Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Introdução

Serum albuminas são proteínas comumente usadas em bio-diagnósticos e como modelo em pesquisa de bio-interface (Rosi e Mirkin, 2005; Singh et al, 2005; Arcot et al., 2015). Entre estas, a albumina de soro bovino (BSA) é a mais barata e uma proteína amplamente utilizada como agente bloqueador nos testes ELISA (Maingonnat et al., 1999). No diagnóstico do papel, a BSA (Huang et al., 2018) aumenta seletivamente a hidrofobicidade do papel para melhorar os bio-fluidos e o fluxo de eluição, diminuindo a absorção de líquidos. A BSA protege e aumenta a vida útil das biomoléculas funcionais secas no papel. A funcionalidade e longevidade da imunoglobina G e da imunoglobina M secas em superfícies tratadas com BSA podem aumentar em uma ordem de magnitude (van Remoortere et al., 2001). BSA também previne adsorção inespecífica de proteínas de analitos para análise quantitativa.

Artigos múltiplos relataram extensivamente o fenômeno de sorção de moléculas de BSA em diferentes interfaces como ouro (Dennison et al., 2017), mica (Fitzpatrick et al., 1992), silício (Jachimska et al., 2016; Givens et al., 2017), e celulose (Mohan et al., 2014; Lombardo et al., 2017). A conformação da molécula de BSA adsorvida e a topologia da camada formada são fortemente afetadas pelo pH, força iônica e temperatura. As moléculas de BSA retêm sua estrutura nativa entre pH 4,0 e 8,0. Abaixo do pH 4,0 e acima de 8,0, as moléculas de BSA mudam sua conformação dobrável, que difere de sua estrutura nativa (Su et al., 1998a; Barbosa et al., 2010; Phan et al., 2015). O ponto isoelétrico da BSA está em pH 4,5. A este pH, a carga superficial líquida torna-se zero e as moléculas de BSA agregadas. O aumento do pH aumenta a carga de BSA e a repulsão eletrostática dominante estabiliza as moléculas de BSA e impede a agregação (Li et al., 2008).

Apesar de estar entre as proteínas mais estudadas, várias questões permanecem sobre o efeito que o pH e a força iônica têm sobre a conformação de BSA na adsorção. Neste contexto, o conceito de cobertura superficial, definido apenas por fração superficial ou densidade de peso, carece de clareza. Há uma necessidade de compreender melhor as variáveis que definem a interface sólido-líquido BSA para engendrar dispositivos de bio-diagnóstico robustos.

Adsorvimento de moléculas de albumina sérica bovina em uma interface formando uma camada com uma espessura na escala nanométrica. Alguns métodos de caracterização como a reflectividade (Su et al., 1998b, 2016; Raghuwanshi et al., 2017a, b), elipsómetro, microscópio de força atómica (AFM), ressonância plasmónica de superfície (SPR) e microbalança de cristal de quartzo com dissipação (QCM-D) podem medir a espessura da camada proteica adsorvida na escala nanométrica necessária. Em particular, o QCM-D pode monitorar cinecticamente o processo de sorção de biomoléculas medindo a massa protéica adsorvida em uma interface em nanogramas (Kristensen et al., 2013; Luan et al., 2017). O QCM-D permite o controle da temperatura, força iônica e pH do ambiente. O modo de dissipação do QCM revela a rigidez das camadas protéicas adsorvidas.

Neste estudo, é descrito um comportamento reversível de pH responsivo das moléculas de BSA adsorvidas na interface ouro-soro. A camada adsorvida de BSA comporta-se como uma esponja sensível ao pH, onde as moléculas de água adsorvem e desorbem, dependendo do pH ao redor, entre 4 e 8. Este trabalho monitoriza e quantifica o fenómeno de sorção de água na esponja BSA como camada e elucida os mecanismos envolvidos a diferentes pH e força iónica. É nosso objetivo descrever a cobertura de BSA na interface sólido-líquido em termos de número de moléculas e peso/espessura da camada. Isto é para esclarecer o conceito de cobertura de superfície biomolécula e para elucidar o comportamento dinâmico das moléculas de BSA adsorvidas no contexto do bio-diagnóstico.

Materiais e Experimentos

Materiais

Soro Bovino Pó Liofilizado de Albumina (97%) e sal de cloreto de sódio (NaCl) (99,5%) foram comprados da Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Austrália). Ácido clorídrico (HCl) e hidróxido de sódio (NaOH) foram comprados da Merck Ltd. Todos os produtos químicos são de grau analítico e utilizados sem qualquer purificação.

