Frontiers in Plant Science

Introduction

Tensões bióticas reduzem drasticamente o rendimento das culturas, levando a enormes perdas económicas e a uma ameaça à segurança alimentar (Boyer, 1982; Bray et al., 2000; Cramer et al., 2011), um problema susceptível de ser exacerbado pelas alterações climáticas (Mittler e Blumwald, 2010; Lobell et al., 2011; Lesk et al., 2016). Ao mesmo tempo, a população humana mundial está crescendo continuamente; de 7 bilhões no final de 2011, espera-se que ultrapasse 9 bilhões de pessoas até 2050 (Nações Unidas, Departamento de Assuntos Econômicos e Sociais, Divisão de População, 2011). Consequentemente, espera-se que a demanda pela produção agrícola mundial duplique até 2050 (Tilman et al., 2011). No entanto, a maioria das novas terras com potencial para a agricultura está situada em ambientes duros, como terras secas e desertos, que cobrem cerca de 41% das áreas de terra do mundo (Millennium Ecosystem Assessment, 2005). Portanto, a melhoria do rendimento das culturas sob estresse múltiplo é vital para prevenir perdas onde as culturas são atualmente cultivadas e para cultivá-las em terras mais marginais.

A planta modelo, Arabidopsis thaliana tem fornecido muito da nossa compreensão das respostas moleculares das plantas ao estresse. Entretanto, a Arabidopsis é uma planta sensível ao estresse e, portanto, a busca por novos mecanismos e genes de tolerância ao estresse tem levado a um interesse crescente em plantas naturalmente tolerantes ao estresse, nativas de ambientes extremos – as chamadas “extremófitas” (John e Spangenberg, 2005; Amtmann, 2009; Dassanayake et al., 2009; Smaoui et al., 2011; Gechev et al., 2012; Oh et al., 2012; Bressan et al., 2013; Cheeseman, 2014; Flowers et al., 2015; Zhu et al., 2015). Uma estratégia bem sucedida tem sido o estudo de parentes extremófitos da Arabidopsis (Brassicaceae), como o hiperacumulador de metal Arabidopsis halleri (Hanikenne et al.., 2008), e os halófitos, Schrenkiella parvula (antiga Thellungiella parvula) e Eutrema salsugineum (antiga Thellungiella salsuginea ou Thellungiella halophila) (Volkov et al., 2003; Inan et al., 2004; Orsini et al., 2010; Koch e German, 2013). Além de ser tolerante ao sal (por exemplo, Inan et al., 2004; Taji et al., 2004; Kant et al., 2006), E. salsugineum também é tolerante a baixo nitrogênio do solo (Kant et al., 2008), altos níveis de boro (Lamdan et al., 2012), baixos níveis de fosfato (Velasco et al., 2016), stress térmico (Higashi et al., 2013), e apresenta tolerância ao stress frio e ao congelamento semelhante à Arabidopsis (Griffith et al., 2007; Lee et al., 2012). Vários factores contribuem para a tolerância ao stress do E. salsugineum, incluindo a regulação constitutiva para cima e para baixo dos genes e metabolitos de tolerância ao stress, sugerindo que o E. salsugineum está “primed” para o stress, a expansão do número de cópias de genes relacionados com o transporte de iões, a sub-funcionalização e a neo-funcionalização dos genes duplicados, o uso tendencioso do códão facilitando uma tradução mais eficiente das proteínas relacionadas com o transporte de iões e o possível envolvimento de genes específicos da linhagem (Taji et al, 2004; Gong et al., 2005; Kant et al., 2006, 2008; Lugan et al., 2010; Oh et al., 2010, 2012, 2014; Sun et al., 2010; Dassanayake et al., 2011; Wu et al., 2012; Champigny et al., 2013; Kazachkova et al., 2013; Yang et al., 2013).

As várias tensões às quais um extremófito exibe tolerância reflectem a combinação de tensões características de cada habitat específico. Assim, para obter uma compreensão abrangente de como as plantas lidam com múltiplas tensões, é vital investigar os extremófitos a partir de uma variedade de habitats diferentes. O deserto de Negev no sul de Israel, parte do cinturão do Saara e dos desertos árabes, é caracterizado por uma combinação de extremos de temperatura, baixa disponibilidade de água e nutrientes, e altos níveis de salinidade e radiação, e é considerado uma zona “árida” com uma precipitação anual entre 25 e 200 mm que é imprevisível com alta variação espacial e temporal (Gutterman, 2002; Ward, 2009). As temperaturas podem variar tanto diária como sazonalmente entre um máximo e mínimo diário absoluto de 46,8 e -3,6°C, respectivamente1. Estas condições extremas, juntamente com as “ilhas de salinidade do solo”, têm levado a adaptações morfológicas, fisiológicas e genéticas especiais que permitem às plantas prosperar. Assim, o deserto de Negev é uma provável caixa de tesouro biogenética de genes que estão relacionados a adaptações abióticas de estresse.

Passamos várias das 25 espécies de Brassicaceae extremófitas que habitam o Negev para tolerância a múltiplas tensões abióticas. Uma delas é a Anastatica hierochuntica (True Rose of Jericho), uma espécie vegetal do deserto saharaui anual de inverno, descrita pela primeira vez por Linnaei (1753), que coloniza as zonas mais altas e secas de wadies ou runnels (Friedman e Stein, 1980; Friedman et al., 1981). A. hierochuntica é bem conhecida devido ao seu mecanismo de dispersão de sementes higrochasy, pelo qual a planta morre, seca e a redução da pressão de turgor faz com que os ramos coalhem, protegendo as sementes e impedindo a sua dispersão (Friedman et al., 1978; Hegazy et al., 2006). Quando ocorre um evento chuvoso grave causando umedecimento da planta morta, os ramos se desdobram e as cápsulas das sementes (siliculae) se abrem. As sementes são então dispersas por gotas de chuva que atingem as silículas abertas (Gutterman, 2002; Hegazy et al., 2006). Assim, embora morto, A. hierochuntica tem sido frequentemente confundido com uma planta de ressurreição.

Aqui, nós examinamos se A. hierochuntica exibe tolerância ao calor, baixo teor de nitrato e stress salino associado com o seu habitat desértico. Tomando o stress do sal como um estudo de caso, determinamos se A. hierochuntica possui mecanismos fisiológicos de tolerância ao sal que são similares ao seu parente halófito, E. salsugineum, e se estes dois extremosfitos de ambientes muito diferentes desenvolveram estratégias metabólicas comuns e/ou específicas de espécies para lidar com o stress do sal.

