Frontiers in Pharmacology

Introdução

Peptídeos biologicamente ativos são o termo geral para diferentes peptídeos que constituem diferentes composições e arranjos de aminoácidos naturais. Eles são conhecidos por possuir uma variedade de funções biológicas como antioxidante, imuno-promotriz, hormônio-modulador, antibacteriano, antitrombótico, antiviral, e anti-hipertensivo devido a compostos multifuncionais derivados de proteínas animais ou vegetais (Wang et al., 2017). Além disso, eles têm alta segurança alimentar e alta biodisponibilidade, o que os torna candidatos potenciais para o desenvolvimento de medicamentos peptídeos funcionais e aditivos alimentares funcionais (Sarmadia e Ismaila, 2010).

Como a Organização Mundial de Saúde estima, a CVD é responsável pela mortalidade de mais de 17,5 milhões de pessoas a cada ano. Entre as características importantes da DCV, a hipertensão é um alvo essencial para a prevenção e tratamento da DCV (Celermajer et al., 2012). As drogas atualmente usadas para baixar a pressão arterial, como captopril e enalapril, são limitadas em seu uso devido a reações adversas, como tosse, erupção cutânea e dor de cabeça (Yu et al., 2018). Entretanto, a incidência cada vez maior de DCV requer algumas alternativas novas e seguras, como peptídeos ativos derivados de alimentos. Ultimamente, têm sido feitos progressos significativos na identificação e no rastreamento de componentes alimentares que afetam positivamente a saúde cardiovascular (Martinez-Maqueda et al., 2012; Liu et al., 2018). Entre esses compostos, os peptídeos ganharam atenção especial devido ao seu efeito anti-hipertensivo. Anteriormente, a atividade hipotensiva in vitro dos peptídeos foi determinada principalmente pela medição da atividade inibitória da enzima conversora da angiotensina (ECA), que é uma carboxipeptidase dipeptídica localizada na membrana celular e que pode causar altos danos ao perturbar o equilíbrio entre os dois sistemas hormonais que regulam a pressão arterial e o equilíbrio de fluidos (Clayton et al., 2015; Gebre et al., 2018). Além disso, foi confirmado que os peptídeos anti-hipertensivos derivados de alimentos exercem um efeito hipotensivo em pacientes hipertensos sem qualquer toxicidade ou efeitos colaterais (Martinez-Maqueda et al., 2012). A separação e purificação dos peptídeos anti-hipertensivos das proteínas alimentares proporcionaria uma nova direção para o desenvolvimento de medicamentos anti-hipertensivos naturais.

Ginkgo biloba recursos de sementes têm sido amplamente estudados em todo o mundo devido à sua notável atividade biológica e ação farmacológica. A semente de Ginkgo, como Medicina Tradicional Chinesa, tem uma história de mais de 600 anos, mas pouco se sabe sobre os seus principais componentes activos. Apenas poucos estudos relataram os efeitos antioxidantes, anti-fadiga e bacteriostáticos das sementes de G. biloba isolado proteico (Lena e Philip, 2002; Huang et al., 2010). Wu et al. (2013) peptídeo de Ginkgo hidrolisado com alcalase e pepsina para obter dois peptídeos antioxidantes com a capacidade de procurar os radicais livres e inibir a peroxidação lipídica. No entanto, os peptídeos hipotensos de Ginkgo precisam ser mais explorados para desvendar seus mecanismos subjacentes para maior ação.

Hereína, usamos quatro tipos de proteases para hidrolisar GPI, a fim de escolher um dos hidrolisados com alta atividade inibitória da ECA e realizar ultrafiltração para obter componentes com diferentes MWs. Foram estudados os efeitos dos MWs na atividade inibitória da ECA dos GPHs. Também foi estabelecida a relação entre a composição de aminoácidos e a atividade peptídeo. Os peptídeos inibidores da ECA recém extraídos foram purificados, identificados e sintetizados; seus valores de IC50 foram testados e os padrões de inibição do peptídeo por Lineweaver-Burk plots foram explorados. Também elucidamos o mecanismo de inibição da ECA usando análise molecular docking.