QCM-D Medidas

Microbalança de cristal de quartzo com medidas de dissipação foram realizadas em um instrumento E4-QCM-D da Biolin Scientific Ltd. Os sensores de cristal de quartzo revestidos a ouro foram usados após limpeza em uma solução de H2O2:NH3:H2O (1:5:5) por 15 min e seguidos de limpeza UV-Ozone por 10 min.

Os sensores de ouro foram colocados em módulos de células líquidas. 1 mg/mL de BSA foi dissolvido na solução salina (0,9% NaCl) e o pH da solução foi ajustado para pH 7,0 e 4,5. Separadamente, o pH da solução salina foi ajustado para 7,0 e 4,5. As soluções preparadas foram passadas através dos módulos de células líquidas por uma bomba peristáltica. Mudanças na freqüência de ressonância (F) e dissipação (D) do sensor de quartzo em relação à freqüência fundamental de 5 MHz e seis diferentes overtons (1, 3, 5, 7, 9 e 13) foram simultaneamente monitorados.

Primeiro uma solução salina foi bombeada na célula líquida e permitiu o equilíbrio para gerar uma linha de base estável. Posteriormente, o BSA em solução salina foi passado através da célula, e permitiu que as moléculas de BSA se adsorvessem na interface dourada. A solução salina foi então bombeada para remover quaisquer moléculas de BSA não adsorvidas. Os ciclos de enxaguamento de soro fisiológico a diferentes pH e água foram então os seguintes:

As variações obtidas na frequência de ressonância ΔF e a dissipação ΔD foram instaladas pelo modelo Sauerbrey, utilizando o software Dfind.

DLS Medidas

Dynamic light scattering (DLS) sobre o BSA disperso na solução salina a diferentes pH (4,5 e 7,0) foram medidas no analisador de tamanho de partículas DLS (Brookhaven Nanobrook Omni). Foi utilizada uma fonte de 40 mW (640 nm) de laser semicondutor vermelho com temperatura controlada. As medições foram realizadas três vezes e a média foi calculada. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente (22°C).

Medições de ângulo de contato

Angulo de contato em ouro e BSA adsorvido em diferentes pH em uma interface de ouro foram medidas usando uma configuração OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Alemanha. As medições foram conduzidas diretamente na superfície do sensor retiradas da configuração do QCM após a medição. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente (22°C). Um mínimo de cinco medidas de ângulo de contato foram realizadas na superfície do sensor e a média foi feita.

Microscópio de Força Atômica (AFM)

Medidas de microscopia de força atômica foram realizadas no modo de rosqueamento com um JPK Nanowizard III AFM. Os cantilevers (AC160TS-R3) selecionados para imagem tinham uma freqüência nominal de 300 kHz e constante de mola de 26 N/m. A imagem foi realizada na interface ouro nu e a camada BSA adsorvida a pH 4,5 na interface ouro. As imagens foram obtidas diretamente na superfície do sensor tiradas da configuração do QCM após a medição. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente (22°C).

Resultados

Um fenômeno de sorção de água com pH reversível de moléculas de BSA adsorvidas na interface sólido-líquido é estudado pelo QCM-D com ciclos de enxágüe de solução salina a pH 7,0 e 4,5. O ouro foi selecionado como interface sólida, pois sua hidrofobicidade direciona a adsorção de BSA (Lori e Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). As camadas de BSA adsorvidas a diferentes valores de pH são enxaguadas com ciclos alternados de soluções salinas a pH 4,5 e 7,0. Além disso, o enxágüe com água Milli-Q pura foi conduzido para avaliar o efeito da força iônica na camada adsorvida de BSA.

Figure 1 (Topo) mostra a mudança de freqüência (F5 e F7) para as moléculas de BSA adsorvidas a pH 7,0 da solução BSA/salina, seguido de enxágüe com a solução salina original (pH 7). O ciclo de enxágue seguinte foi realizado com a solução salina a pH 4,5. Ciclos alternados de soluções salinas a pH 4,5 e 7 e em seguida seguir.