Materiais e Métodos

Material vegetal e condições de crescimento

Sementes de Anastatica hierochuntica foram originalmente coletadas do Deserto de Negev (455881′ N e 200751′ E), Israel. A semente original foi bulkada nos campos experimentais da Universidade Ben-Gurion em Midreshet Ben-Gurion, e as sementes desta coleção foram posteriormente propagadas sob condições de sala de crescimento (16 h luz (150 μmol m-2 s-1)/8 h escuro; 22°C). Sementes da geração F4 foram utilizadas para experimentos apresentados no presente relatório. As sementes de A. thaliana (Col-0), A. hierochuntica e E. salsugineum (ecótipo Shandong) foram esterilizadas à superfície com lixívia comercial a 50% durante 5 min, e depois enxaguadas quatro vezes com água estéril. As sementes de A. hierochuntica foram semeadas em placas de ágar nutriente contendo meio MS (Murashige e Skoog, 1962), pH 5,7, 0,5 g L-1 MES, 2% (p/v) de sacarose e 0,8% (p/v) de ágar (Duchefa Biochemie), enquanto as sementes de Arabidopsis e E. salsugineum foram suspensas em 0,12% de agarose antes de serem semeadas em placas. As sementes foram estratificadas a 4°C (Arabidopsis, 4 dias; E. salsugineum, 7 dias; A. hierochuntica, 1 dia) e as placas incubadas na sala de crescimento. A semeadura das sementes das três espécies foi escalonada para que a germinação ocorresse aproximadamente ao mesmo tempo. Para experimentos de solo, mudas com cotilédones totalmente expandidos foram transferidas das placas para vasos de 7 cm × 7 cm × 8 cm contendo solo de Arabidopsis (Weizmann Institute of Science; 70% turfa fina , 30% perlite 4) e irrigadas para a capacidade do campo com 1 g L-1 de 20-20-20 NPK + solução de micronutrientes (químicos Haifa). Os vasos contendo vasos foram cobertos com cúpulas plásticas e colocados na sala de crescimento. Após 2 dias, as cúpulas foram gradualmente removidas para permitir o endurecimento das plântulas. A cada dia, placas ou vasos eram embaralhados para remover os efeitos de posição na prateleira. Embora para fins de estudos comparativos com Arabidopsis e E. salsugineum, as condições de luz na sala de crescimento estavam abaixo daquelas normalmente encontradas por A. hierochuntica, a Figura Complementar S1 mostra que as taxas de crescimento de A. hierochuntica permanecem sempre mais baixas do que a Arabidopsis mesmo com intensidades de luz mais altas. Isto sugere que o crescimento mais lento de A. hierochuntica em relação à Arabidopsis e E. salsugineum não foi um efeito das condições de luz da sala de crescimento.

Abiotic Stress Assays

Para análises in vitro baseadas em placas, o stress térmico (45°C) foi aplicado por vários períodos e as placas foram transferidas de volta para a sala de crescimento por mais 48 h. Para stress salino, baixo NO3- e stress oxidativo, as plântulas foram semeadas pela primeira vez em placas de EM de controle. Devido às diferentes taxas de crescimento radicular, as plântulas de A. hierochuntica e Arabidopsis foram transferidas para placas de tratamento de estresse, 1 e 5 dias após a estratificação, respectivamente. Para o ensaio de alongamento radicular, 10 plântulas uniformes foram transferidas para placas verticais quadradas de MS contendo várias concentrações de NaCl. Para prevenir qualquer efeito osmótico devido à absorção de sacarose nos tecidos aéreos (MacGregor et al., 2008), a parte superior do ágar foi cortada antes da transferência das plântulas para garantir que os brotos não estivessem em contato com o meio. Para os ensaios de stress baixo NO3 e oxidativo, as plântulas uniformes de Arabidopsis ou A. hierochuntica foram transferidas por 5 dias para placas quadradas verticais contendo macroelementos MS (menos nitrato de amônio para experimentos com baixo N) e microelementos, pH 5,7 (ajustado com KOH), 0,5 g L-1 MES, 2% (p/v) de sacarose, 0.8% (p/v) ágar (Duchefa Biochemie), e várias concentrações de KNO3- ou metil viologen (MV; Sigma, M-2254).

Para experiências no solo, tratamentos com sal foram aplicados a plantas com quatro folhas verdadeiras (Arabidopsis e E. salsugineum) ou duas folhas verdadeiras (A. hierochuntica). Os vasos foram irrigados com 1 g L-1 de 20-20-20 NPK + solução de micronutrientes suplementada com várias concentrações de NaCl. Os tratamentos com sal começaram com 50% da concentração final de sal, e uma semana depois, 100% de cada nível de sal foi aplicado. As plantas foram colhidas após uma semana adicional.

Crescimento, Pigmento, Ion, e Fluorescência de Clorofila Medidas

Pesos secos foram obtidos através da secagem de amostras a 75°C durante 3 dias. Para ensaios de alongamento radicular, o comprimento da raiz foi medido a cada 24 h durante 4 dias, e a taxa de crescimento relativo da raiz foi calculada para cada dia consecutivo de acordo com Hunt (1990). Para experimentos de estresse oxidativo, o alongamento radicular foi calculado usando a fórmula (L4-L0)/L4 onde L0 e L4 são comprimentos radiculares nos dias 1 ou 4, respectivamente, após a transferência para placas de VM. Para avaliar a área total das folhas, as folhas foram destacadas, colocadas entre dois filmes de transparência (Graphic Vision Media), e escaneadas. A área foliar foi calculada com o software ImageJ 1.432. O conteúdo de antociânico foi analisado de acordo com Kant et al. (2006). Os íons Na+ e K+ foram extraídos conforme descrito por Kant et al. (2006) e o conteúdo de íons determinado por fotometria de chama (Modelo 410 Fotômetro de chama, Sherwood Scientific, Ltd, UK). A clorofila e os carotenóides foram extraídos em 100% de metanol na proporção 1:10 do tecido para o solvente, mantidos durante a noite a 4°C no escuro, e medidos de acordo com Lichtenthaler (1987). A fluorescência da clorofila foi medida com um dispositivo Mini-PAM (Walz, Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemanha) aplicando uma curva de luz rápida (White e Critchley, 1999). A têmpera não fotoquímica (NPQ) e PSII ETR foram calculadas de acordo com Bilger e Björkman (1990) e Krall e Edwards (1992), respectivamente.

Número de cromossomos e conteúdo de DNA

Análise do número de cromossomos em jovens meristemas de ponta de rebento, usando uma técnica de gota-a-gota seguida de coloração DAPI e microscopia de campo brilhante de acordo com Anamthawat-Jonsson (2003). Para análise da citometria de fluxo do conteúdo de DNA 2C, foram preparadas suspensões nucleares por corte de 60-100 mg de tecido de ponta de rebento jovem em 1 ml de tampão de isolamento de núcleos gelados (NIB; Dolezel et al., 1989) com a adição de PVP-40 polivinilpirrolidona a 5%. Após a adição de mais 2 ml de NIB, as amostras foram agitadas durante 1 h, seguidas de filtração através de 50 μm malha de nylon e centrifugação a 1.900 rpm durante 8 min. O pellet contendo os núcleos foi ressuspenso em 1 ml de NIB gelado complementado com 50 μg m-1 de RNase A sem DNase e 2 μg ml-1 de iodeto de propidio (Sigma-Aldrich Chemical, Co., EUA), vorteado suavemente durante alguns segundos e depois incubado em gelo durante 10 min. As amostras foram filtradas através de uma malha de 35 μm e rodam num FACSVantage SE da Becton Dickinson equipado com um filtro passa-longo dicróico de 640 nm, um filtro passa-banda de 585/42 nm e um laser de íon-argônio refrigerado a ar afinado a 15 mW e operando a 488 nm. Para cada amostra, foram registrados 10.000 núcleos para calcular a posição média do pico G1 no histograma. A razão da fluorescência relativa das posições de pico G0/G1 para cada amostra foi comparada contra o padrão interno Raphanus sativus cv. Saxa como uma referência de tamanho de genoma (2C = 1.11 pg de DNA). O ganho do ciclímetro foi ajustado de modo que o pico G0/G1 de R. sativus foi posicionado no canal 1500.