Materiais e Métodos

Materiais

As sementes de G. biloba L. foram compradas da cidade de Linyi na província de Shandong, China. As sementes foram descascadas, descascadas e usadas para experimentação posterior. Angiotensina I- enzima conversora e hippuryl-l-histidyl-L-leucina (HHL), ácido hippúrico foram comprados da Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos) e Yuanye Bio-Technology (Shanghai, China), respectivamente. Captopril foi adquirido da MedChem Express (NJ, Estados Unidos).

Preparação de GPI

As sementes de G. biloba L. foram secas a 45°C, depois esmagadas em pó e peneiradas através de 80 mesh. O pó foi liofilizado após a desfenolação e o tratamento de desengraxe. As sementes de G. biloba em pó resultantes foram dissolvidas em DW (1:20, p/v; pH 10,0). A suspensão acima foi agitada e extraída durante 12 h seguida de centrifugação a 10.000 g durante 30 min. O sobrenadante obtido foi colocado no ponto isoelétrico da proteína ginkgo pH 4,62 e incubado por 60 min seguido de centrifugação adicional a 10.000 g por 30 min. O precipitado obtido foi ressuspenso utilizando água destilada, e a solução foi ajustada para o pH 7. Posteriormente, as GPI obtidas foram liofilizadas até a próxima utilização.

Preparação dos Hidrolisados de Proteína Ginkgo (GPHs)

Para isto, 4% de solução GPI foi preparada e hidrolisada separadamente com quatro proteases em suas condições ideais de hidrólise por 5 h. As doses enzimáticas foram de 2.000 U. Após a hidrólise, as enzimas foram inativadas a 90°C por 10 min e a solução foi centrifugada a 3.000 g por 30 min para obter os sobrenadantes individuais obtidos de quatro enzimas.

grau de hidrólise

O grau de hidrólise (DH) foi calculado referindo-se ao método de Kimatu et al. (2017) como se segue:

onde, B representava a quantidade (mL) de NaOH adicionado para manter o pH constante durante o processo de hidrólise; Nb era a concentração molar da solução de NaOH; MP era a massa (g) da proteína; α designava o grau médio de dissociação em substratos proteicos durante a hidrólise; htot era o número total de ligações peptídeas na proteína.

Isolamento e purificação do Peptídeo Inibitório da ECA

A ultrafiltração da amostra foi realizada usando o ultrafiltro tipo copo MSC300 (MoSu, Xangai, China). A amostra foi adicionada a partir da porta de alimentação e a garrafa de nitrogênio foi conectada à conexão da mangueira do copo de ultrafiltração. Em seguida, o copo ultrafiltrado foi colocado e embalado no agitador magnético conectado à garrafa de gás nitrogênio com uma pressão não superior a 0,22 MPa. As amostras foram passadas sequencialmente por membranas de ultrafiltração de 1, 3, 5 e 10 kDa e quatro componentes foram obtidos (<1, 1-3, 3-5, e 5-10 kDa). As quatro frações foram coletadas, liofiltradas e depois utilizadas para testar a atividade inibitória da ECA. Os componentes com maior atividade da ECA foram selecionados para posterior purificação de acordo com o procedimento dado por Zheng et al. (2017). O hidrolisado liofilizado (200 mg) obtido após ultrafiltração foi ressuspenso em água purificada para obter uma concentração final de 50 mg/mL e submetido a mais purificação usando a coluna de filtração em gel Sephadex G-15 (1,5 cm × 60 cm). As amostras filtradas com uma membrana de microfiltração e eluição foram realizadas com água destilada a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. A amostra foi monitorada e separada a um comprimento de onda de 220 nm usando HPLC semi-preparativo P270 (Aixin, Guangzhou, China). As frações (7,5 mL cada) foram coletadas e liofilizadas.

