Isolamento, caracterização e potencial toxicológico de Alternaria-micotoxinas (TeA, AOH e AME) em diferentes espécies de Alternaria de várias regiões da Índia

Coleta e isolamento de espécies de Alternaria

As partes infectadas como folhas, frutos e caules de plantas doentes de diferentes regiões da Índia, foram coletados e trazidos para o laboratório. As amostras de folhas foram esterilizadas à superfície com solução a 0,5% de hipoclorito de sódio, lavadas cuidadosamente com água destilada estéril (SDW) por várias vezes e colocadas em meio de cultura de ágar dextrose de batata (PDA) em placas de Petri por 3-4 dias. As placas de PDA contendo pedaços de folhas infectadas foram incubadas a 28 °C durante 12 h de fotoperíodo claro/escuro durante 6-10 dias57. Para evitar contaminação bacteriana, a estreptomicina foi suplementada no meio de cultivo. As conidias foram produzidas com uma única esporulação para obter colónias puras, que foram colocadas em papel de filtro esterilizado.

Teste de patogenicidade

Para determinar as formas especiais, a análise da virulência dos isolados foi realizada em cultivares de tomate susceptíveis a Alternaria. Um total de 60 isolados de Alternaria foram testados quanto à patogenicidade. As sementes de tomate foram escarificadas em hipoclorito de sódio, enxaguadas em água da torneira, e depois secas ao ar. As plantas foram cultivadas separadamente em vasos. Condições fisiológicas como temperatura e umidade para o crescimento das plantas foram mantidas a 28 °C a 32 °C e 40 a 60% de umidade relativa, respectivamente. A concentração ótima de inóculos foi mantida (2 × 106 esporos/ml) e pulverizada na área foliar. As plantas em experimento foram mantidas em câmaras de orvalho por 8 h a 25 °C. Essas plantas foram monitoradas regularmente por 2-3 dias para verificar a gravidade da infecção e o desenvolvimento de doenças com relação ao controle das folhas que não foram inoculadas. Os sintomas começaram a ser visíveis 1 dia após a pulverização das inoculações dos esporos. A gravidade da doença foi avaliada a partir de 1 dia de inoculação até 6 dias. Os dados foram analisados estatisticamente através da análise de variância (ANOVA) e do teste de Duncan (P ≤ 0,05).

Exploração do ADN e identificação do patógeno

O patógeno foi inicialmente identificado com base nas características morfológicas, incluindo tamanho e forma, e estrutura de conidia, e ainda confirmado pela amplificação ITS usando os primers universais ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGGG-3′) e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTGATTGATGC-3′) amplificando as regiões ITS e 5.8S codificação de genes para espécies fúngicas. A extração de DNA foi realizada de acordo com o método sugerido por Doyle e Doyle58. A esteira de micélio liofilizado de 0,5 g foi triturada num almofariz e pilão utilizando 10 ml de tampão de extracção CTAB e depois incubada a 65 °C em banho-maria durante 30 min. A amostra foi então misturada com um volume igual de clorofórmio/álcool isoamílico refrigerado e suavemente misturado, seguido de centrifugação a 10.000 rpm durante 10 min a 4 °C. O sobrenadante assim obtido foi misturado com igual volume de isopropanol e deixado durante 2 h a 4 °C. A amostra foi novamente centrifugada a 10000 rpm durante 10 min à temperatura de 4 °C. O granulado foi então enxaguado com etanol a 70% e seco ao ar durante 4 h, a fim de remover os traços de álcool. Amplificação A reação ITS rDNA foi realizada em 25 μl mistura de reação contendo 2,5 μl 10X tampão de reação, 5 μl de cada deoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP), e 1,0 μl cada de ITS e 5,8 S primer universal para frente (ITS1) e primer reverso (ITS4), 0,3 μl de Taq DNA-polimerase, 10-100 ng de DNA, e 2,5 μl MgCl2. O perfil térmico optimizado da PCR foi desnaturação inicial a 95 °C durante 3 min, desnaturação a 95 °C durante 30 seg, recozimento a 70 °C durante 30 seg e extensão final a 72 °C durante 1 min com 40 ciclos adicionais. A amplificação foi confirmada em géis de agarose a 1% em tampão de 0,5X TBE, executada paralelamente ao marcador de peso molecular padrão de DNA e visualizada sob UV-transiluminador.

