Evolução, Diversificação e Biogeografia de Gafanhotos (Orthoptera: Acrididae)
Melanoplinae (146 géneros, 1.172 espécies) é a maior subfamília do Novo Mundo, que é bem caracterizada por um espesso pálio e por um complexo fálico e cerci macho específico de espécies. De todas as subfamílias de gafanhotos, Melanoplinae recebeu a maior atenção em termos de filogenética, e todos os estudos anteriores a recuperaram consistentemente como um grupo monofilético (Chapco et al. 2001, Amédégnato et al. 2003, Chintauan-Marquier et al. 2011, Chintauan-Marquier et al. 2014, Woller et al. 2014). Entre as melanoplinas, existe uma enorme quantidade de diferenças interespecíficas na morfologia genital (Hubbell 1932, Cohn e Cantrall 1974), principalmente nos machos, mas as fêmeas em alguns gêneros também mostram diferenças genitais específicas de espécies (Cigliano e Ronderos 1994). As Melanoplines não apresentam qualquer comportamento de cortejo pré-copulatório, tal como visual ou acústico. Em vez disso, o comportamento de acasalamento parece ser coercivo, no qual os machos se aproximam furtivamente e saltam para as fêmeas para iniciar a cópula (Otte 1970). Um estudo recente de Woller e Song (2017) examinou a morfologia interna da cópula em Melanoplus rotundipennis (Scudder, 1878) usando tecnologia micro-CT e esclareceu a função de muitos componentes genitais tanto em homens como em mulheres. A maioria das espécies da subfamília vive em pastagens e compete com o gado de pasto, e algumas espécies têm uma importância económica considerável nas serras norte-americanas e nas pastagens sul-americanas (Pfadt 1988, Cigliano et al. 2002). Muitas espécies de melanoplanos também estão adaptadas aos habitats alpinos na América do Sul nos Andes (Cigliano e Amédégnato 2010, Pocco et al. 2015, Scattolini et al. 2018) e na América do Norte nas Rochosas (Knowles 2001).
Clade D
Clade D (laranja nas Figs. 3 e 4) representa um grupo de subfamílias morfologicamente bem diferenciadas que se diversificaram no Velho Mundo. Com exceção da Catantopinae parafilética, as outras quatro subfamílias incluídas neste clade mostraram ser monofiléticas com forte suporte nodal. Em nossa filogenia, este clade é dividido em dois clades menores: 1) Eyprepocnemidinae, Calliptaminae e Euryphyminae; 2) Cyrtacanthacridinae e Catantopinae.
Eyprepocnemidinae, Calliptaminae, e Euryphyminae têm demonstrado consistentemente ter afinidades umas com as outras baseadas na morfologia (Dirsh 1975, Rowell e Hemp 2017), mas nosso estudo é o primeiro a propor claramente que elas constituem uma linhagem monofilética. Não se sabe muito sobre a biologia das espécies pertencentes a estas subfamílias, exceto para espécies importantes para a agricultura, como o gafanhoto italiano (Calliptamus italicus (Linnaeus, 1758)) e várias espécies de pragas menores em Eyprepocnemidinae (COPR 1982). A maioria das espécies parece estar associada a arbustos ou florestas, e várias espécies podem ser caracterizadas como geófilas, sendo frequentemente associadas a solo descoberto. Embora cada subfamília tenha um conjunto distinto de morfologia que as define, os gafanhotos deste grupo têm olhos um pouco aumentados, asas posteriores frequentemente coloridas e patas posteriores frequentemente coloridas (pelo menos na porção interna). Em nossa filogenia, Calliptaminae e Euryphyminae são mostradas como estando mais intimamente relacionadas entre si do que com Eyprepocnemidinae. Tanto as caliptaminas como as euryphymines são pequenas em tamanho e enigmáticas em coloração, assemelhando-se ao solo, e muitas vezes alimentam-se de plantas lenhosas. De certa forma, a sua coloração geral faz lembrar muitas edipodinas. Calliptaminae (12 gêneros, 93 espécies) é facilmente caracterizada pelo cerci macho tipo pinça, que são alongadas e fortemente incursionadas. A função destes cerci exagerados é desconhecida, mas são possivelmente utilizados para segurar as fêmeas durante a cópula. Curiosamente, o epífalo em caliptaminas não possui lophi, que funcionam como órgãos de preensão em outras espécies de gafanhotos (Randell 1963, Dirsh 1973, Woller e Song 2017). É possível que a elaboração de cerci macho corresponda com a redução de lophi. A Euryphyminae (23 gêneros, 87 espécies), intimamente relacionada, está confinada principalmente à África Austral e é caracterizada por cerci macho com grande articulação basal e placa supra-anal fortemente esclerótica. Ao contrário das caliptaminas, as euryphymines têm lophi bem desenvolvida. Além disso, a epífala está dividida no meio, semelhante às observadas em Oxyinae (Dirsh 1973, Rowell e Hemp 2017). Eyprepocnemidinae (26 gêneros, 159 espécies) é o grupo mais diversificado entre as três subfamílias, e é caracterizado por um dorso achatado de pronotum, cerci machos downcurved, e ancorae articulado de epiphallus. A maioria das eyprepocnemidines estão associadas a florestas ou bosques, mas algumas espécies são conhecidas por serem pragas de importância econômica (COPR 1982).
