Inibidor de Proteínas da Apoptose: Traduzindo Conhecimento Básico em Prática Clínica

Inibidor das Proteínas da Apoptose Família de Inibidores de Caspase

Os IAPs são uma família de inibidores de caspase que inibem especificamente as caspases 3, 7, e 9 e assim previnem a apoptose. Crook et al. (17) identificaram a primeira serendipite de um membro da família IAP enquanto estudavam a apoptose induzida por vAcAn em células do baculovírus SF21. Durante uma tela para genes baculovírus que imitavam as ações do p35 e inibiam a apoptose induzida por vAcAnh-, eles identificaram um novo gene 1,6-kb codificando uma proteína antiapoptótica 31-kDa com um motivo semelhante a um dedo de zinco (17). Estudos subsequentes identificaram IAPs em diversas espécies e discerniram que os IAPs inibem a apoptose através do bloqueio de caspases (revisado na ref. 18).

O Inibidor da Família de Proteínas Apoptose

Até o momento, oito membros da família de IAPs humanos foram identificados (Fig. 2)⇓, e homólogos de IAP também foram descritos em insetos e leveduras. As proteínas da IAP são agrupadas nesta família com base na presença de um a três domínios de baculovírus IAP repeat (BIR), uma região de ligação de zinco de ∼70 aminoácidos. Embora o domínio BIR seja necessário para a adesão à família IAP, nem todas as proteínas contendo BIR parecem ter funções antiapoptóticas (19, 20, 21, 22), portanto a presença de um domínio BIR é necessária mas não suficiente para a inclusão nesta família de proteínas. As proteínas IAP também podem conter um domínio RING ou caspase activation recruitment (CARD) (revisto na ref. 18). As proteínas IAP foram divididas em três classes (classes 1, 2 e 3) baseadas na presença ou ausência de um dedo RING e na homologia dos seus domínios BIR (23).

Classe 1 Inibidor de Proteínas Apoptose.

Classe 1 IAP contém domínios BIR homólogos e um motivo de dedo RING. X-linked IAP tem três domínios BIR e um dedo RING. Foi o primeiro IAP nesta classe a ser identificado e continua a ser o mais bem caracterizado. Duckett et al. (24) identificaram o XIAP em 1996 em uma busca por genes de mamíferos homólogos ao IAP do baculovírus. Ela liga e inibe as caspases 3, 7 e 9 com afinidade nanomolar, mas não liga nem inibe a caspase 8 (25, 26). cIAP1 (também conhecida como MIHB, hiap2 e BIRC2) e cIAP2 (também conhecida como MIHC, hiap2 e BIRC3) estão estruturalmente relacionadas à XIAP com três domínios BIR e um dedo anelar. Estes PIA foram identificados através da purificação bioquímica de proteínas associadas ao receptor de morte TNF-R2, mas o seu papel neste receptor permanece pouco claro (27). cIAP1 e cIAP2 são expressas na maioria dos tecidos humanos, mas a expressão cIAP1 é mais elevada no timo, testículo e ovário, e a expressão cIAP2 é mais elevada no baço e timo (27). cIAP1 e cIAP2 ligam e inibem a caspase 3 e 7, embora menos fortemente que a XIAP (25). Elas não inibem as caspases 1, 6 e 8. ML-IAP (também conhecido como livin, KIAP e BIRC7) e ILP-2 têm um dedo RING e apenas um domínio BIR, mas seu domínio BIR é mais homólogo ao domínio BIR3 do XIAP, cIAP1 e cIAP2 (daí sua inclusão nesta classe). ML-IAP é expresso em fígado fetal normal, rim, testículo e timo adulto, bem como melanoma e linfomas celulares. O ML-IAP inibe as caspases 3 e 9 com uma afinidade semelhante à do cIAP1 mas não liga ou inibe as caspases 1, 2, 6, ou 8 (28). A expressão da ILP-2 é normalmente restrita ao testículo do adulto, mas também foi documentada em uma linha de células linfoblastóides. A ILP-2 inibe a caspase 9, mas não as caspases 3, 7, ou 8 (29). Resta determinar se as variações de afinidade das caspases entre as diferentes IAPs estão relacionadas às suas funções intracelulares endógenas.

Inibidor de Proteínas Apoptose da Classe 2.