2C conteúdo de DNA foi calculado como segue:

Amostra 2C = (posição média do pico de amostra G1/posição média do pico de referência G1) × DNA 2C de referência.

Perfil de Metabolic Profiling

Plantas foram cultivadas no solo e sujeitas a stress de sal como descrito acima. A quinta e sexta folhas de plantas Arabidopsis e E. salsugineum, e a terceira e quarta folhas de A. hierochuntica foram colhidas, combinadas, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. Quatro réplicas biológicas foram analisadas para cada tratamento e dois experimentos independentes foram realizados. A extração de metabolitos foi realizada de acordo com Lisec et al. (2006) com pequenas modificações (Kazachkova et al., 2013).

Derivatização foi realizada de acordo com Lisec et al. (2006) enquanto a separação, a avaliação cromatográfica e a identificação/anotração de metabolitos foram realizadas de acordo com Kazachkova et al. (2013). A abundância relativa de metabolitos foi determinada pela normalização da intensidade do pico de cada metabólito para o padrão do ribitol, produzindo valores de ‘resposta’. Estes valores foram normalizados utilizando a transformação log10 e analisados estatisticamente utilizando o software MultiExperiment Viewer Versão 3.1 (Saeed et al., 2003). Foram realizados testes de ANOVA bidirecionais entre todas as espécies e as espécies pareadas. Para identificar os metabolitos que foram significativamente afetados pelo tratamento com sal dentro de cada espécie (Figura 8), foi realizada uma ANOVA unidirecional (Tabela Suplementar S3) seguida por um teste Dunnett. Para análise de componentes principais (PCA), foram utilizados dados log10 de resposta transformada enquanto o agrupamento hierárquico foi realizado sobre valores de resposta linear divididos pela mediana da abundância de cada metabólito.

Resultados

A. A. hierochuntica Morphology, Genome Organization, and DNA Content

Na natureza, as plantas de A. hierochuntica exibem grande variação na velocidade de desenvolvimento e tamanho corporal variando entre alguns mm a 15-20 cm de altura, dependendo da disponibilidade de umidade do solo. A figura 1 mostra vários estágios de desenvolvimento da A. hierochuntica sob as condições do nosso laboratório. Em seus estágios iniciais de crescimento, as plantas são muito uniformes produzindo dois cotilédones seguidos por dois pares opostos de folhas obovadas, densamente hirsuídas verdadeiras (Figuras 1A-C). A bifurcação do rebento começa com a terceira e quarta folhas que se separam em ramos individuais. Uma inflorescência axilar é produzida no ponto do ramo e forma um grupo denso de flores sub-sésseis, brancas, com quatro pétalas (Figuras 1D,G,H). A bifurcação repetida ocorre entre pares subseqüentes de folhas mais lanceoladas, dentadas e hirsuteiras, resultando em uma estrutura de broto simpodial multibranqueada que pode variar muito na arquitetura tridimensional em geral (Figuras 1E,F). Os frutos são silículas peludas, de duas asas, contendo cada uma quatro sementes (Figuras 1I-K).

Foi relatado usando coloração ácida de carmim que o genoma A. hierochuntica está organizado em 11 cromossomos (haplóides) (Lifante et al., 1992). Para confirmar este achado, visualizamos os cromossomos de A. hierochuntica usando um protocolo de gotejamento com protoplastia (Anamthawat-Jonsson, 2003). A análise da coloração de 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) mostrou claramente a presença de 22 cromossomos (diploid) (Figura 2A). A citometria de fluxo revelou que o genoma A. hierochuntica é aproximadamente 4,5 vezes maior do que o genoma Arabidopsis (Figuras 2B,C). Para validar nossos resultados, também realizamos citometria de fluxo com E. salsugineum e mostramos que o genoma desta espécie é aproximadamente o dobro do tamanho do genoma do Arabidopsis, como relatado anteriormente por Inan et al. (2004). Assim, A. hierochuntica tem um genoma de aproximadamente 607 Mbp.

A. hierochuntica Exhibits Tolerance to Abiotic Stresses Associated with Its Desert Habitat

Anastatica hierochuntica plants can experience daily temperatures above 40°C. Além disso, o deserto de Negev é caracterizado por poças de nitrogênio do solo irregular (Zaady, 2005). Por exemplo, medimos os níveis de NO3 do solo variando de 0.4 a 4 mM (dados não mostrados). Portanto, testamos se A. hierochuntica apresenta maior tolerância ao stress térmico e baixos níveis de NO3- no meio de crescimento, do que a Arabidopsis. As plântulas cultivadas in vitro (estágio de dois cotilédones) de ambas as espécies sobreviveram a 1 h de stress térmico (45°C) com uma redução aproximada de 25% no peso fresco (FW) para ambas as espécies mas sem efeito no conteúdo de clorofila ou carotenóides (Figuras 3A-D; Figura suplementar S2). Duas horas de stress térmico afectaram gravemente as plântulas de Arabidopsis deixando-as pálidas ou branqueadas (Figura 3A). Este efeito refletiu-se em uma redução de 67% no FW, e uma redução de 45 e 54% no teor de clorofila e carotenóides, respectivamente, em comparação com as plântulas controle. Por outro lado, não houve redução adicional na FW das plântulas de A. hierochuntica em comparação com 1 h de estresse térmico e nenhum efeito nos níveis de clorofila e carotenóide em comparação com o controle. O stress térmico de 3 e 4 h causou um stress severo nas plântulas de Arabidopsis como manifestado pela ausência de crescimento de plântulas e pelo branqueamento quase completo dos cotilédones. Em contraste, A. hierochuntica mostrou uma tolerância ao calor consideravelmente maior do que a Arabidopsis após 3 e 4 h de stress térmico. Por exemplo, 4 h de stress de calor, causou uma queda de 50% na A. hierochuntica FW enquanto que a Arabidopsis exibiu uma redução de 73% na FW. Além disso, as mudas de A. hierochuntica não se tornaram branqueadas mas mantiveram os níveis de clorofila em aproximadamente 65% dos níveis de controle sem efeito do estresse térmico no conteúdo de carotenóides.