A subfamília Catantopinae (341 gêneros, 1.077 espécies) costumava ser um grupo de captura-tudo para incluir qualquer espécie de gafanhoto com o processo prosternal, mas agora sua definição foi reduzida para qualquer espécie do Velho Mundo e acrídio australiano com o processo prosternal que não se encaixa bem com outras subfamílias. Muitos dos gêneros catantopinos são monotípicos ou incluem um pequeno número de espécies. Como a sua definição de subfamília não se baseia em nenhuma característica morfológica distinta, esperava-se que as Catantopinae fossem paraplégicas, que é o que recuperamos, embora a nossa amostragem de taxon além dos táxons australianos tenha sido bastante esparsa. Todas as catantopinas da Austrália, exceto Stenocatantops Dirsh, 1953 e Xenocatantops Dirsh, 1953 formam um grupo monofilético com forte suporte nodal (Figs. 3 e 4). Cerca de 85% da fauna acre australiana (~300 sp.) pertence a Catantopinae e existe uma incrível diversidade morfológica entre estas catantopinas australianas (Key and Colless 1993, Rentz et al. 2003). O fato de espécies morfologicamente diversas confinadas dentro da Austrália formarem um clade sugere uma grande radiação adaptativa, equivalente à radiação dos marsupiais.
A subfamília Cyrtacanthacridinae (37 gêneros, 165 espécies) inclui alguns dos maiores gafanhotos, que também possuem algumas das mais fortes capacidades de vôo, dando-lhes seu nome comum de gafanhotos de asas de pássaros. O grupo é bem definido pelos lobos mesoesternais retangulares e sua monofonia tem sido apoiada anteriormente com base em uma filogenia morfológica (Song e Wenzel 2008), assim como o estudo atual. Esta subfamília inclui algumas das espécies de gafanhotos economicamente mais importantes do mundo, como o gafanhoto do deserto (Schistocerca gregaria (Forskål, 1775)), o gafanhoto da América Central (Schistocerca piceifrons (Walker, 1870)), o gafanhoto da América do Sul (Schistocerca cancellata (Serville, 1838)) e o gafanhoto vermelho (Nomadacris septemfasciata (Serville, 1838)).
Biogeografia histórica de Acrididae
A família Acrididae como um todo tem uma distribuição cosmopolita. Historicamente, muitos ortopedistas assumiram a origem da Acrididae como sendo a África, pois existe uma grande diversidade de outras famílias relacionadas, tais como Pneumoridae, Pamphagidae, Pyrgomorphidae e Lentulidae (Carbonell 1977, Jago 1979, Amedegnato 1993). O facto de a fauna de gafanhotos da América do Sul não ter sido estudada em profundidade até aos anos 70 e de a maioria dos ortopedistas europeus se ter concentrado inicialmente na fauna do Velho Mundo provavelmente também contribuiu para este pensamento. Por exemplo, Amedegnato (1993), que estudou extensivamente os gafanhotos sul-americanos, sustentou que Acrididae era originário do Velho Mundo e divergia dos Romaleidae devido à separação da África e da América do Sul. Entretanto, nossa análise biogeográfica, juntamente com estimativas de tempo de divergência, mostra um padrão muito mais dinâmico de diversificação e radiação, e lança uma nova luz interessante sobre a evolução desses gafanhotos.