Determinação da Atividade Inibitória da ECA

Este teste foi realizado de acordo com as descrições dadas pelo relatório anterior de O’Loughlin et al. (2014) com algumas modificações. Em resumo, o substrato hippuril-histidil-leucina (HHL, 5 mM) e as amostras foram misturados em Na2 0,1 M (pH 8,3) com cloreto de sódio 0,3 M. Em seguida, 50 μL da amostra e 150 μL do substrato foram adicionados a um tubo de centrifugação, misturados e deixados em água a 37°C durante 5 min. Em seguida, a solução de ACE (50 mU/mL) foi adicionada e incubada a 37°C durante 45 min. A reação foi terminada pela adição de 250 μL de HCl 1M e a solução foi filtrada através de um filtro de seringa de nylon 0,45 μM antes de ser analisada por RP-HPLC (Waters, Milford, MA, Estados Unidos) em um Inertsil ODS-3 (250 × 4,6 mm, 5 μm tamanho da partícula). A fase móvel é composta de água destilada: acetonitrilo = 75:25 (V/V, com TFA de 0,1%) com vazão de 0,5 mL/min e detecção a 228 nm. Captopril foi utilizado como controle e a atividade inibitória (%) foi determinada como abaixo:

onde A era a área de pico do ácido hippúrico com a amostra, B estava sem a amostra.

Análise e Identificação de Sequências Purificadas de Peptídeo (MC-MS/MS)

As amostras purificadas foram analisadas por Q Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, Estados Unidos) usando um Easy-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific, MA, Estados Unidos). A amostra foi dessalgada e liofilizada, reconstituída em solução 0,1% de FA e armazenada a -20°C até a próxima utilização. As duas fases móveis foram as seguintes: a fase móvel A constituiu uma solução aquosa de ácido fórmico a 0,1%, e a fase móvel B foi uma solução aquosa de ácido fórmico a 0,1% de acetonitrilo (acetonitrilo foi 84%). Após o equilíbrio da coluna com 95% da solução A, a amostra foi carregada desde o auto-amplificador até a coluna Trap. A relação massa/carga dos fragmentos de peptídeos foi coletada da seguinte forma: um total de 20 padrões de fragmentos foram adquiridos após cada varredura completa. O arquivo cru do teste de espectrometria de massa foi pesquisado usando o software Mascot 2.2 para a base de dados correspondente.

Síntese de Peptídeos

Potenciais peptídeos inibidores da ECA identificados pelo LC-MS/MS foram sintetizados na GL Biochem (Shanghai, China). A pureza dos peptídeos sintéticos foi ainda confirmada por HPLC que foi superior a 95%.

Kinetics of ACE Inhibition

O modelo de inibição cinética do peptídeo G. biloba foi testado usando o método de Lin et al. (2017). Resumidamente, diferentes concentrações de substrato HHL (0,5, 1, 2, e 5 mM) foram permitidas para reagir com a ECA. O gráfico de Lineweaver-Burk foi baseado no recíproco da taxa de reação (1/v) e da concentração do substrato (1/). As interceptações nos eixos X e Y representaram os recíprocos de Km e Vmax, respectivamente.

Análise de Docking

Para isso, foi feito o download do arquivo de estrutura tridimensional da proteína ACE (PDB ID: 1O8A) do Banco de Dados de Proteínas RCSB (PDB1). A estrutura tridimensional dos peptídeos G. biloba foi desenhada utilizando o software de simulação molecular Discovery Studio 3.5. O processamento hídrico foi realizado e a energia foi minimizada pelo programa CHARMM. Além disso, o Zn2+ foi retido no modelo ACE. O software DS 3.5 pontuou o resultado da doca de acordo com a sua própria função de pontuação, com base nas pontuações e na energia livre combinada de cada resultado. Entre todos os resultados, um melhor resultado foi selecionado.

Análise Estatística

AnOVA de uma via, seguido pelos testes de múltiplos intervalos da Duncan usando o SPSS Statistics 20.0 (SPSS, Inc.), Chicago, IL, Estados Unidos) foi usado para análise de dados com diferença de significância (P ≤ 0.05).