Na Figura 1, após uma linha de base inicial estável, foi observada uma diminuição súbita em F que indica adsorção de moléculas de BSA na interface ouro-líquido. O F diminuiu até ΔF = -35,5 e estabilizou. Ao enxaguar com soro fisiológico (pH 7), o F aumentou de ΔF = -35,5 para ΔF = -34,0 o que mostra a remoção das moléculas de BSA não adormecidas da superfície. Após enxágüe com soro fisiológico (pH 4,5), o F aumentou ainda mais para ΔF = -30,0, revelando decadência de massa adicional da superfície do sensor. Surpreendentemente, ciclos posteriores de enxágüe com soro fisiológico (pH 7,0) diminuem F para ΔF = -34,0, o que significa um aumento de massa na superfície do sensor devido à absorção de moléculas de água na camada de BSA. Os ciclos posteriores de enxágüe salino seguem a mesma mudança de massa cíclica na interface dourada.

No segundo experimento, semelhante ao primeiro, a adsorção de moléculas de BSA a pH 4,5 foi seguida por ciclos de enxágüe salino a diferentes pH (Figura 1: Fundo). As moléculas de BSA adsorvidas correspondem à diminuição em F para ΔF = -38,5. O enxágüe com solução salina (pH 4,5) remove o BSA não adsorvido (ΔF = -38,0).

Seguindo o enxágüe com solução salina (pH 7,0) aumenta ainda mais a massa da camada na superfície dourada que corresponde à diminuição em F para ΔF = -43. O aumento de massa é devido à absorção de moléculas de água na camada de BSA. Mais tarde, a solução salina (pH 4,5) enxaguando desorbs as moléculas de água e traz de volta o valor de F para ΔF = -37. Cada ciclo de enxágue adsorve e desossa a mesma quantidade de moléculas de água.

Na mesma experiência, o efeito da força iônica sobre a camada adsorvida de BSA foi estudado ao enxaguar a camada com água pura. A Figura 1 mostra a adsorção de BSA a pH 7,0 e 4,5 seguida de ciclos de enxágüe com soro fisiológico a pH diferente e com água Milli-Q pura.

Em ambos os casos, o enxágüe com água aumenta o valor em ΔF = -29,2 (BSA adsorvido a pH 4,5) e -26,5 (BSA adsorvido a pH 7,0). Isto indica que o enxágüe com água diminui ainda mais a massa que corresponde a uma maior dessorção das moléculas de água da interface. Cada ciclo de enxágue sustenta o mesmo comportamento na mudança de massa que é devido à sorção de água na camada de BSA.

Interessantemente, em todos os experimentos, ciclos alternados de enxágue salino a pH 4,5 e 7,0 mostram a sorção reversível de moléculas de água dentro da camada de BSA adsorvida. O enxágüe da camada de BSA com soro fisiológico a pH 7,0 adsorve moléculas de água dentro da estrutura da camada de BSA, o que aumenta a massa da interface sólido-líquido. Em contraste, enxaguar a camada de BSA com soro fisiológico a pH 4,5 desorbs moléculas de água da camada de BSA, o que reduz a massa da interface. A sorção de água totalmente reversível medida indica que as moléculas de BSA não desorbitam durante o enxágüe e sua cobertura superficial permanece idêntica; apenas o número de moléculas de água na interfase varia.

O fenômeno de sorção de água no enxágüe salino (com pH diferente) ocorre apenas devido à camada de BSA adsorvida e é confirmado por um experimento de enxágüe salino separado no sensor de ouro nu (Material Suplementar S1). Uma linha de base estável na frequência do sensor de ouro nu é mantida pela solução salina (a pH 4,5). Posteriormente, a interface de ouro foi enxaguada com um ciclo alternativo de enxágüe salino de pH 7,0 e 4,5 (Material Suplementar S1). Os resultados mostram claramente que o enxágüe salino alternativo com pH diferente não tem efeito sobre a freqüência do sensor de ouro. Portanto, apenas a camada adsorvida de BSA sobre ouro exibe a mudança na frequência dos ciclos de enxágüe salino em diferentes valores de pH.

A massa adsorvida, a cobertura superficial e a espessura da camada adsorvida de BSA são extraídas encaixando o modelo Sauerbrey nos dados de QCM. O modelo é utilizado para encaixar uma camada rígida onde o valor de dissipação é inferior a 2, como observado em todos os nossos experimentos (Material Suplementar S2). A equação Sauerbrey é dada por Δm=-CΔfn, onde, C = 17,7 ng/Hz.cm2 é constante para o cristal de quartzo revestido a ouro de 5 MHz, n é o tom, Δm é a massa adsorvida e Δf é a mudança de frequência.