ITS Análise de sequência

As regiões rDNA obtidas dos isolados seleccionados foram ainda cortadas e purificadas utilizando o kit de purificação QIAquick PCR (QIAGEN, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos purificados foram finalmente enviados ao SciGenome Cochin, Kerala, Índia, para sequenciamento. As sequências foram comparadas com as do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando o NCBI BLAST. A análise BLAST foi realizada com sequências ITS de comprimento total como consultas para revelar relações com sequências publicadas. A homologia mais elevada e a pontuação total foram anotadas para uma análise mais aprofundada. As seqüências obtidas no presente estudo foram submetidas ao GenBank. As sequências ITS das linhagens Alternaria de outras formações especiais foram descarregadas da base de dados do NCBI GenBank e foram utilizadas nas análises filogenéticas como sequências de referência. Todas as sequências de ADN foram alinhadas com o programa Clustal W incluído no editor de alinhamento de sequências BioEdit59, 60. O arquivo de alinhamento múltiplo resultante foi utilizado para análises filogenéticas que foram realizadas usando o MEGA 5.0 com o método Neighbor-Joining permitindo 500 bootstrap replicates61.

Extração das toxinas das espécies Alternaria

Extrações dos metabólitos tóxicos foram realizadas de acordo com o método de Andersen et al.62 com algumas modificações. As extrações destas fitotoxinas foram realizadas em meio de caldo de batata Dextrose (PDB), utilizando culturas com 20 dias de vida. Três tampões de ágar (3 mm) foram cortados do centro de cada colônia de Alternaria e inoculados em 200 ml de meio PDB. As colónias do patogéneo foram cortadas com a ajuda de broca de cortiça (5 mm) e depois inoculadas no meio de cultura PDB. As culturas de 20 dias de idade foram filtradas através de papel filtro pela máquina de filtro a vácuo. Adicionou-se igual volume de metanol aos filtrados de cultura, misturou-se adequadamente e manteve-se a 4 °C durante 24 h. Posteriormente, o filtrado foi precipitado e evaporou o metanol até à secura num concentrador rotativo a vácuo (IKA® RV 10) a 43 °C. Um volume igual de acetato de etilo foi adicionado ao filtrado extraído, misturado adequadamente no funil separador. Foram obtidas duas fases, uma era orgânica e a outra era aquosa. A camada aquosa foi separada e extraída com acetato de etilo. O extrato de acetato de etila foi concentrado a 44 °C no evaporador a vácuo e dissolvido em metanol.

Purificação e separação da fitotoxina Alternaria via cromatografia de coluna

Purificação e separação de compostos foram realizadas utilizando metodologia de Devi et al.63 com ligeiras modificações. A cromatografia em coluna (CC) foi realizada em uma coluna de vidro (700 mm × 30 mm) e o gel de sílica (100-120 mesh size Merk) foi escolhido para fase estacionária. A fase móvel consistiu de solvente puro ou diferentes solventes, dependendo da exigência das condições. A coluna foi carregada com complexo bruto extraído de isolados de espécies Alternaria. Para a separação dos metabolitos tóxicos a fase móvel consistiu de clorofórmio: metanol (80:20 e 95:05), benzeno: acetona: ácido acético (60:35:05) foi utilizado para separar o composto e a eluição do gradiente foi seguida. Diferentes frações eluídas da CC foram separadas por cromatografia em camada fina (TLC) e confirmadas pela análise por HPLC.