Resultados

Atividade Inibitória de PHB

Como pode ser visto na Figura 1A, o DH foi prolongado com o tempo durante todo o processo de hidrólise. O DH aumentou rapidamente antes do intervalo de 2 h, e depois, a taxa de aumento diminuiu gradualmente com o tempo. Em geral, a taxa de hidrólise foi alta para 1 h inicial, que foi reduzida ou se tornou constante depois. Entre as quatro proteases, Alcalase teve o DH mais alto que atingiu 14,7% após 5 h, seguido pela tripsina (8,91%) e dispase (6,91%). O menor DH foi observado para a enzima sabor, que foi apenas 3,23% às 5 h. Estes resultados implicaram que o GPI foi clivado pelas proteases em diferentes locais, o que resultou em hidrolisados de proteínas com diferentes composições peptídeas.

As para a atividade inibitória da ECA dos quatro hidrolisados de protease, a atividade foi aumentada com DH ao longo do período de tempo. Como mostrado na Figura 1B, as atividades inibitórias da alcalase, tripsina, dispase e enzima aromatizante às 5 h foram 62,70, 39,81, 48,39, e 25,95%, respectivamente. Devido aos seus diferentes sítios de clivagem, diferentes peptídeos com diversas atividades inibitórias da ECA foram obtidos. Entre eles, a atividade do hidrolisado alcalino foi relativamente mais forte, o que indicou que a protease alcalina pode efetivamente produzir um hidrolisado com maior efeito inibidor da ECA.

ACE Atividade Inibitória da ECA de HPS e Fração de Membrana

A atividade inibitória da ECA dos HPS e as frações resultantes foram significativamente dependentes da MW, como mostrado nas Figuras 1C,D. A 1 mg/mL de concentração da amostra, a atividade inibitória da ECA aumentou gradualmente à medida que o MW dos componentes foi diminuindo. A atividade inibitória a 3-5 e 5-10 kDa foi de 44,94% (IC50 = 1,257 mg/mL), 44,04% (IC50 = 1,765 mg/mL), respectivamente. Posteriormente, a atividade aumentou gradualmente com o menor MW e atingiu o nível mais alto (69,86%; IC50 = 0,224 mg/mL) a <1 kDa.

Purificação dos peptídeos de Ginkgo

Alcalase é freqüentemente utilizada para a preparação de peptídeos ativos devido à sua ampla especificidade e forte capacidade de degradar proteínas. A partir do tratamento de ultrafiltração, foi revelado que a atividade inibitória da ECA melhorou com a diminuição do MW do polipéptido. Portanto, o peptídeo da fração <1 kDa foi purificado adicionalmente usando a coluna Sephadex G-15. Pode ser visto na Figura 2A, Sephadex G-15 foi dividido em três componentes (A1, A2, e A3). Os três componentes foram coletados e liofilizados, e suas atividades inibitórias da ECA foram medidas. Os resultados são mostrados na Figura 2B. As atividades inibitórias da ECA dos três componentes (1 mg/mL) foram 64,08, 58,55, e 74,96%, respectivamente. Portanto, o componente A3 mais ativo foi selecionado para identificação estrutural do próximo passo.

Identificação de Peptídeos Ginkgo e Síntese de Peptídeos

Para identificar o potencial peptídeo inibidor da ECA, o componente mais ativo A3 foi analisado pelo LC-MS/MS (Tabela Suplementar S1). Com base nisso, três peptídeos foram triados a partir do componente A3 e suas sequências de aminoácidos foram Thr-Asn-Leu-Asp-Trp-Tyr (TNLDWY), Arg-Ala-Asp-Phe-Tyr (RADFY) e Arg-Val-Phe-Asp-Gly-Ala-Val (RVFDGAV) (Figura 3). As sequências identificadas desses peptídeos foram compostas de 5-7 resíduos de aminoácidos. Para identificar a atividade inibitória da ECA dessas três frações de peptídeos, os peptídeos foram sintetizados quimicamente. Os peptídeos sintetizados obtidos foram identificados por espectrometria de massa (Figuras 4A-C). Os resultados mostraram que os valores de IC50 de TNLDWY, RADFY e RVFDGAV foram 1,932, 1,35 e 1,006 mM, respectivamente (Figura 4D).