Anastatica hierochuntica também mostrou tolerância a baixo stress de N comparado com Arabidopsis (Figura 3E). A Arabidopsis mostrou uma redução progressiva e acentuada na FW como os níveis de NO3- foram reduzidos em ágar nutriente, exibindo uma redução de 75% na FW a 0.05 mM NO3- (Figura 3F; Figura Suplementar S3). Em contraste, A. hierochuntica mostrou uma queda muito mais moderada no FW como os níveis de NO3- foram reduzidos, e o FW caiu apenas 25% a 0.05 mM NO3-. A condição de alta tensão das mudas de Arabidopsis em baixos níveis de NO3- foi manifestada pela produção de quantidades progressivamente maiores de antocianinas à medida que os níveis de NO3- diminuíram (Figura 3G). Por outro lado, nenhuma diferença significativa no conteúdo de A. hierochuntica anthocyanin comparado ao controle pôde ser discernida em qualquer nível de NO3-.

Porque o deserto de Negev possui ilhas de alta salinidade e A. hierochuntica também é encontrada crescendo no vale do Mar Morto, nós testamos se A. hierochuntica exibe maior tolerância ao estresse salino do que a Arabidopsis. Uma redução muito maior no crescimento da Arabidopsis foi discernida à medida que a concentração de sal aumentou do que foi observado em A. hierochuntica (Figuras 4A-C; Figura Suplementar S4). Por exemplo, a 100 e 200 mM NaCl, a Arabidopsis apresentou uma redução de 55 e 77% na FW, respectivamente, enquanto a A. hierochuntica FW foi reduzida apenas em 30 e 48% na respectiva concentração iso-salina (Figura 4A). Da mesma forma, o peso seco foi afetado em menor grau na A. hierochuntica do que na Arabidopsis a 100 e 200 mM de NaCl (Figura 4B). A área foliar da Arabidopsis também foi afetada em maior extensão pelo estresse salino do que a A. hierochuntica. Por exemplo, a Arabidopsis exibiu uma redução de 74% na área foliar a 200 mM de NaCl enquanto a área foliar de A. hierochuntica caiu apenas 49% (Figura 4C). Além disso, em um ensaio in vitro de alongamento radicular em placas, as mudas de Arabidopsis mostraram uma clara e drástica redução da dose-resposta a sal na taxa de crescimento relativo das raízes, de tal forma que, a 200 mM NaCl, o alongamento radicular tinha virtualmente cessado (Figura 4D). Por outro lado, o NaCl 100 mM só teve um efeito leve na taxa de crescimento relativo da raiz A. hierochuntica enquanto o alongamento radicular continuou mesmo com NaCl 200 mM (Figura 4E).

A. hierochuntica Tightly Controls Na+ Accumulation and Exhibits Photochemical Characteristics that Are Resilient to Salt Stress

Uma característica da tolerância natural ao sal é a capacidade das plantas de controlar firmemente o acúmulo de Na+ (por exemplo, Kant et al., 2006). Sob condições de controlo, A. hierochuntica possuía cerca de 4,5 vezes mais Na+ nos rebentos do que a Arabidopsis, semelhante à quantidade triplicada de Na+ de rebentos de E. salsugineum em comparação com a Arabidopsis (Figura 5A; Kant et al., 2006). Ambas as espécies acumularam quantidades crescentes de Na+ à medida que as concentrações de sal aumentaram, mas o Arabidopsis acumulou Na+ em muito maior quantidade do que o A. hierochuntica (Figura 5B). Arabidopsis e A. hierochuntica exibiram níveis de Na+ comparáveis sob condições de controle e uma redução similar no conteúdo de K+ em resposta ao estresse salino (Figura 5C). Assim, sob condições de controle, A. hierochuntica teve uma relação Na+/K+ mais alta que a Arabidopsis (Figura 5D), mas à medida que as concentrações de sal no solo aumentaram, as relações Na+/K+ subiram para uma extensão muito menor em A. hierochuntica (Figuras 5D,E). Ambas as espécies exibiram proporções FW/DW semelhantes em todas as concentrações de sal (Figura 5F) sugerindo que as diferenças no conteúdo de íons não foram devidas a variações no conteúdo de água dos tecidos. Em conjunto, nossos dados de análise de íons sugerem que A. hierochuntica é capaz de controlar firmemente a acumulação de Na+.

Nós recentemente relatamos que A. hierochuntica sob condições de controle exibe menor NPQ, um mecanismo para dissipar o excesso de energia luminosa, do que Arabidopsis, e uma taxa relativamente maior de transporte de elétrons do fotossistema II (PSII ETR) (Eppel et al., 2014). No presente estudo, A. hierochuntica exibiu uma NPQ aproximadamente 50% menor que a Arabidopsis sob condições de controle (Figura 5G), e enquanto o stress do sal não teve efeito na NPQ da Arabidopsis, causou uma queda adicional de 50% na NPQ da A. hierochuntica. Sob condições de controle, a PSII ETR foi cerca de 55% maior em A. hierochuntica em comparação com a Arabidopsis (Figura 5H). O estresse salino causou uma queda na PSII ETR em ambas as espécies, mas A. hierochuntica ainda manteve uma PSII ETR 45% mais alta em comparação com a Arabidopsis. Assim, os dados NPQ e PSII ETR sugerem que A. hierochuntica photochechemistry exibe considerável resistência ao estresse salino.

Arabidopsis, E. salsugineum, e A. hierochuntica Metabolic Reprogramming in Response to Salt Stress

Eutrema salsugineum exibe extrema tolerância ao sal (Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013), o que nos apresentou a oportunidade de comparar três espécies relacionadas originárias de ambientes muito diferentes, e que diferem em sua tolerância ao sal: a aracidopsis glicófita sensível ao sal (Colúmbia temperada, MT, EUA), e as duas extremófitas – a moderadamente tolerante ao sal A. hierochuntica (deserto quente e seco de Negev), e a altamente tolerante E. salsugineum (áreas costeiras frias e salgadas da província de Shandong, China).

Arabidopsis, E. salsugineum, e A. hierochuntica plantas cultivadas no solo foram expostas a concentrações crescentes de NaCl (E. salsugineum não foi exposto a 50 mM de NaCl devido ao efeito suave desta concentração; Kazachkova et al, 2013), e a relativa abundância de metabolitos primários de carbono e nitrogénio foi determinada para o tecido foliar. Para obter uma visão global das diferenças entre as espécies de plantas e entre os tratamentos, foi utilizada a PCA. A inspeção dos dois primeiros componentes principais, que representam 68% da variância total dentro do conjunto de dados, permitiu a classificação das amostras por espécies e tratamentos (Figura 6). O primeiro componente principal, responsável por 48,2% da variância total, separou claramente o metabolismo da Arabidopsis dos seus dois parentes extremófitos (Figura 6A). Entre os metabólitos que mais afetaram a separação entre espécies (em ordem decrescente de valor eigenovectorial absoluto e confirmado pela ANOVA bidirecional) estavam rafinose, malato, galactinol, fumarato, ácido fosfórico e glicerato (Tabelas Suplementares S1 e S2). No geral, o teste ANOVA bidirecional para as três espécies revelou que 25 dos 33 metabolitos eram significativamente diferentes entre as espécies (Tabela Suplementar S2). Dentre esses 25 metabólitos, 22 metabólitos também apresentaram uma interação significativa espécie × tratamento com sal.