Nosso estudo sugere a origem de Acrididae como sendo a América do Sul, o que é uma hipótese nova (Fig. 5). Deduzimos isto com base no grupo monofilético composto por Tristiridae (endêmico da América do Sul), Romaleidae (amplamente distribuído na América do Sul, estendendo-se à América Central e do Norte), Ommexechidae (endêmico da América do Sul), e Acrididae. Os outros grupos que incluímos neste estudo são todos restritos ao Velho Mundo e nenhuma das espécies pertencentes a estas famílias do Velho Mundo mostra qualquer afinidade morfológica com Acrididae. O estudo anterior de Flook e Rowell (1997) que agrupou Proctolabinae (subfamília endêmica do Novo Mundo de Acrididae) com a família Pamphagidae do Velho Mundo é mais provável devido à pequena amostragem de caráter molecular (930 bp de rRNAs mitocondriais) e amostragem de táxon esparso que não incluiu nenhuma das famílias endêmicas do Novo Mundo. Mesmo os autores mencionaram que esta relação era muito inesperada porque a relação não fazia sentido em termos de morfologia genital masculina.
Nossa análise biogeográfica usando BioGeoBEARS (Fig. 5) sugere que o ancestral comum de Tristiridae, Romaleidae, Ommexechidae, e Acrididae divergiram de seus parentes do Velho Mundo no Cretáceo tardio devido a vicariância quando o continente sul-americano se separou da África. Este antepassado comum deu origem às famílias atuais dentro da América do Sul, que foi essencialmente isolada até o surgimento do Istmo do Panamá, que agora é estimado que tenha ocorrido cerca de 20 MYA (Montes et al. 2015, Bacon et al. 2016), embora esta data mais antiga não seja universalmente aceita (O’Dea et al. 2016). Estimamos que os Acrididae tiveram origem no Paleogene inicial na América do Sul.
A mais antiga linhagem divergente dentro dos Acrididae inclui as subfamílias sul-americanas Marelliinae, Pauliniinae, Ommatolapidinae, Leptysminae, e Rhytidochrotinae. Com exceção da Rhytidochrotinae, que é distribuída principalmente nas florestas montanas da Colômbia (Descamps e Amédégnato 1972), as subfamílias restantes estão amplamente distribuídas na bacia amazônica e no norte da América do Sul, com algumas delas expandindo posteriormente o seu alcance até a América Central. Essa distribuição parece estar relacionada ao que tem sido chamado de região ‘pan-amazônica’ (Hoorn et al. 2010), uma grande região que incluiu a atual Amazônia, Orinoco, bacias hidrográficas de Magdalena e o rio Paraná durante o Paleogene. Esta vasta área foi caracterizada pela fauna diversificada que ali existia, cujos elementos hoje estão restritos à Amazônia. Além disso, a diversificação dessas subfamílias também poderia estar associada à grande zona úmida de lagos rasos e pântanos que se desenvolveram na Amazônia ocidental, originando-se em paralelo com a intensificação da elevação dos Andes (final do Mioceno médio) (Hoorn et al. 2010). Estes novos ambientes aquáticos, o “sistema Pebas”, pode ter favorecido a diversificação dessas subfamílias associadas a habitats pantanosos, florestas úmidas e dos pântanos. É interessante que estes gafanhotos continuem associados aos nichos em que os seus antepassados possam ter evoluído, em vez de habitats mais típicos terrestres e de pastagem que a maioria dos outros acrídios favorecem, o que pode sugerir a conservação do nicho ecológico ancestral dentro desta linhagem.
Durante o período inicial de diversificação na América do Sul, parece ter havido uma única colonização transatlântica para a África pelo ancestral comum dos clades B, C, e D (Fig. 5), que teve lugar no Paleogene inicial (~57 MYA). Embora a América do Sul e a África já estivessem separadas naquele ponto, estes dois continentes estavam mais próximos em comparação com a configuração atual e a dispersão através do ponto mais estreito entre os dois continentes poderia ter sido possível. Na verdade, existem vários organismos, como anfíbios e répteis, que apresentam padrões semelhantes (George e Lavocat 1993). Neste momento, o norte da África estava coberto de florestas tropicais, não muito diferentes dos habitats originais que os gafanhotos ancestrais viviam no norte da América do Sul. Uma vez na África, estes acrídios ancestrais poderiam ter rapidamente irradiado, dando origem a numerosas linhagens, que eventualmente se diferenciaram naquilo que hoje reconhecemos como diferentes subfamílias. No entanto, temos actualmente várias outras subfamílias no Novo Mundo espalhadas pela filogenia, para além das cinco subfamílias no clade A (verde na Fig. 5). Este padrão sugere que deve ter havido alguns eventos de recolonização que ocorreram do Velho Mundo de volta ao Novo Mundo. O nosso estudo pressupõe que houve pelo menos três ondas distintas de recolonização ao longo da diversificação de Acrididae.