Mecanismo Inibitório dos Peptídeos Ginkgo

O modo de inibição do peptídeo G. biloba foi analisado de acordo com o gráfico Lineweaver-Burk. Como pode ser visto na Figura 5, quando o peptídeo Ginkgo TNLDWY foi adicionado, tanto Vmax como Km foram alterados, Vmax aumentou com o aumento da concentração do peptídeo; enquanto Km não mudou significativamente com a concentração do peptídeo o que indicou que seu padrão de inibição pode ser um modo de inibição não competitivo. Para RADFY e RVFDGAV, Vmax não mudou significativamente com a concentração; enquanto Km aumentou com o aumento da concentração do peptídeo, indicando que ambos os peptídeos são inibidores competitivos, que podem se ligar aos sítios ativos da ECA, bloqueando assim a ligação da ECA ao substrato e inibindo a atividade da ECA.

Molecular Docking Simulation Between Peptides and ACE

Neste estudo, foi avaliada a interação de três peptídeos com a ECA. Os resultados mostraram que todos os peptídeos poderiam se ligar bem à ECA e formar um complexo estável, indicando seu uso como um potencial inibidor da ECA. O escore de – Cdocker Interaction Energy foi mostrado na Tabela 1. Os escores das frações TNLDWY, RADFY e RVFDGAV foram 102,995, 105,335 e 117,706, respectivamente. Os resultados da doca molecular foram mostrados na Figura 6 e na Tabela 2. A posição ótima de acoplamento de TNLDWY pode formar seis ligações de hidrogênio, entre elas formou ligações de hidrogênio com Ala 354, Tyr523 na bolsa ativa S1, His353, His513 na bolsa ativa S2, e resíduos Zn2+ e foi encontrada estavelmente ligada com todos eles. Isto pode estar relacionado com a forte atividade inibitória da ECA do peptídeo. Foi observado na Figura 6B que RADFY pode formar sete ligações de hidrogênio com resíduos de aminoácidos, e ligações intermoleculares de hidrogênio com os resíduos Gln281, His353, His513, e Tyr520 na bolsa ativa S2. A formação dessas ligações de hidrogênio estabilizou muito o complexo enzimático-peptídeo. Além disso, RADFY formou uma ligação iônica com Zn2+, conjugando forças com Val380, His383, Glu384, His387, Glu411, Lys511, e Tyr523, bem como van der Waals força com resíduo de aminoácidos Trp356. Estas interacções podem resultar na deformação do ligante Zn2+ e na inactivação da ECA. Em comparação com TNLDWY e RADFY, o RVFDGAV pode formar quatro ligações de hidrogênio com resíduos de aminoácidos, que foi estavelmente conectado ao ALA354, TYR523 na bolsa ativa S1, e Glu162 na bolsa ativa S1′. Entretanto, RVFDGAV poderia formar ligações iônicas com Zn2+, o que levou diretamente à desativação das moléculas de ACE. Além disso, formou um conjugado com os resíduos de aminoácidos como Glu162, His353, Glu376, Val379, His387, Phe391, His410, Phe457 e Phe527 (Figura 6C).

Discussão

Nos últimos anos, os peptídeos inibidores da ECA derivados de proteínas vegetais têm atraído cada vez mais atenção devido aos seus menos efeitos colaterais. Neste estudo, alcalase, dispase, tripsina e enzima de sabor foram usados para hidrolisar a proteína Ginkgo. A atividade inibitória de DH e ECA do hidrolisado da proteína Ginkgo obtida pela hidrólise da alcalase foi relatada como a mais alta. O processo de hidrólise ocorreu rapidamente durante o estágio inicial que resultou na hidrólise de muitas ligações peptídeas, depois, a taxa de hidrólise foi desacelerada devido à redução gradual da disponibilidade de substratos para hidrólise (Ketnawa et al., 2017; Hu et al., 2018; Wei et al., 2018). Estes achados foram consistentes com o relato anterior de hidrolisados de proteína de colza com ação inibitória efetiva da ECA quando hidrolisada com alcalase (He et al., 2013).