O segundo componente principal, que representa 19,8% do total de amostras discriminadas por variância, de acordo com o tratamento com sal. Entre os metabólitos que mais afetaram a separação entre amostras (em ordem decrescente de valor eigenvetor absoluto e confirmado por ANOVA bidirecional) estavam prolina, malato, rafinose, serina, fumarato e mio-inositol. No total, foram encontrados 20 metabólitos significativamente diferentes entre os tratamentos com sal (Tabela Suplementar S2). Os grupos de amostra de Arabidopsis controlados e tratados com sal foram substancialmente distribuídos pelo segundo componente, enquanto que os grupos de amostra de E. salsuginem e A. hierochuntica foram mais condensados.

A separação completa dos perfis metabólicos de Arabidopsis e dos dois extremófitos, e a resposta metabólica parcialmente sobreposta de E. salsugineum e A. hierochuntica sugeriu respostas comuns e específicas das espécies dos extremófitos ao estresse salino (Figura 6A). Esta noção foi apoiada pela análise hierárquica de agrupamento (HCA) que colocou as duas extremófitas em um clade separado do Arabidopsis mas separou E. salsugineum e A. hierochuntica em duas subclades (Figura 6C). A PCA das duas extremófitas por si só ilustrou claramente a resposta metabólica específica da espécie ao estresse salino (Figura 6B). Os metabólitos que afetaram principalmente a separação das extremófitas (em ordem decrescente do valor absoluto do autovetor e confirmado pelo teste ANOVA bidirecional) foram: prolina, citrato, aspartato, rafinose, ácido tríonico e ácido piroglutâmico (Tabelas Suplementares S1 e S2).

Examinação de metabólitos individuais sob condições de controle revelou um fenótipo metabólico global comparável entre os dois extremófitos com a maioria dos metabólitos exibindo uma abundância significativamente maior em A. hierochuntica e E. salsugineum em comparação com Arabidopsis (Figura 7). Entre os metabólitos que exibem diferenças entre a Arabidopsis e os dois extremófitos sob condições de controle estavam: (i) os intermediários do ciclo TCA, citrato e malato que foram significativamente maiores nos extremófitos, e fumarato que foi significativamente maior na Arabidopsis; (ii) os açúcares, glicose e frutose; (iii) os fosfatos hexose, fructose-6-fosfato e glucose-6-fosfato; (iv) o ácido fosfórico; (v) os antioxidantes, ascorbato e desidroascorbato (Foyer e Noctor, 2011). Os níveis dos metabólitos indicados em (ii) a (v) foram todos mais elevados nos extremófitos. Além disso, a prolina osmoprotetora (Smirnoff e Cumbes, 1989) foi maior nas plantas extremófitas sob condições de controle, enquanto os osmoprotetores myo-inositol (também precursor do osmoprotetor galactinol; Bohnert et al., 2006) e galactinol (também precursor do osmoprotetor raffinose; Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008) foram maiores em Arabidopsis. Curiosamente, a maioria dos metabólitos apresentou níveis significativamente mais baixos em A. hierochuntica comparado a E. salsugineum.

Inspecção dos níveis de metabólitos em resposta ao stress salino revelou apenas algumas respostas metabólicas comuns. Todas as três espécies exibiram níveis aumentados dos osmoprotetores myo-inositol e prolina em resposta ao stress do sal (Figura 8). Notavelmente, E. salsugineum exibiu maior conteúdo de prolina do que Arabidopsis e A. hierochuntica no controle e NaCl 100 mM. Níveis elevados de prolina são uma característica bem caracterizada do E. salsugineum cultivado no solo e bem fertilizado (Kant et al., 2006; Guevara et al., 2012; Kazachkova et al., 2013). Além disso, os níveis de glicina foram reduzidos em resposta ao estresse nas três espécies, embora o nível real de glicina tenha sido mais alto na Arabidopsis em todos os níveis de tratamento em comparação com os extremófitos.

Em contraste com as poucas respostas metabólicas comuns entre as três espécies, um número considerável de metabólitos exibiu uma resposta global comum em ambos os extremos que foi diferente daquela observada na Arabidopsis. Por exemplo, entre os aminoácidos, o nível de alanina na Arabidopsis diminuiu gradualmente em resposta ao sal, enquanto permaneceu constitutivamente alto nos extremófitos e até mesmo subindo ligeiramente em A. hierochuntica a 200 mM NaCl. O aspartato foi pouco detectável na Arabidopsis, mas aumentou substancialmente com a concentração de sal em ambas as espécies extremófitas, mas particularmente no E. salsugineum. Em contraste, os níveis de trionina aumentaram drasticamente na Arabidopsis, enquanto que permaneceram relativamente mais baixos nas extremófitas, com um pequeno mas significativo aumento na A. hierochuntica a níveis de sal mais altos. A serina e o glicerato, que são intermediários do ciclo fotorrespiratório, também apresentaram diferenças no acúmulo entre as extremófitas e a Arabidopsis. O conteúdo de serina aumentou em resposta ao sal tanto na Arabidopsis como na A. hierochuntica, mas acumulou-se a níveis consideravelmente mais elevados na Arabidopsis com a maior concentração de sal. Por outro lado, a serina apresentou apenas uma ligeira diminuição mediada por sal em E. salsugineum. Em geral, os níveis de glicerato foram muito mais baixos na Arabidopsis do que nas extremófitas. Além disso, enquanto o glicerato não apresentou resposta ao sal em Arabidopsis, foi mantido a um nível constantemente mais alto em A. hierochuntica e apresentou um aumento mediado por sal em E. salsugineum.

Os níveis dos intermediários do ciclo TCA, citrato e malato, foram substancialmente mais altos nos extremófitos em comparação com Arabidopsis. Entretanto, enquanto em E. salsugineum tanto o citrato quanto o malato aumentaram significativamente em resposta ao sal, os níveis de citrato em A. hierochuntica aumentaram significativamente enquanto o malato permaneceu a um nível constantemente mais alto do que em Arabidopsis. O conteúdo de fumarato, por outro lado, foi substancialmente mais alto na Arabidopsis, diminuindo em resposta ao stress do sal, mas permanecendo constantemente baixo nos extremófitos. Os níveis de outros ácidos carboxílicos, como o ascorbato e o desidroascorbato, foram constitutivamente mais elevados nos extremófitos do que nos arábidos.

Diferenças nos teores de açúcar entre os arábidos e os extremófitos também foram observadas. As diferenças mais marcantes foram nos níveis dos osmoprotetores galactinol e rafinose (Taji et al., 2002; Nishizawa et al., 2008). Ambos aumentaram drasticamente em Arabidopsis, mas foram induzidos em muito menor grau nos extremófitos. Além disso, o fructose-6-fosfato e o glucose-6-fosfato acumularam-se em maior extensão nos extremófitos, sendo mantidos em níveis gerais constantes em A. hierochuntica, enquanto significativamente reduzidos em E. salsugineum em resposta ao sal.