As moléculas de BSA adsorvidas até uma cobertura de massa de 6,3 mg/m2 (espessura 5,6 nm) a pH 7,0 (Figura 2A). O enxágüe da camada de BSA pré-adsorvida com solução salina (pH 4,5) diminuiu a cobertura de massa para 5,6 mg/m2 e sua espessura para 4,9 nm (Tabela 1), que é devido à liberação de moléculas de água da estrutura da camada adsorvida de BSA. Enxaguamento posterior com soro fisiológico (a pH 7,0) readsorve as moléculas de água na mesma quantidade. A diferença de variação de massa é Δm = 0.7 mg/m2.

Simplesmente na Figura 2B, enxaguando a camada pré-adsorvente de BSA a pH 4,5 com salina (a pH 7,0) aumenta a massa adsorvida de 6,4 mg/m2 para 7,4 mg/m2 e a espessura de 6,2 para 6,9 nm; isto se deve à absorção de moléculas de água na camada de BSA. O ciclo de enxágue da solução salina em diferentes valores de pH manteve a diferença de variação de massa de Δm = 1,0 mg/m2 que é 1,4 vezes maior que a variação de massa a pH 7,0 (0,7 mg/m2).

O número médio de moléculas de água adsorvida/desorvida na camada BSA durante o ciclo de enxágue salino é calculado a partir da diferença de massa adsorvida a diferentes pH (Material Suplementar S3). A camada de BSA adsorvida a pH 4,5 adsorve/desorve 3,3 × 1019 moléculas de água durante os ciclos de enxágue, o que representa 570 moléculas de água/ molécula de BSA (Tabela 1). Entretanto, a camada de BSA adsorvida a pH 7,0, adsorve/desorve 2,3 × 1019 moléculas de água, ou 450 moléculas de água/ molécula de BSA, durante o ciclo de enxágüe salino reversível.

Medições de Dispersão de Luz Dinâmica (DLS) esclarecem o estado agregado e não agregado de BSA em salina a pH 4,5 e pH 7,0 (Figura 3). Em pH 4,5, o DLS revela os agregados de moléculas de BSA e mostra múltiplas distribuições de tamanho: 5 nm, 10 nm, 20 nm e 50 nm. Entretanto, a pH 7,0, as moléculas de BSA não se agregam, devido às repulsões eletrostáticas, e têm distribuição de tamanho de 5 e 10 nm. O tamanho de 5 e 10 nm de BSA hidratado é comparável ao tamanho e forma das moléculas individuais de BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright e Thompson, 1975).

Imagens do microscópio de força atômica confirmam a adsorção da molécula de BSA na interface dourada (Figura 4). Estas imagens demonstram diferenças na morfologia da superfície de ouro nua (Figuras 4a,b) e a adsorção de BSA na interface de ouro a pH 4,5 (Figuras 4c,d). Ao comparar as imagens ampliadas da superfície absorvida do ouro descoberto (Figura 4b) e do BSA (Figura 4d), as diferenças entre as superfícies são perceptíveis. Embora ambas as superfícies tenham partículas que as formam, a definição e, portanto, o material imagerido é diferente. As partículas da superfície de ouro nu são mais definidas (por exemplo, limites mais nítidos entre as formas) o que indica um material mais duro quando comparado com a superfície revestida de BSA. O ouro revestido de BSA mostra a presença de agregados adicionais de moléculas de BSA. A imagem ampliada do AFM de ouro revestido de BSA (Figura 4d) mostra a dimensão lateral das moléculas agregadas de BSA varia entre 30 e 100 nm com altura na faixa de 5-15 nm.

O ângulo de contato formado por gotículas de água em duas superfícies: ouro e BSA adsorvido em ouro foi medido para esclarecer a molhabilidade (Figura 5). O sensor de ouro é hidrofílico com um ângulo de contato de 66°. No entanto, a camada de BSA adsorvida a pH 4,5 torna-se mais hidrofílica à medida que o ângulo de contato com a água diminui para 60°, que diminuiu ainda mais para 55° para a camada de BSA adsorvida a pH 7,0. Uma observação semelhante foi relatada para as camadas de BSA adsorvidas em uma superfície de silicone à medida que o ângulo de contato com a água diminuiu de 57° (a pH 4,5) para 54° (a pH 7,0) (Jachimska et al., 2016). Alterações no ângulo de contato e espessura da camada de BSA adsorvida em diferentes pH indicam diferenças estruturais e topográficas durante o processo de adsorção na interface dourada.