O NAIP da família IAP da Classe 2 tem três domínios BIR, mas sem motivo de dedo anelar. Os seus domínios BIR estão mais distantemente relacionados com os domínios BIR da classe 1 IAPs. NAIP foi identificado em 1995 por Roy et al. (30), enquanto procuravam o gene em 5q13 responsável pelas atrofias musculares da coluna vertebral infantil. O NAIP é expresso no fígado, placenta e sistema nervoso central do adulto. Ela inibe as caspases 3 e 7, mas não as caspases 1, 4, 5, ou 8 (31).

Classe 3 Inibidor das Proteínas Apoptose.

Classe 3 Membros IAP, como sobreviventes, contêm apenas um único domínio BIR e nenhum dedo RING. A sobrevida é expressa no fígado fetal, rim, pulmão e trato gastrointestinal, mas não é expressa na maioria dos tecidos adultos normais (32). A expressão preferencial de sobrevivência no tecido fetal sugere que ela tem um papel no desenvolvimento. Sobrevivência é freqüentemente superexpressa em uma variedade de malignidades, incluindo adenocarcinomas do pulmão, pâncreas, cólon, mama e próstata (32, 33, 34, 35, 36).

A expressão diferencial entre células normais e malignas pode ser explorada para fins terapêuticos. Por exemplo, o promotor sobrevivente pode ser usado como um promotor específico do tumor no qual um gene de interesse é ativado em células malignas, mas não em células normais. Este alvo transcripcional pode ser de valor na terapia genética do câncer (37). Alternativamente, a expressão da sobrevivência poderia ser usada como um marcador tumoral para a identificação precoce da malignidade, como discutido em detalhes abaixo.

Inibidor de Apoptose Proteína Inibe Caspases Ativas

Inibição de Caspase é o mecanismo melhor compreendido pelo qual os PAIs previnem a apoptose. Nas reacções enzimáticas, o XIAP recombinante inibe a caspase 3, 7, e 9, mas não a caspase 8. In vitro, a superexpressão da XIAP em 293T células previne a clivagem induzida pelo BAX e FAS da procaspase 3 e da apoptose (38). O efeito do XIAP na ativação da caspase foi mapeado para seus domínios BIR, com o domínio BIR2 inibindo as caspases 3 e 7, e o domínio BIR3 RING inibindo a caspase 9,

Base Estrutural da Inibição da Caspase por Inibidor X-Linked da Proteína da Apoptose.

Dados os dados celulares e enzimáticos indicando que os IAPs inibem as caspases, esforços foram feitos para explorar as interações físicas entre os IAPs e as caspases. A maioria dos estudos se concentrou no XIAP porque ele pode ser produzido de forma recombinante e cristalizado. O XIAP inibe as caspases 3 e 7 e a caspase 9 através de domínios separados. Seu domínio BIR2 (aminoácidos 163-240) com sua extensão terminal NH2 (aminoácidos 124-162) inibe as caspases 3 e 7, enquanto seu domínio BIR3 (aminoácidos 241-356) inibe a caspase 9 (39). Estes estudos forneceram a base para o desenvolvimento de inibidores de IAP que têm como alvo as bolsas de ligação da caspase da molécula.

BIR2 Domínio Inibe o Inibidor X-Linked da Proteína Apoptose.

Um modelo “gancho, linha e pia” foi proposto para explicar como o XIAP inibe a caspase 3 (Fig. 3)⇓. O “gancho” (resíduos 138-146 do terminal NH2) inibe a capase 3 ao deitar-se sobre o local ativo da caspase, bloqueando assim a bolsa de ligação do substrato da caspase ativa 3. A “linha” representa duas ligações peptídeo no Val147 que ligam o gancho ao lava-louça. O “afundador” (resíduos 148-150) estabiliza a interação entre o XIAP e a caspase 3 (40). Neste modelo, o XIAP inibe a caspase 3 através de um impedimento estéreo. Como tal, inibe as caspases 3 e 7 através de um mecanismo distinto dos inibidores peptidyl caspase como o benziloxicarbonil-VAD-fluorometilcetona que competem com o substrato caspase para a bolsa de ligação.

BIR3 Inibe o Inibidor de Apoptose Inibidor de Apoptose Inibidor de Domínio X.