Nós também discernimos respostas específicas de espécies que diferenciaram entre os extremófitos. Por exemplo, o nível de serina em E. salsugineum foi significativamente reduzido pelo stress do sal, enquanto que em A. hierochuntica o conteúdo de serina aumentou significativamente. Piroglutamato (possivelmente parte do caminho de reciclagem do glutationa, um osmoprotector e um reservatório de Glu (Ohkama-Ohtsu et al., 2008; Kumar e Bachhawat, 2012; Schreiber et al, 2012), frutose, e glicerofosforglicerol, todos exibiram níveis constitutivamente mais elevados em E. salsugineum comparado com A. hierochuntica.

A. hierochuntica é Tolerante ao Stress Oxidativo Grave

Os níveis constitutivamente mais elevados dos compostos antioxidantes ascorbato e desidroascorbato em A. hierochuntica (e E. salsugineum) em comparação com Arabidopsis (Figuras 7 e 8) sugerem que A. hierochuntica possui um sistema antioxidante constitutivamente ativo. A comparação da resposta das mudas de Arabidopsis e A. hierochuntica à metil viologina formadora de ROS (MV) (Babbs et al., 1989; Fujii et al., 1990), demonstrou que as mudas de A. hierochuntica apresentaram notável tolerância ao aumento das concentrações de MV em comparação à Arabidopsis (Figura 9A). A. hierochuntica shoot FW e alongamento de raiz diminuíram em muito menor extensão do que a Arabidopsis à medida que a concentração de VM aumentava. Além disso, A. hierochuntica manteve níveis totais de clorofila em resposta a concentrações extremas de VM (12 μM) enquanto os níveis de clorofila foram reduzidos na Arabidopsis, que exibiu sinais de branqueamento (Figuras 9A-D; Figura Suplementar S5). Os graves sintomas de estresse observados na Arabidopsis também se refletiram no alto acúmulo de antocianinas em resposta à VM, enquanto apenas baixos níveis de antocianinas foram observados na A. hierochuntica (Figura 9E). Estes dados sugerem que A. hierochuntica tem um sistema antioxidante altamente ativo.

Discussão

Anastatica hierochuntica – A Lineage III Desert Plant that is Tolerant to Multiple Abiotic Stresses

A família Brassicaceae compreende mais de 3.600 espécies, incluindo muitas culturas importantes, bem como o principal modelo do sistema vegetal A. thaliana (Franzke et al., 2011; Al-Shehbaz, 2012). Ela contém 301 gêneros classificados em 49 tribos monofilíticas. A família pode ser dividida em dois grandes grupos: o grupo Aethionema e o grupo núcleo (Franzke et al., 2011), o último dos quais pode ser dividido em três grandes linhagens (linhagens I, II e III).

Nos últimos anos, vários recursos genómicos foram gerados para as Brassicaceae, proporcionando assim uma plataforma impressionante para estudos evolutivos e comparativos de biologia. Pelo menos 36 genomas foram sequenciados ou estão sendo sequenciados (Koenig e Weigel, 2015), incluindo 13 espécies da linhagem I (por exemplo, A. thaliana, Arabidopsis lyrata, Capsella rubella), 17 espécies da linhagem II ou da linhagem estendida II (por exemplo, A. thaliana, Arabidopsis lyrata, Capsella rubella), 17 espécies da linhagem II ou da linhagem estendida II (por exemplo, A. thaliana, Arabidopsis lyrata, Capsella rubella), Arabis alpina, Brassica napus, E. salsugineum, S. parvula), mas apenas três espécies da linhagem III (Diptychocarpus strictus, Euclidium syriacum, Malcolmia maritima) (Franzke et al., 2011; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015). Além disso, dos genomas completados, nenhum é da linhagem III. Esta rica coleção de genomas oferece um meio de entender características como características de desenvolvimento e história de vida que podem estar faltando em A. thaliana. Em particular, os extremófitos da família Brassicaceae que prosperam em alguns dos ambientes mais extremos oferecem excelentes sistemas para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à adaptação a ambientes severos.

O extreófito A. hierochuntica da tribo Anastaticeae pertence à espécie de linhagem III subrepresentada (Couvreur et al., 2010; Kiefer et al., 2014; Huang et al., 2015), para a qual há uma escassez de conhecimento fisiológico e molecular. Além disso, A. hierochuntica apresenta uma oportunidade de comparação de um deserto anual com Brassicaceae extremophytes como E. salsugineum que facilitará a nossa compreensão de como as plantas se adaptaram a habitats extremos muito diferentes.

No presente estudo, demonstramos que A. hierochuntica é tolerante a várias tensões associadas ao seu habitat desértico, nomeadamente altas temperaturas, baixo solo N, e salinidade (Figuras 3 e 4). Tanto a tolerância ao calor como a baixa tolerância a N são traços importantes para os quais A. hierochuntica pode ser uma fonte de novos determinantes de tolerância. O stress térmico, especialmente quando combinado com a seca, pode levar a enormes perdas na produção agrícola (Mittler, 2006; Mittler e Blumwald, 2010; Lesk et al., 2016), particularmente porque os cereais são mais sensíveis a estas tensões durante a fase de enchimento de grãos (Barnabas et al., 2008). De facto, um relatório recente identificou a tolerância ao calor no trigo na fase reprodutiva como sendo uma característica chave para aumentar os rendimentos sob as alterações climáticas previstas (Stratonovitch e Semenov, 2015). Embora relatórios detalhados sobre extremófitas capazes de suportar temperaturas extremamente altas sejam escassos, alguns trabalhos já começaram (Emad El-Deen, 2005; Lawson et al., 2014; Yates et al., 2014; Gallas and Waters, 2015). Rhazya stricta em particular, pode manter a fotossíntese totalmente funcional no campo a temperaturas de folha tão altas quanto 43°C juntamente com intensidades de luz >1000 μmol fotões m-1 s-1 (Lawson et al., 2014).

Nitrogénio eficiência de uso (NUE) é outro traço que tem sido o foco de muitas pesquisas e esforços de reprodução (McAllister et al., 2012; Han et al., 2015). As plantas cultivadas exploram apenas cerca de 30 a 40% do N aplicado (Raun and Johnson, 1999), e o N restante é perdido pela lixiviação, desnitrificação, volatilização, erosão do solo e consumo microbiano, aumentando assim a poluição ambiental e os custos de produção (Good et al., 2004). Como a criação tradicional de NUE melhorado atingiu um platô, o uso de extremófitos tolerantes a N baixo foi sugerido como uma abordagem para identificar novos alelos e genes (Kant et al., 2011). De facto, E. salsugineum é mais tolerante às condições de limitação de N do que a Arabidopsis, e possui maior teor de N, aminoácidos totais e proteína total solúvel a baixos níveis de N no solo (Kant et al., 2008). O maior NUE de E. salsugineum pode ser parcialmente atribuído à absorção constitutivamente maior de NO3- sob condições de baixo N, assim como a expressão diferencial de genes codificadores de NO3- assimilação e genes transportadores.