A primeira onda de recolonização do Novo Mundo foi provavelmente uma colonização transatlântica a oeste pelo ancestral comum de Copiocerinae, Proctolabinae, e Melanoplinae que teve lugar no início do Eoceno. Não está claro como esse ancestral comum poderia ter recolonizado a América do Sul da África, mas a distância entre os dois continentes ainda era estreita o suficiente para que uma invulgar dispersão para o Ocidente tivesse ocorrido. Ao chegar, provavelmente ao norte da América do Sul, este antepassado comum deu origem ao que viria a ser as três subfamílias. Sabe-se que muitos proctolabines estão associados à família das plantas Solanaceae (Rowell 1978, 2013). A origem de Solanaceae foi recentemente colocada a hipótese de estar no Eoceno (Särkinen et al. 2013) e esta família tem grande diversidade nos Neotropics, o que fornece algum apoio para a diversificação dos Proctolabinae. Em comparação com Copiocerinae e Proctolabinae, que são subfamílias endêmicas relativamente pequenas, confinadas aos Neotropics, Melanoplinae é uma subfamília muito mais diversificada que irradia por toda a América do Sul, Central e do Norte, e se estende até a Eurásia. Muitas de suas espécies estão associadas tanto a pastagens quanto a habitats alpinos. Amédégnato et al. (2003) realizaram uma análise filogenética molecular de Melanoplinae e incluíram as tribos Melanoplini (América do Norte), Podismini (Eurásia), Dichroplini (América do Sul) e Jivarini (América do Sul). Eles recuperaram a colocação basal das tribos sul-americanas e apresentaram uma hipótese biogeográfica sugerindo que o centro de origem para esta subfamília era a América do Sul, após o que ela diversificou através da América do Norte e depois para a Eurásia. Chintauan-Marquier et al. (2011) encontraram um padrão biogeográfico semelhante, mas estimaram a data de divergência da subfamília em 69 MYA, que é anterior à nossa estimativa da origem de Acrididae. Woller et al. (2014) incluíram vários membros de Dactylotini (América Central) que não estavam bem representados nos estudos anteriores e recuperaram a colocação basal de Jivarini, seguidos por Dichroplini. O nosso estudo confirma a origem sul-americana da Melanoplinae e reforça a inferência sugerindo que a linhagem ancestral que deu origem à Melanoplinae e às duas outras subfamílias relacionadas na verdade originou-se da África. Estimamos que o ancestral comum da Melanoplinae divergiu das outras duas subfamílias no início do Eoceno (~43 MYA), dando origem ao Jivarini e ao Dichroplini. Então, esse ancestral expandiu-se para o norte, dando origem a Dactylotini e Melanoplini na América do Norte, e expandiu-se ainda mais para o oeste através da ponte terrestre de Behring para dar origem a Podismini na Eurásia Oriental. Vários membros da Podismini alcançaram a Europa e se especializaram nas cadeias montanhosas (Kenyeres et al. 2009), semelhante a como Melanoplus se especializou nas Montanhas Rochosas na América do Norte (Knowles 2001). A origem do Jivarini, que é distribuído exclusivamente nos Andes Centrais (Cigliano e Amédégnato 2010), coincide com a primeira elevação desta característica geológica, que se desenvolveu lentamente a partir de meados do Eoceno e atingiu um pico no Oligoceno Final e Mioceno Precoce (~23 MYA) (Gregory-Wodzicki 2000, Garzione et al. 2008, Hoorn et al. 2010). Assim, as terras altas dos Andes podem ter servido como rota de migração de Melanoplinae para a América do Norte.