Estudos preliminares determinaram que o domínio BIR3 do XIAP poderia inibir a caspase 9 (26, 41), mas só recentemente o mecanismo foi elucidado. O domínio BIR3 da XIAP forma um heterodímero com caspase 9 monomérica, impedindo assim a dimerização e ativação da caspase 9. Além de aprisionar a caspase 9 de forma monomérica, também mantém o local ativo da caspase 9 em uma conformação inativa (42). Assim, é interessante notar que o XIAP inibe a caspase 9 sem tocar fisicamente no sítio ativo.

Em uma extensão aos estudos estruturais, os efeitos das mutações nos domínios BIR sobre os efeitos antiapoptóticos do XIAP foram examinados. As mutações que afetam a extensão terminal NH2 do BIR2 (por exemplo, D148A) abolem o papel protetor do XIAP na prevenção do Fas ligand (um estímulo da via extrínseca de ativação caspase) ou apoptose induzida pelo Bax (um estímulo da via intrínseca de ativação caspase). Em contraste, mutações que afetam o domínio BIR3 (por exemplo, W310A) reduzem a inibição da apoptose mediada pelo XIAP induzida pelo BAX, mas não pelo CD95 (43). Assim, essas mutações suportam os estudos estruturais que demonstram que o domínio BIR2 é necessário para a inibição da caspase 3 e que o domínio BIR3 inibe a caspase 9,

Survivin.

Onde a XIAP inibe as caspases 3, 7 e 9 através de interações diretas, o mecanismo pelo qual a sobrevivência inibe as caspases é menos claro. De acordo com alguns estudos (44, 45), a sobrevivência liga e inibe as caspases activas 3 e 7, mas não a caspase 8. Em contraste, outros (46) não detectam uma interação da sobrevivência com a caspase 3. Um estudo de Marusawa et al. (47) relatou que a sobrevivência não inibe as caspases recombinantes 3, 7, ou 9 em reações enzimáticas ou em extratos citosólicos previamente estimulados com citocromo c e dATP. Entretanto, quando a sobrevivência é adicionada a extratos citosólicos antes da ativação da caspase 9 pela adição de citocromo c e dATP, ela impede a ativação da caspase 3/7. Assim, estes resultados sugerem que a sobrevivência inibe a caspase 9 ativa, mas não a caspase 3 e 7 ativa, e que a inibição da caspase 9 requer um co-fator. Para identificar tal co-fator, Marusawa et al. (47) usaram uma tela de duas hibridas para identificar proteínas de ligação de sobrevivência e identificaram HBXIP. Nas reações enzimáticas, a sobrevivência e o HBXIP em combinação (mas nenhuma das proteínas sozinhas) inibiram a atividade da caspase 9. Estudos adicionais serão necessários para resolver estes estudos discrepantes e decifrar o mecanismo pelo qual a sobrevivência inibe a atividade da caspase 9. Além disso, para generalizar a importância do HBXIP como um co-fator necessário para a sobrevivência, ele precisará ser avaliado em outros sistemas celulares. Tal trabalho será um passo importante para o desenvolvimento de inibidores químicos de sobrevivência.

Além da inibição caspase

A maior parte da atenção tem focado nos PAIs como inibidores caspase, mas múltiplas linhas de evidência indicam que os PAIs podem inibir a apoptose através de efeitos na progressão do ciclo celular, divisão celular e transdução de sinal.

Inibidor de Apoptose Proteins Regulate Cell Division.

As proteínas IAP provavelmente desempenham um papel na divisão celular. Por exemplo, as leveduras não têm caspases, mas têm homólogos IAP que contêm um domínio BIR. A eliminação da levedura IAP leva à formação de esporos ineficientes, indicando que, pelo menos na levedura, a IAP desempenha um papel na meiose (20, 21, 22). Nas células de mamíferos, a sobrevivência coloca-se com o aparelho mitótico incluindo tubulina B, microtubos, centrosomas e cinectócitos (48, 49, 50). Inibição de sobrevivência com anticorpos anti-corpo anti-corpo de sobrevivência resulta em metáfase atrasada e produz células mitóticas com fusos mitóticos mais curtos e menos densos (48, 50).

Inibidor de Proteínas Apoptósicas Regula a Progressão do Ciclo Celular.

