aumento do risco de DAC . A associação entre -1131 T >polimorfismo promotor C do gene APOA5 e risco de CAD foi mostrada em uma grande meta-análise. A odds ratio para DAC foi de 1,18 por alelo C vs. alelo T . Além disso, vários estudos independentes têm indicado consistentemente que as variantes do APOA5 foram significativamente associadas ao risco de infarto do miocárdio (IM). Raffaele De Caterina et al. encontraram forte associação da variante do gene APOA5 -1131 T > C e da IM aguda precoce. Jorgensen AB et al. mostraram ainda variação genética no gene APOA5 (c.-1131 T. C., S19 W, e c.*31C. T) associada a um aumento de 87% no risco de IM . R et al. sequenciaram os exões do APOA5 em 6721 indivíduos com controles MI e 6711. Foram identificadas 46 variantes únicas de nucleotídeos não-sinônimos ou emendas de um único local ou emendas de emendas com frequência de alelos < 1%. Além disso, portadores dessas raras mutações no gene APOA5 (1,4% dos casos versus 0,6% dos controles) apresentaram risco 2,2 vezes maior para MI comparado aos controles .

Outras vezes, foi sugerido que os efeitos do apoC3 e apoA5 no risco CAD são parcialmente mediados por alterações nos níveis RC de plasma. Wulff AB et al. encontraram RC mediado em 37% dos 41% de menor risco de doença vascular isquêmica observada e 54% dos 36% de menor risco de doença cardíaca isquêmica observada no APOC3 heterozigotos com perda de função versus heterozigotos não portadores . Entretanto, as variantes do gene APOA5 (c.-1131 T. C, S19 W, e c.*31C. T) levam a um aumento genético do RC associado a um aumento do risco de IM . Por outro lado, as variantes gênicas do APOA5 (c.-1131 T. C, S19 W, e c.*31C. T) associados a aumentos na RC de até 56%, e com uma odds ratio correspondente para MI de 1,87 .

Correlação potencial entre apoC3 e apoA5

Desde que o apoC3 e o apoA5 regulam o metabolismo lipídico e associam com o risco CAD de forma oposta, é razoável questionar se eles funcionam de forma independente ou cooperativa. Alguns achados de ratos genéticos sugeriram uma relação próxima entre essas duas proteínas, embora não haja evidências atuais mostrando a interação direta entre elas. Pennacchio et al. demonstraram que ratos transgênicos APOA5 e nocturnos obviamente diminuíram e aumentaram o nível da proteína apoC3 hepática, respectivamente, enquanto não foram encontradas alterações significativas na abundância de mRNA apoC3. De fato, as quantidades de proteína apoC3 no fígado aumentaram 90% em camundongos APOA5 e diminuíram 40% em transgênicos APOA5 em comparação com os de tipo selvagem. Da mesma forma, o nível sérico apC3 declinou após a superexpressão do APOA5 humano em camundongos mediada por adenovírus. Esses achados implicaram que o apoC3 pode afetar o apoA5 em níveis transcripcionais, e vice-versa. Entretanto, os mecanismos subjacentes são desconhecidos.