A. hierochuntica e E. Salsugineum Share Similar Salt Uptake and Photosynthetic Characteristics in Response to Salt Stress

Anastatica hierochuntica exhibited several physiological features of sal tolerance that are similar to those observed in E. salsugineum (Inan et al.., 2004; Kant et al., 2006). Primeiramente, sob condições de controle, A. hierochuntica possui níveis de Na+ de rebentos mais altos que o Arabidopsis (Figura 5). Em E. salsugineum, um teor de Na+ de rebento mais alto provavelmente ajuda a manter um potencial osmótico foliar constitutivamente mais negativo do que o Arabidopsis (Inan et al., 2004). Em segundo lugar, sob condições salinas A. hierochuntica exibe um controle rigoroso do acúmulo de Na+ comparado com Arabidopsis (Figuras 5A-D) novamente semelhante ao E. salsugineum (Kant et al., 2006). Uma corrente interna de Na+ significativamente reduzida e um menor influxo de Na+ nas raízes do E. salsugineum comparado com o Arabidopsis (Volkov e Amtmann, 2006; Wang et al., 2006), bem como a expressão diferencial de um gene que codifica o antiporter Na+/H+, SOS1 (Kant et al., 2006), provavelmente contribuem para o controle rigoroso da absorção de Na+ no extreófito.

Terceiramente, A. hierochuntica exibe um transporte de elétrons PSII mais alto e uma NPQ mais baixa que a Arabidopsis sob controle e condições salinas sugerindo que uma maior quantidade de energia luminosa é usada para fins produtivos em A. hierochuntica que em Arabidopsis (Figuras 5G,H). E. salsugineum também é capaz de manter uma NPQ mais baixa que a Arabidopsis sob condições salinas enquanto que o transporte de electrões PSII realmente aumenta em resposta ao sal (Stepien and Johnson, 2009).

A. hierochuntica possui um sistema antioxidante altamente ativo

Anastatica hierochuntica exibe níveis constitutivamente altos de compostos antioxidantes (Figuras 7 e 8) e uma tolerância impressionante à VM geradora de ROS (Figura 9) sugerindo que A. hierochuntica possui um sistema antioxidante altamente ativo, que é uma característica comum dos extremófitos. Em E. salsugineum e S. parvula, por exemplo, várias enzimas envolvidas na extração de ROS são altamente ativas, e metabólitos antioxidantes como thioredoxina, ascorbato e desidroascorbato exibem níveis constitutivamente mais altos que em Arabidopsis (M’rah et al., 2007; Kazachkova et al., 2013; Uzilday et al., 2014). A maior expressão dos genes E. salsugineum que codificam componentes da maquinaria antioxidante sob condições de controle e estresse salino pode estar subjacente às atividades enzimáticas e níveis antioxidantes mais elevados (Taji et al., 2004; Gong et al., 2005).

Mecanismos antioxidantes ativos não são importantes apenas para os extremófitos do deserto ou halófitos, mas também são cruciais para outros extremófitos. Por exemplo, plantas árticas como a Deschampsia antarctica, têm que manter a fotoquímica sob uma combinação de baixas temperaturas e alta luminosidade. D. antarctica possui constitutivamente maior atividade superóxido dismutase (SOD) em comparação com outras Poaceae, expressa um isozime MnSOD resistente a peróxido de hidrogênio durante a aclimatação a frio, e produz uma série de compostos protetores UV-B induzíveis (Xiong e Day, 2001; Perez-Torres et al., 2004; Ruhland et al., 2005).

Além dos mecanismos antioxidantes, os processos de dissipação de energia também podem prevenir a geração de ROS prejudiciais. Por exemplo, em extremófitas como A. hierochuntica e a planta alpina, Ranunculus glacialis, a fotorrespiração desempenha um papel na dissipação de energia (Streb et al., 2005; Eppel et al., 2014). No entanto, este não parece ser o caso do E. salsugineum. Pelo contrário, há um aumento mediado pelo stress nos níveis proteicos da oxidase plastida terminal que poderia funcionar como um sumidouro alternativo de electrões e evitar a geração de ROS (Stepien and Johnson, 2009). Curiosamente, a quantidade de PTOX nas folhas de R. glacialis excede a quantidade encontrada em todas as outras espécies de plantas examinadas, e mesmo quando o fluxo de elétrons para assimilação, fotorrespiração e a reação Mehler são bloqueados, as folhas de R. glacialis sob alta intensidade de luz podem manter o fluxo de elétrons (Streb et al., 2005; Laureau et al, 2013).

Assim, para os extremófitos que se deparam com uma combinação de tensões graves tais como A. hierochuntica (alta intensidade luminosa, altas temperaturas, baixo estado nutricional do solo, solos salinos), sistemas antioxidantes altamente activos frequentemente associados a mecanismos de dissipação de energia em excesso parecem cruciais para a sobrevivência em habitats extremos.

Extremófitos de diferentes habitats apresentam estratégias metabólicas comuns e distintas para lidar com o stress salino

Os nossos dados de perfil metabólico sugerem que os extremófitos possuem alterações no metabolismo comuns e mediadas pelo stress de espécies específicas que são diferentes da Arabidopsis (Figuras 6-8). Além disso, a análise da PCA sugeriu que os diferentes níveis de estresse salino causam mudanças muito maiores na Arabidopsis do que nas extremófitas (Figura 6) indicando que A. hierochuntica e E. salsugineum podem ser preparados para estresse de acordo com outros relatos sobre E. salsugineum (por exemplo, Kant et al., 2006; Kazachkova et al., 2013; Vera-Estrella et al., 2014). Mais apoio para a noção de que os extremófitos estão preparados para o estresse pode ser visto na análise dos níveis metabólicos sob condições de controle (Figura 7). Ambos os extremófitos mostraram acúmulo de antioxidantes, açúcares e intermediários do ciclo TCA, que se mostraram previamente importantes para respostas das plantas a vários estresses, incluindo sal e seca (Smirnoff, 1996; Urano et al., 2009; Lugan et al., 2010; Obata e Fernie, 2012). Nem todos os extremófitos, no entanto, estão preparados para o stress. Por exemplo, a leguminosa extreófita tolerante ao sal Lotus creticus não exibe tal fenômeno (Sanchez et al., 2011).