Avidência também implica IAPs como reguladores do ciclo celular. Por exemplo, a superexpressão do XIAP prende células na fase G0-G1 do ciclo celular, e esta parada de crescimento está associada à down-regulation da ciclina A e D1 e indução dos inibidores de quinase dependentes da ciclina p21 e p27 (51). Além disso, o XIAP liga os reguladores do ciclo celular MAGE-D1 e NRAGE, mas o significado desta interação não é claro (52). Survivin também tem sido implicado na regulação do ciclo celular. Em células HeLa, a sobrevivência é praticamente indetectável em células G1 e aumenta ∼5- e 40 vezes em células S-phase e G2-M, respectivamente (50). Alterações nos níveis de mRNA de sobrevivência também se correlacionam com aumentos na proteína de sobrevivência e atividade promotora.

Inibidor de Apoptosis Proteins Regulate Cell Signaling.

A família de proteínas IAP também desempenha um papel na sinalização celular ativando o fator nuclear (NF)-κB. XIAP e NAIP, por exemplo, formam um complexo com a quinase TAK1 e seu cofactor, TAB1, que leva à activação da quinase terminal c-Jun-NH2 (53). A ativação da c-Jun-NH2 quinase terminal 1 ativa posteriormente a NF-κB através da cascata de fosforilação da proteína cinase ativada por mitógeno (54). Além disso, a XIAP promove a translocação da subunidade NF-κB p65 para o núcleo, o que é um pré-requisito para a atividade da NF-κB (55). Finalmente, a XIAP promove a degradação do inibidor da NF-κB Iκβ (51).

As funções das IAPs na regulação da divisão celular, ciclo celular e transdução de sinal são esclarecidas, será importante identificar os domínios das IAPs responsáveis por estas atividades. Se for possível identificar domínios separados das proteínas que inibem caspases, ciclo celular e transdução de sinal, então IAPs mutantes podem ser feitos que dissociam estas funções. Este trabalho poderia levar ao desenvolvimento de inibidores de IAP que bloqueiam especificamente a inibição de caspases por IAPs enquanto IAPs mantêm seu papel como reguladores do ciclo celular e transdução de sinal.

Regulação da Função Inibidora da Proteína Apoptose por Proteínas Inibidoras Endógenas

Os membros da família IAP são regulados no nível do gene, mensagem e proteína, mas os detalhes desta regulação estão além do escopo desta revisão. Ao contrário, esta revisão irá focar na regulação de IAPs por proteínas inibitórias endógenas porque elas servem como protótipos para inibidores químicos terapêuticos de IAP.

Proteínas de ligação IAP regulatórias foram identificadas pela primeira vez em Drosophila. As proteínas Reaper, Hid, Grim (56) e Sickle (57) foram mostradas para ligar e inibir o Drosophila IAP, DIAP1. Posteriormente, versões humanas de Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) e Sickle (Skl) foram identificadas e nomeadas SMAC/DIABLO e HTRA2. Estes inibidores de IAP compartilham uma sequência homóloga em seu terminal NH2 que é responsável por ligar e inibir IAPs (Fig. 4)⇓.

SMAC e HTRA2.

SMAC e HTRA2 humanos são proteínas mitocondriais que são liberadas junto com o citocromo c durante a ruptura das mitocôndrias. Na liberação, elas são clivadas para uma forma ativa. No seu estado ativo, SMAC e HTRA2 ligam IAPs, evitando assim a sua associação com caspases (58, 59, 60, 61). As funções inibitórias de IAP da família de proteínas SMAC são codificadas no seu terminal NH2. Peptídeos correspondentes aos sete aminoácidos terminais NH2 são capazes de ligar XIAP (62). A mutação da alanina terminal NH2 para glicina elimina a capacidade do peptídeo SMAC de ligar IAPs e exercer sua função proapoptótica (63). Quando internalizados nas células, os peptídeos correspondentes aos sete aminoácidos terminais NH2 da SMAC são capazes de sensibilizar as células do câncer de pulmão H460 para cisplatina e Taxol (64) e as células do neuroblastoma para o ligante indutor de apoptose relacionada ao fator de necrose tumoral. Resultados semelhantes foram observados com HTRA2 e os inibidores de PIA em Drosophila. As propriedades antitumorais dos peptídeos SMAC foram estendidas para o xenoenoganato, onde as versões permeáveis às células destes peptídeos encolhem tumores quando combinados com cisplatina (64) ou TRAIL (65) no carcinoma pulmonar e no xenoenoganato de glioma, respectivamente. Assim, estes peptídeos SMAC servem como protótipos para pequenas moléculas que imitam as ações do SMAC e inibem os IAPs e seriam úteis terapêuticamente para uma variedade de malignidades.