Angiotensina convertendo enzima é uma dipeptidase extracelular multifuncional presente em diferentes tecidos. A atividade inibitória da ECA baixa a pressão arterial reduzindo a produção de angiotensina II e reduzindo a destruição de cininas (Zheng et al., 2017). A atividade inibitória da ECA do hidrolisado estava relacionada com a distribuição do peso molecular. A ultrafiltração foi utilizada para separar o hidrolisado de Ginkgo em cinco componentes. Com peso molecular <1 kDa, a atividade inibitória da ECA do hidrolisado de Ginkgo foi relatada como a mais alta. Esta observação estava de acordo com estudos anteriores relatando a maior atividade da ECA de polipéptidos de baixa MW (Wang et al., 2015; Ola et al., 2017). Além disso, Silvestre et al. (2012) confirmaram que o tratamento de ultrafiltração pode reter peptídeos (AAA) na posição terminal C para promover a atividade inibitória da ECA.

Para purificar ainda mais o peptídeo inibitório da ECA altamente ativo, o componente Ginkgo (<1 kDa) foi separado por cromatografia de filtração em gel, e a seqüência de aminoácidos foi identificada usando LC-MS/MS. Assim, três novos peptídeos inibitórios da ECA foram obtidos: TNLDWY (1,932 mM), RADFY (1,35 mM) e RVFDGAV (1,006 mM) que mostraram forte atividade inibitória da ECA. Segundo relato de Hernández-Ledesma et al. (2011), a maioria dos peptídeos inibidores da ECA foram sequências curtas, consistindo em 2-12 aminoácidos. Além disso, a atividade do peptídeo inibidor da ECA estava fortemente relacionada com a presença de seu aminoácido C-terminal, aminoácido aromático e aminoácido hidrofóbico. Por exemplo, a presença do aminoácido aromático (Tyr, Phe e Trp) aumentou significativamente a atividade do peptídeo inibidor da ECA. Além disso, Arg também é conhecido por desempenhar um papel importante no peptídeo inibidor. Toopcham et al. (2017) mostraram que a atividade inibitória do peptídeo inibidor foi significativamente reduzida após a remoção de Arg. Além disso, Liu et al. (2018) provaram que aminoácidos como o Leu no peptídeo afetaram significativamente a atividade inibitória da ECA independentemente de sua posição no C-terminus ou no N-terminus. Resultados similares também foram relatados por Lee e Hur (2017). Estes estudos relataram os peptídeos KPLL, VLAQYK e DLP de diferentes materiais proteicos com uma atividade inibitória apreciável da ECA na presença do aminoácido hidrofóbico (Leu). Em nosso estudo, Tyr foi localizado no terminal C de TNLDWY e RADFY. Além disso, os dois peptídeos de RADFY e RVFDGAV continham Arg no N-termino, e o conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos nos três peptídeos era maior. Acima de tudo, os fragmentos dos peptídeos correspondiam às características estruturais dos peptídeos inibidores da ECA.

O modo de inibição dos peptídeos inibidores da ECA foi observado geralmente não competitivo, competitivo e misto. Para peptídeos curtos (2-12 aminoácidos), a maioria deles eram inibidores competitivos e se aglutinavam à enzima ECA a fim de evitar a ligação do substrato HHL. Um estudo semelhante realizado por Lin et al. (2017) provou que os peptídeos KYIPIQ e LPLPLL da caseína Qula exibiam um modo de inibição competitiva. Entretanto, para inibidores não competitivos, eles se ligam a outros locais que não o local de ligação do substrato da enzima e finalmente afetam a ligação do substrato à enzima. Padrões similares foram observados no caso de peptídeos inibidores alimentares como o PFPGPIPN da caseína Qula, e o peptídeo YLVR da avelã (Lin et al., 2017; Liu et al., 2018). Neste modo competitivo, ECA, substrato e peptídeo formaram um complexo enzima-substrato-inibidor, que impediu uma maior liberação do produto e resultou em uma diminuição do Vmax (Barbana e Boye, 2011).