A segunda onda de recolonização do Novo Mundo foi alcançada por várias linhagens dentro do complexo Acridinae-Gomphocerinae-Oedipodinae. Esta clade está especificamente associada à graminivoria (Uvarov 1966, Pfadt 1988) e a sua diversificação corresponde estreitamente à evolução e expansão dos prados e habitats abertos (Song et al. 2015). Com base em fósseis de pólen e phytoliths, Strömberg (2011) estimou que os prados se tornaram abundantes na Eurásia ocidental, América do Norte e sul da América do Sul durante o Eoceno. Embora o clade Acridinae-Gomphocerinae-Oedipodinae como um todo seja cosmopolita, mais de 70% da sua diversidade (~1.790 spp.) ocorre na região do Paleártico (África do Norte, Europa e Ásia temperada) e na região da Etiópia (África subsaariana), com a primeira região contendo mais de 48% da diversidade. Este padrão de diversidade, juntamente com a nossa análise biogeográfica e a diversificação das pastagens, sugere fortemente que este grupo teve origem na região Palearctic, a partir da qual diferentes linhagens expandiram as suas gamas, colonizando novas regiões. Além disso, a seleção sexual em canções produzidas por estridulação ou crepitação poderia ter tido outro papel importante na promoção de uma rápida especiação neste clade. Nossa análise indicou que houve numerosos eventos de recolonização do Velho Mundo para o Novo Mundo através da diversificação deste clade (Fig. 5). A relativa escassez deste clade nos Neotropicais (apenas 6,5% da diversidade) parece sugerir que as principais rotas de recolonização foram provavelmente da Eurásia para a América do Norte, quer através da rota Thulean (ou voos de dispersão através da Gronelândia) ou através de Beringia da Eurásia oriental para a América do Norte. Adicionalmente, poderia ter havido factores ecológicos, tais como a inadequação dos habitats e climas tropicais, que poderiam ter impedido a colonização dos Neotropicais.
A terceira onda de recolonização do Novo Mundo ocorreu na subfamília Cyrtacanthacridinae do Velho Mundo. O gênero Schistocerca Stål, 1873 é o único gênero desta subfamília que tem representantes tanto no Velho como no Novo Mundo, enquanto todos os outros gêneros ocorrem somente no Velho Mundo (Amedegnato 1993, Song 2004). Além disso, dentro de Schistocerca, o infame gafanhoto do deserto (S. gregaria) é a única espécie que ocorre na África enquanto o resto do gênero é encontrado em toda a América do Norte, Central, e do Sul. Estudos moleculares recentes têm colocado consistentemente o gafanhoto do deserto na base da filogenia de Schistocerca (Lovejoy et al. 2006, Song et al. 2013, Song et al. 2017), o que indica que o gênero teve origem na África, e sua diversidade atual é resultado de uma espetacular colonização transatlântica seguida de uma rápida radiação. Song et al. (2017) estimaram que o género divergiu dos seus parentes cerca de 6-7 MYA, quando a distância entre a África e a América do Sul era essencialmente idêntica à que é hoje. Em 1988, houve um grande enxame de gafanhotos do deserto que atravessaram com sucesso o Oceano Atlântico da África Ocidental até às Índias Ocidentais (Kevan 1989, Rosenberg e Burt 1999), o que sugere que um voo de tão longa distância poderia ter sido possível no passado. Taxonomicamente, existem outros dois gêneros no Cyrtacanthacridinae no Novo Mundo: Halmenus Scudder, 1893 nas Galápagos e Nichelius Bolívar, 1888 em Cuba. O primeiro é um pequeno gênero brachypteroso com quatro espécies (Snodgrass 1902), mas estudos filogenéticos recentes descobriram que o gênero está intimamente relacionado com duas outras espécies de Schistocerca de asas completas nas Galápagos (Lovejoy et al. 2006, Song et al. 2013, Song et al. 2017). Isto sugere que Halmenus é simplesmente uma Schistocerca braquicífera, e atualmente, estamos planejando uma revisão taxonômica para sinonimizar Halmenus com Schistocerca para refletir esta descoberta. Nicholius é conhecido apenas da série de três espécimes e não foi coletado durante os últimos 100 anos (Amedegnato 1993). Os espécimes do tipo parecem suspeitosamente semelhantes a Schistocerca, por isso é bem possível que seja um membro aberrante de Schistocerca. Portanto, é possível postular que houve realmente uma única colonização transatlântica pela Schistocerca ancestral, o que deu origem à diversidade atual no Novo Mundo.