Diferenças marcantes foram observadas entre os extremófitos e Arabidopsis na abundância de intermediários específicos do ciclo TCA. Ambos os extremófitos exibiram altos níveis de malato e citrato, mas baixos níveis de fumarato, enquanto a Arabidopsis mostrou o padrão oposto (Figuras 7 e 8). Essa assinatura metabólica parece ser uma característica importante das extremófitas Brassicaceae sob controle, sal e condições de baixo N e independentemente das plataformas de crescimento (Kant et al., 2008; Kazachkova et al., 2013). Especulávamos anteriormente que um grande aumento no pool de malato e baixos níveis de fumarato poderia refletir a geração de oxaloacetato para fornecer esqueletos de carbono para uma síntese melhorada de aminoácidos em E salsugineum (Kazachkova et al., 2013). O oxaloacetato pode ainda ser metabolizado para aspartato (Sweetlove et al., 2010), e de fato observamos maior controle e níveis de aspartato induzido pelo sal nos extremófitos em comparação com a Arabidopsis. Um uso de níveis mais elevados de aspartato pode ser o fornecimento de grupos de aminoácidos para o ciclo fotorrespiratório via glicina (Novitskaya et al., 2002). A alanina também pode contribuir com aminogrupos para a glicina durante a fotorrespiração (Liepman e Olsen, 2001; Novitskaya et al., 2002), e os extremófitos foram capazes de manter os níveis de alanina sob controle e condições de estresse salino, enquanto o conteúdo de alanina diminuiu na Arabidopsis em resposta ao sal. Consistente com a idéia de que os extremófitos podem manter o fluxo metabólico através do ciclo fotorrespiratório, a razão glicina/soro sempre foi menor nos extremófitos do que na Arabidopsis. Uma alta razão glicina/ serina frequentemente se correlaciona com a oxigenação do rubisco nos estágios de curto prazo após a indução das condições fotorespiratórias (Novitskaya et al., 2002). Entretanto, o aumento do fluxo através da via fotorrespiratória causa uma redução na razão glicina/soro (Timm et al., 2012). Um suporte adicional para um maior fluxo fotorespiratório nos extremófitos pode ser derivado dos maiores níveis de glicerato em A. heirochuntica e E. salsugineum sob controle e condições de estresse salino em comparação com a Arabidopsis. O glicerato é o produto da penúltima reação na via fotorrespiratória e é convertido em 3-fotoxglicerato, que é alimentado de volta ao ciclo Calvin (Hagemann e Bauwe, 2016). Como mencionado acima, a fotorrespiração desempenha um papel importante na dissipação excessiva de energia em A. hierochuntica (Eppel et al., 2014).

Outra razão para os baixos níveis de malato em Arabidopsis em comparação com os extremófitos pode ser devido à provável maior inibição da fotossíntese mediada por sal em Arabidopsis (Stepien and Johnson, 2009). Isso poderia levar à redução do fluxo de carbono através da via glicolítica e, portanto, à necessidade de conversão do malato em piruvato pela enzima málica para manter a função do ciclo TCA (Casati et al., 1999). Por outro lado, tanto A. hierochuntica quanto E. salsugineum apresentam uma taxa fotossintética relativamente maior e menor NPQ que A. thaliana e outras espécies vegetais, sob condições de controle e sal, e sob várias concentrações de CO2 e intensidades de luz (Figuras 5G,H; Stepien e Johnson, 2009; Eppel et al., 2014). De facto, os níveis globais mais elevados de glicose, frutose, glucose 6-fosfato e frutose 6-fosfato nos extremófitos podem indicar um maior fluxo de glicólise quer a partir da fotossíntese quer do consumo de amido, o que pode manter a entrada do piruvato no ciclo TCA.

Raffinose e o seu precursor galactinol são considerados osmoprotectores e antioxidantes (Taji et al, 2002; Nishizawa et al., 2008; Farrant et al., 2009). Observamos um grande aumento no conteúdo de galactinol e rafinose na Arabidopsis em resposta ao sal, enquanto os níveis desses metabólitos permaneceram baixos nas extremófitas (Figura 8). É notável que as extremófitas de dois habitats muito diferentes evoluíram para evitar o acúmulo de altos níveis de rafinose como um componente de tolerância ao estresse, semelhante ao pico de dessecação-tolerante do musgo Selaginella lepidophylla (Yobi et al., 2012). Embora não esteja claro qual a vantagem de não se acumular rafinose, esse açúcar pode ser metabolizado em sacarose e depois em glicose e frutose para glicólise.

O aumento do acúmulo de metabólitos observado nas extremófitas é caro (Munns, 2002) e poderia contribuir para a taxa de crescimento mais lento de E. salsugineum em comparação com Arabidopsis (Lugan et al., 2010). Entretanto, A. hierochuntica, onde os níveis da maioria dos metabólitos e, portanto, os custos são menores em comparação com o E. salsugineum, apresenta rápida germinação e estabelecimento de mudas. É possível que o habitat salino do E. salsugineum, exija constantemente altos níveis de solutos e antioxidantes compatíveis. Em contraste, A. hierochuntica está exposto a níveis de salinidade mais baixos que E. salsugineum, mas experimenta radiação luminosa intensa, baixa disponibilidade de água e nutrientes e temperaturas extremas. Ao acumular compostos específicos, como antioxidantes, enquanto acumulando moderadamente outros solutos como açúcares e aminoácidos, A. hierochuntica poderia ter desenvolvido uma estratégia de tolerância ao estresse com menores custos metabólicos, adequada ao seu habitat específico, permitindo o rápido estabelecimento de mudas e a rápida conclusão de seu ciclo de vida para evitar a estação seca.

Author Contributions

GE, RS, e SB conceberam e desenharam o estudo. GE e RS realizaram todos os experimentos, exceto a contagem cromossômica, fluorescência de clorofila e citometria de fluxo, que foram realizados por AK, AE e AC, respectivamente, sob a supervisão de SB, SR e NT-Z, respectivamente. GE e YK, sob supervisão de AF, realizaram os experimentos de perfil metabólico e análise de dados. TA participou dos experimentos de estresse oxidativo. YG supervisionou e participou das coleções de campo de A. hierochuntica, assim como aconselhou sobre protocolos de crescimento. GE e SB escreveram o artigo e todos os autores leram e aprovaram o manuscrito.

Funding

Esta pesquisa foi apoiada pela Koshland Foundation for Support of Interdisciplinary Research in Combatting Desertification, o Goldinger Trust Jewish Fund for the Future, e o Programa I-CORE do Comitê de Planejamento e Orçamento e a The Israel Science Foundation .

Conflito de interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de qualquer relação comercial ou financeira que pudesse ser interpretada como um potencial conflito de interesses.

Confirmações

Os autores agradecem a Noga Sikron pela excelente ajuda técnica e Albert Batushansky pelo aconselhamento estatístico. Agradecemos a gentil doação do Prof. J. Dolezel de sementes de R. sativus. Agradecemos ao Laboratório Gilat Hasade Services pelas medições de conteúdo de íons e a María Fernanda Arroyave Martínez pelo quadro de Arabidopsis e A. hierochuntica de crescimento a intensidades de luz mais elevadas. Estamos muito gratos a Anna Amtmann pela leitura crítica deste manuscrito.

Material Suplementar

O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fpls.2016.01992/full#supplementary-material

Pés

1. ^http://www.ims.gov.il/IMSENG/All_Tahazit/homepage.htm
2. ^http://rsbweb.nih.gov/ij/