Análise por cromatografia em camada fina (TLC) das fitotoxinas

Cromatografia em camada fina (TLC) foi utilizada para identificar as várias fitotoxinas produzidas por esporos grandes e pequenos de espécies Alternaria identificadas. A TLC foi realizada usando o método de Andersen et al.64. Neste método, 4,5 g de gel de sílica G254 (13% CaSO4 ½ H2O como aglutinante) foi adicionado com 25 ml de água bidestilada e agitado por vareta de vidro até a formação de lama de gel de sílica. Depois disso, o slurry foi aplicado suavemente sobre a placa de vidro e colocado em local seguro para secagem ao ar. Foram utilizadas diferentes fases móveis para a separação de várias fitotoxinas na proporção de clorofórmio: metanol (80:20; v/v), benzeno: acetona: ácido acético (60:35:5; v/v), clorofórmio: metanol (95:5; v/v), acetato de etilo: benzeno (95:5; v/v). Estas misturas de solventes foram então colocadas em dessecadores e foram deixadas por 30 min para saturar o ambiente dentro dele. Antes de realizar a TLC, as placas de vidro revestidas com sílica gel foram carregadas colocando-as no forno a 60 °C durante 10 min. Após a carga, 5 µl de amostras foram manchadas em pontos diferentes a 2 cm de distância da base. Depois de manchadas as amostras, as placas de TLC foram secas dentro de um exsicador por alguns minutos. As manchas resultantes foram desenvolvidas expondo as placas de TLC a 0,2% de cloreto férrico etílico/ou visualizadas sob luz UV a 365 nm. As placas de TLC foram então secas ao ar durante a noite, após o que os valores de Rf foram calculados. As manchas de diferentes metabolitos cujos valores Rf foram encontrados semelhantes com os valores Rf dos padrões foram arranhadas, dissolvidas em metanol de grau HPLC e utilizadas para análise HPLC.

Análise HPLC-UV

Preparação do padrão

TeA (gato No: T1952), AOH (gato No: A4675) e AME (gato No: A4678) foram comprados dos laboratórios Biogenuix (LKT, Inc.), Nova Deli, Índia) e usado de forma cristalizada para preparar o padrão. A solução de reserva (1000 µg ml-1) e uma solução de trabalho separada de (10 µg ml-1) de toxinas foram preparadas em metanol de grau HPLC e mantidas a -20 °C para uso posterior. Estas toxinas foram usadas como padrões para calibração por HPLC e para outras experiências adicionais, diluindo as soluções de trabalho preparadas.

Condições de análise HPLC-UV

Para análise por HPLC as amostras foram separadas cromatograficamente usando uma base desativada (250 mm de comprimento × 4.6 mm, 5,0 µm de partícula) C18 Waters Spherisorb, coluna ODS2 (produto nº: PSS831915, EUA) que foi conectada à coluna de guarda, sistema série Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, EUA) com detector UV-VIS (2998 PDA) e controlador do sistema Waters 600E. O detector PDA 2998 ajustado a 254 nm como o comprimento de onda de integração. As amostras foram injetadas usando um laço de 10 μl de Waters 717plus autosampler (Waters Corporation, Milford, EUA). A coluna e a coluna de guarda foram controladas termostaticamente a 28 °C. A vazão foi de 0,70 ml/min e a fase móvel consistiu de 75% de metanol grau HPLC (solvente A), 25% de uma solução aquosa (solvente B) de tampão fosfato 0,1 M adicionado 900 ml de DW para 1 litro e pH 5,8 mantido por ácido fosfórico. O instrumento foi executado em modo isocrático linear e a detecção foi monitorada na faixa de 200-400 nm. A confiabilidade do método HPLC para análise de AME, TeA e AOH foi validada através de limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ).