Estudos Estruturais.

Dada a potencial utilidade clínica das moléculas semelhantes ao SMAC, esforços foram feitos para entender as interações físicas entre SMAC e IAPs. Estudos estruturais têm demonstrado que a SMAC liga o XIAP em dois locais distintos. O terminal NH2 da SMAC ativa (resíduos 56-59) liga a bolsa BIR3 da XIAP e inibe competitivamente o domínio BIR3 de ligar caspase 9. As mutações no domínio BIR3 que impedem a ligação ao caspase 9 (por exemplo, W310) também impedem que o domínio BIR3 ligue o SMAC, sugerindo que os sítios de ligação do SMAC e caspase 9 se sobrepõem. No entanto, os sítios de ligação não são idênticos porque algumas mutações na BIR3 (por exemplo, H343A) abolem a ligação da BIR3 à caspase 9 mas não à SMAC (63, 66).

SMAC proteína de comprimento total e peptídeos terminais NH2 também ligam o domínio BIR2 da XIAP, mas com uma afinidade ∼5- a 10 vezes menor do que a da BIR3. O mecanismo pelo qual a SMAC interrompe a associação da BIR2 da caspase 3 não é claro, mas pode estar relacionado mais a um obstáculo estéreo do que a ligação competitiva (63).

HTRA2 liga-se ao domínio BIR3 da XIAP, mas com afinidade mais fraca do que a SMAC (67). Em seu estado ativo, HTRA2 existe como um trimer, e mutações que impedem a formação de trimer tornam HTRA2 inativo. Além de inibir IAPs através da ligação do bolso BIR3, HTRA2 também pode clivar e inativar múltiplas IAPs incluindo XIAP, cIAP1, e cIAP2, mas não sobreviver (68).

SMAC β.

SMAC e HTRA2 também podem exercer sua atividade proapoptótica através de efeitos independentes da ligação IAP. Um estudo de Roberts et al. (69) descreveu uma forma alternativa de SMAC que ocorre naturalmente, chamada SMAC β, que não possuía a sequência mitocondrial. O SMAC β não interagiu com XIAP, cIAP1, ou cIAP2, provavelmente devido à perda do seu terminal NH2. Embora incapaz de ligar IAPs, o SMAC β melhorou a apoptose mediada por TRAIL e VP-16 em 293 células. Da mesma forma, as versões mutantes do HTRA2 (67) que são incapazes de ligar IAPs ainda são capazes de induzir apoptose quando superexpressas em células de câncer de mama MCF7. Não está claro neste estudo como estas formas alternativas de emenda ainda podem induzir a apoptose. Talvez elas mantenham sua capacidade de ubiquitar as PIA, promovendo assim a destruição das PIA. Alternativamente, SMAC e HTRA2 podem ter parceiros de ligação adicionais não relacionados com os PIA através dos quais exercem uma influência proapoptótica. No caso do HTRA2, ele tem atividade protease independente do seu papel na ligação das PIA, e esta atividade protease pode regular a apoptose em alguns sistemas (68).

XAF1.

XAF1 é outro inibidor de PIA. XAF1 é uma proteína nuclear que se liga e seqüestra XIAP no núcleo. Nas reacções bioquímicas, o XAF1 liga-se e inibe a XIAP. Nas células, a sobreexpressão do XAF1 bloqueia a inibição da apoptose mediada pela XIAP. Não está claro, contudo, se a sequestração da XIAP no núcleo simplesmente separa a XIAP das caspases citosólicas ou se existem efeitos adicionais da XIAP localizados no núcleo (70). As moléculas que imitam o XAF1 provavelmente funcionariam de forma diferente da SMAC e seriam uma estratégia alternativa ao desenvolvimento de um inibidor da XIAP.