Discussão

O ponto isoelétrico BSA está entre pH 4,5-4,8; é o pH no qual a carga líquida da molécula se torna zero. Perto do ponto isoelétrico, as moléculas de BSA têm menos repulsão eletrostática entre moléculas. A alta resistência iônica da soro fisiológico (0,15 M) também desempenha um papel no rastreamento das cargas e no impedimento das interações eletrostáticas. Portanto, as moléculas de BSA agregam-se na suspensão BSA/salina. As medições DLS (Figura 3A) confirmam a presença de agregados de BSA de tamanhos até 60 nm na suspensão BSA/salina a pH 4,5,

Adsorção de BSA (a pH 4,5) na interface dourada, não se espera atração eletrostática de BSA em direção à interface dourada. Entretanto, uma carga positiva fraca da proteína globular de BSA pode fornecer um desvio suficiente para adsorção em uma interface (Su et al., 1998a; Jachimska et al., 2016). Vários artigos relataram anteriormente a adsorção de BSA e proteínas similares perto do ponto isoelétrico a ser impulsionada por interações hidrofóbicas que superam as interações eletrostáticas (Uyen et al., 1990; Tilton et al., 1991; Figueira e Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran et al., 2009; Rabe et al., 2011; Huang et al., 2017; Xu et al., 2018; Attwood et al., 2019). As medidas do ângulo de contato (Figura 5) mostram que a interface ouro nu é menos hidrofóbica, e a albumina se liga com o ouro através de interações hidrofóbicas (Norde e Giacomelli, 2000; Figueira e Jones, 2008). Como as repulsões das moléculas inter-BSA são rastreadas, as moléculas de BSA hidratadas adsorvem em grandes quantidades (6,4 mg/m2) como agregados e com múltiplos pontos de contato na interface de ouro (Figura 6A). A imagem AFM (Figuras 4c,d) confirma a adsorção e agregação de moléculas de BSA na interface de ouro. As imagens de AFM revelam a dimensão lateral dos agregados entre 30 e 100 nm com a altura distribuída entre 5 e 15 nm. Isto confirma as moléculas de BSA adsorvidas como uma combinação de conformações tanto em pé como planas.

A pH 7,0, as moléculas de BSA são carregadas negativamente. Isto cria uma repulsão electrostática entre as moléculas de BSA que impede a aglomeração de BSA em solução. As medições de DLS mostram a distribuição de moléculas de BSA não agregadas de tamanho 5 e 10 nm (Figura 3B). Estes tamanhos são comparáveis às dimensões das moléculas individuais de BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg et al., 1955; Wright e Thompson, 1975). Durante a adsorção de BSA no ouro, uma combinação de repulsão eletrostática e interações hidrofóbicas formam uma camada de BSA na interface. A forte repulsão lateral intermolecular entre as moléculas de BSA adsorvidas reduz a capacidade de adsorção de BSA (5,6 mg/m2) na interface. Portanto, as moléculas de BSA adsorvem como moléculas individuais (não agregados) e formam uma monocamada na interface dourada (Figura 6A).

Nos experimentos QCM-D (Figura 1), moléculas de BSA pré-hidratadas são adsorvidas na interface. Após uma lavagem salina alternativa com pH diferente, a camada de BSA adsorve ainda mais moléculas de água/desorbs. O BSA adsorvido a pH 4,5 entra e libera mais moléculas de água (1,0 mg/m2) em comparação com as moléculas de BSA adsorvidas a pH 7,0 (0,7 mg/m2). A razão é que a quantidade de BSA adsorvida a pH 4,5 (6,4 mg/m2) é maior do que a pH 7,0 (5,6 mg/m2).

A massa seca calculada (não hidratada) das moléculas de BSA adsorvida para cobertura completa da superfície do sensor de ouro é cerca de 2 mg/m2 (Material Suplementar S3). A massa seca calculada é comparável com a literatura relatada (Jachimska et al., 2016). Quando uma molécula seca de BSA é hidratada, seus grupos hidrofílicos são ligados com água rapidamente. A ligação deve-se à estrutura dipolar da água que interage com os grupos polares em BSA. Na BSA hidratada, algumas moléculas de água são ligadas firmemente, enquanto outras moléculas de água são ligadas frouxamente ou são simplesmente aprisionadas entre a estrutura do laço da BSA. A quantidade de água que hidrata a camada de BSA aumenta a fração de massa adsorvida na interface. No ciclo de lavagem salina com diferentes valores de pH leva a uma redistribuição das cargas na camada adsorvida de BSA. Esta redistribuição de carga cria um gradiente entre a camada adsorvida de BSA e a solução a granel. O gradiente age como uma força motriz para prender e liberar moléculas de água soltas da camada de BSA.