Na Austrália, encontramos talvez a radiação adaptativa mais dramática entre todas as linhagens de gafanhotos. Nossa análise biogeográfica sugere que houve um único evento de colonização pelo ancestral comum de uma linhagem dentro de Catantopinae que entrou na Austrália no Eoceno médio a tardio. No meio do Eoceno, a Austrália já era uma ilha isolada, sem grandes ligações com outras massas terrestres. Quando a catantopina ancestral chegou à Austrália, ela deve ter encontrado vastas áreas de habitats complexos onde nenhum outro acrídio tinha entrado antes. As catantopinas australianas diversificaram-se em desertos, pradarias, matagais, florestas tropicais e habitats alpinos. Também é possível encontrar numerosas espécies nesta linhagem que convergiram para se assemelharem aos membros de outras subfamílias de acrídios (Rentz et al. 2003), espelhando fortemente a diversificação de marsupiais a partir de mamíferos placentários. A Austrália foi mais tarde colonizada por Acridinae, Oedipodinae, Cyrtacanthacridinae e Oxyinae, mas estes representam apenas uma pequena percentagem da diversidade de gafanhotos (68 spp.) no continente em comparação com Catantopinae (300+ spp.).
Observações Finais
Apesar da familiaridade e importância econômica dos Acrididae, uma filogenia em larga escala desta família nunca foi proposta até agora. O nosso estudo representa um passo crucial para a compreensão da evolução e diversificação destes insectos. Recuperamos a monofilética Acrididae e propusemos que a família fosse originária da América do Sul com base em evidências substanciais, ao contrário de uma crença popular de que seu centro de origem é a África. Mostramos também que os Acrididae divergiram no Cenozóico primitivo e representam uma das mais recentes linhagens divergentes dentro da Orthoptera, que teve origem no Permian primitivo (Song et al. 2015). Por causa da idade relativamente jovem de Acrididae, nós colocamos a hipótese de que a sua actual distribuição cosmopolita foi largamente alcançada pela dispersão seguida por radiação relativamente rápida em muitos casos. Estimamos que tenha havido uma série de eventos de colonização e recolonização (três grandes ondas) entre o Novo Mundo e o Velho Mundo através da diversificação de Acrididae e, portanto, a diversidade actual em qualquer região é um reflexo desta história complexa. Embora tenhamos descoberto vários padrões intrigantes, a nossa filogenia é reconhecidamente baseada em menos de 2% da diversidade actual de Acrididae. Portanto, ainda há muito mais a descobrir resolvendo a filogenia de Acrididae usando mais taxon e amostragem de caráter no futuro. Esperamos que o nosso estudo possa ser usado como uma base sólida para compreender a evolução destes fascinantes gafanhotos e que seja a base para futuros estudos taxonómicos.
Dados Suplementares
Dados Suplementares estão disponíveis em Insect Systematics and Diversity online.
Conhecimento
Agradecemos a inúmeros colaboradores que forneceram valiosos espécimes usados neste estudo: a falecida Christiane Amedegnato, Corinna Bazelet, Antoine Foucart, Claudia Hemp, Taewoo Kim, Kate Umbers, e Michael Whiting. Agradecemos também a vários colegas que forneceram apoio logístico e experiência durante as nossas expedições de campo: Corinna Bazelet, Stephen Cameron, Joey Mugleston, Michael Samways, e You Ning Su. Um grande número de estudantes contribuiu para a geração de dados moleculares ao longo de toda a duração deste projeto: Gabriella Alava, Grace Avecilla, Beka Buckman, James Leavitt, Matthew Moulton, Tyler Raszick, e Steve Gotham. Agradecemos a Charlie Johnson e Richard Metz no Texas A&M AgriLife Research Genomics and Bioinformatics Service pela geração e processamento de dados do NGS. Os comentários de dois revisores anônimos melhoraram significativamente o texto. Fieldwork to South Africa and Australia foi conduzido pelo autor sênior sob os números de licença CRO 177/08CR e CRO 178/08CR (Eastern Cape) e um número de licença SF007010 (Western Australia). Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (números de licença DEB-1064082 e IOS-1253493 para H.S.) e pelo Departamento de Agricultura dos EUA (Hatch Grant TEX0-1-6584 para H.S.).