Estudar o mecanismo de interação molecular entre ECA e peptídeos inibidores é útil para triagem e desenho de novos peptídeos inibidores da ECA. No entanto, informações inadequadas estão disponíveis sobre as interações moleculares dos peptídeos inibitórios. O docking molecular é baseado no “princípio de bloqueio e chave” dos ligandos e receptores, simulando a interação entre pequenos ligandos moleculares e biomacromoleculas receptoras. O modo de ligação e afinidade entre eles permite a triagem virtual de drogas. A ECA é uma enzima carboxipeptídica dependente de Zn2+, na qual o Zn2+ é uma parte importante do centro ativo da ECA (Pina e Roque, 2009). De acordo com dados reportados anteriormente (Pan et al., 2012), os principais resíduos de interação no local ativo da ECA foram divididos em três bolsas ativas (S1, S2, e S1′). S1 (Ala354, Glu384 e Tyr523); S2 (Gln281, His353, Lys511, His513 e Tyr520); e S1′ (resíduo Glu162). No local ativo da ACE, duas histidinas (His383 e His387) juntamente com Glu 411 constituíram um ligante Zn2+. Tem sido relatado que a inibição da atividade da ECA induzida pelo peptídeo pode ser alcançada pela combinação de complexos enzimático-peptídicos estáveis por ligação de hidrogênio (Fu et al., 2017). Além disso, a formação de forças van der Waals com resíduos de aminoácidos como His353, Ala 354, Ser355, Glu384, His513, e Pro519, conjugada com Tyr360 e interações não covalentes com Glu384, Arg522 também pode contribuir para a estabilidade dos complexos enzimático-peptídeo. A presença dessas forças tornará a estrutura do complexo enzimático-peptídeo mais estável, mais propícia à inibição da atividade da ECA, que pode ser a razão da forte atividade inibitória da ECA de TNLDWY, RADFY e RVFDGAV.

Conclusão

Neste estudo, sementes de G. biloba foram utilizadas para preparar peptídeos inibitórios potenciais da ECA. Os GPHs preparados a partir de diferentes proteases apresentaram diversas atividades inibitórias da ECA in vitro. As maiores atividades inibitórias da DH e da ECA in vitro foram observadas nos GPHs preparados a partir de alcalase. Os componentes obtidos por ultra-filtração com alcalase mostraram que os peptídeos MW menores conferiam a maior atividade inibitória da ECA. Três peptídeos inibitórios potenciais da ECA (TNLDWY, RADFY e RVFDGAV) foram obtidos da fração peptídeo (<1 kDa) por LC-MS/MS. O RVFDGAV mostrou a maior atividade inibitória da ECA com valor de IC50 de 1,006 mM e apareceu como um inibidor competitivo. Os resultados da acoplagem molecular indicaram que os peptídeos poderiam se ligar firmemente à ECA e interagir com resíduos de aminoácidos no local ativo da ECA. Nossos resultados indicaram que os peptídeos obtidos pela hidrólise enzimática da alcalase apresentaram atividade inibitória efetiva da ECA in vitro, o que os torna candidatos potenciais para o desenvolvimento de alimentos funcionais ou drogas anti-hipertensivas no futuro.

Author Contributions

F-FM, HW, C-KW, e KT estiveram envolvidos no desenho do projeto, realizaram a maioria dos experimentos, e redigiram o manuscrito. Z-JW e LJ contribuíram para o desenho experimental, preparação e submissão do manuscrito. Todos os autores participaram da redação do manuscrito e/ou revisaram-no de forma crítica por seu importante conteúdo intelectual.

Funding

Este estudo foi apoiado pelos Grandes Projetos de Ciência e Tecnologia da Província de Anhui (17030701024, 17030701058, e 17030701028) e pelo Projeto Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da Província de Anhui (1704g07020110 e 1804b06020347).

Conflict of Interest Statement

HW foi empregado pela Anhui Habopharmqnceutical Co, Ltd. Z-JW foi empregada pela Anhui Qiangwang Seasoning Food Co., Ltd.

Os demais autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Material Suplementar

O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2018.01579/full#supplementary-material

Pés

1. ^ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do