A espessura da camada de BSA é avaliada ajustando o modelo Sauerbrey aos dados do QCM-D (Figura 2). A camada hidratada de BSA adsorvida a pH 4,5 e enxaguada com solução salina (pH 7,0) dá a maior espessura de 6,9 nm (Figura 6B). A grande quantidade de moléculas de BSA adsorvidas (6,4 mg/m2) prende muitas moléculas de água que incha a camada de BSA. Lavar a mesma camada com a solução salina (pH 4,5) reduz a espessura da camada a 6,4 nm, o que se deve à libertação de moléculas de água da camada. Um fenómeno semelhante é observado para as moléculas de BSA adsorvidas a pH 7,0. Contudo, a espessura da camada de BSA é mais fina do que para a camada de BSA adsorvida a pH 4,5 (Figura 6B).

Outra, a camada de BSA adsorvida a ambos os valores de pH permanece rígida e irreversivelmente ligada durante os ciclos de enxaguamento salino. Apenas a sorção das moléculas de água ocorre durante a variação do pH. A rigidez e irreversibilidade do BSA adsorvido é devida ao grande tamanho e alto peso molecular do BSA. A molécula de BSA forma uma multiplicidade de pontos de contato na interface ouro-líquido por interações eletrostáticas e hidrofóbicas que impedem a dessorção das moléculas de BSA da interface.

A camada de BSA não se desprende da interface ouro mesmo com mudanças na resistência iônica da solução (enxágüe com água desionizada). O enxágüe com água apenas desabsorve mais moléculas de água da camada de BSA e a massa na superfície do sensor diminui ainda mais (Figura 2). A alteração da força iônica do BSA hidratado com água pura libera mais moléculas de água da camada. A camada de BSA encolhe a uma espessura de 4,8 nm (quando adsorvida a pH 4,5) e 4,3 nm (quando adsorvida a pH 7,0) como mostrado na Figura 6B. Os ciclos contínuos de enxágüe salino produzem o mesmo fenômeno reversível de sorção de água.

Conclusão

Albumina sérica bovina em solução salina (NaCl 0,9%) foi adsorvida na interface ouro-líquido a pH 7,0 e 4,5. O processo dinâmico foi medido pelo QCM-D e confirmado pelas medidas de AFM, DLS e ângulo de contato. Um fenômeno de sorção de água reversível, rápido e dependente do pH é observado para a camada de BSA adsorvida através da realização de ciclos de enxágüe de soro fisiológico a pH 4,5 e 7,0. As moléculas de água hidratam a camada de BSA a pH 7,0 e a desidratam a pH 4,5. A camada de BSA adsorvida a pH 4,5 é hidratada por 1,4 vezes mais moléculas de água do que a camada de BSA adsorvida a pH 7,0. Este fenômeno é explicado pelas diferentes conformações adotadas pelas moléculas de BSA adsorvidas a pH diferente. Perto do ponto isoelétrico a pH 4,5, as moléculas de BSA neutralizam e adsorvem como agregados em grandes quantidades: 6,4 mg/m2. A pH 7,0, as moléculas de BSA tornam-se carregadas (repulsão eletrostática) e adsorvem como uma camada de moléculas individuais a 5,6 mg/m2. A camada de moléculas agregadas de BSA (a pH 4,5) adsorvida na interface dourada prende mais moléculas de água (570 moléculas de água/BSA) do que a camada de moléculas individuais de BSA (a pH 7,0), que retêm 450 moléculas de água/BSA. A alteração da força iónica através da lavagem da camada de BSA com água pura apenas desorbata mais água da estrutura da camada adsorvida. Em todos os casos, a camada de BSA é rígida e irreversivelmente adsorvida na interface dourada e somente as moléculas de água adsorvem/desorvem durante o ciclo de enxágüe. O fenômeno observado é importante para o entendimento fundamental e para a engenharia de novos dispositivos de bio-diagnóstico e sensores robustos.

Data Availability Statement

Os dados brutos que suportam as conclusões deste artigo serão disponibilizados pelos autores, sem reservas indevidas, a qualquer pesquisador qualificado.

Author Contributions

VR, CB, e BY conduziram os experimentos. VR e GG realizaram a análise dos dados e escreveram o manuscrito.

Funding

Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council (ARC), artigo australiano, Norske Skog, Orora e Visy através do Industry Transformation Research Hub grant IH170100020.

Conflito de interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de qualquer relação comercial ou financeira que pudesse ser interpretada como um potencial conflito de interesses.

Material suplementar