LC-MS/MS análise

Para posterior confirmação das toxinas Alternaria (AME, AOH e TeA), um método cromatográfico – espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) foi realizado com pequenas modificações de Tölgyesi et al.65. O método envolve uma extração sólido-líquido com metanol e uma derivatização posterior para TeA, AOH e AME. Em seguida, as amostras foram purificadas com extração em fase sólida em cartuchos de base polimérica e, finalmente, as toxinas foram separadas por LC-MS/MS. Para análise LC-MS/MS, as amostras foram preparadas em etapas.

Reagentes, solventes e preparação do padrão

Aferentes analíticos secos de AME, AOH e TeA foram comprados dos laboratórios Biogenuix (LKT, Inc., Nova Deli, Índia). Os padrões foram reconstituídos com 1,0 ml de metanol para obter 0,1 mg ml-1 de soluções de reserva. Todas as soluções de reserva foram mantidas a 4 °C. 2,4-dinitrofenilidrazina (DNPH) e undecanal foram compradas da Sigma-Aldrich. O reagente de derivatização (0,58% DNPH em solução de HCl) foi preparado como descrito por Siegel et al.7. O reagente de parada foi 5% (v/v) undecanal em metanol. As soluções derivadas padrão TeA, AOH e AME (1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml, e 2,71 μg/ml de metanol, respectivamente) foram preparadas misturando 1 ml das 10 soluções de TeA, AOH e AME metanólicas μg/ml com 1 ml de solução de DNPH. A mistura foi deixada durante a noite e processada como escrito nas seções de extração de amostras e limpeza SPE. O volume final foi ajustado para 10 ml com metanol. Estas soluções foram utilizadas para optimizar as condições LC-MS/MS para a análise. Um total de 50 mM de tampão formado de amônia foi preparado em água e seu pH ajustado para 3,0 com ácido fórmico. Metanol e acetonitrilo foram de grau LC-MS obtido da Sigma-Aldrich. Acetato de etilo, n-hexano, diclorometano, ácido fórmico e forma de amônio foram de grau HPLC e adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha). A coluna Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), os cartuchos Strata SPE (6 ml, 200 mg) e os filtros de seringa de celulose regenerada (RC) (15 mm, 0,45 μm) foram obtidos de Phenomenex (Utrecht, Holanda). As colunas Supelco Ascentis Express C-18, cyano (ES-CN) e phenyl-hexyl HPLC (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) foram adquiridas da Sigma- Aldrich. Amostras de toxinas padrão, usadas para o desenvolvimento de métodos, foram compradas dos laboratórios Biogenuix (LKT, Inc., Nova Deli, Índia). As amostras foram armazenadas a -20 °C até serem submetidas a análise.

Exploração de amostras

Amostras de extração de metabólitos de crutas foram purificadas pelo método de cromatografia em coluna e a fração foi eluídas e dissolvidas em metanol. 50 ml de amostra de cada fração foram misturados em tubos centrífugos de polipropileno (PP) de 50 ml que foram então selados. As amostras foram misturadas em vortex durante 5 segundos e agitadas horizontalmente num agitador CAT S50 na velocidade de 600 min-1 durante 45 min à temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 5.000 rpm durante 10 min a 20 °C e a camada superior foi recolhida num novo tubo de centrifugação de 50 ml de PP. 100 μl reagente de derivatização (0,596% DNPH em 2 mol/lit HCl) foi adicionado à amostra e vortex-mix-mixed durante 5 seg. A amostra foi deixada para ser derivatizada durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, 500 μl reagente de parada 5% (v/v) undecanal em metanol foi adicionado e vortex-mix-mixed por 5 seg. A amostra foi deixada em repouso por 30 min e depois diluída no tubo de PP até 35 ml com tampão formador de amônio 50 mM (pH 4, ajustado com ácido fórmico). A amostra foi centrifugada a 5.000 rpm durante 10 min a 20 °C e submetida a uma limpeza de extracção em fase sólida.

Solid-phase extraction (SPE) clean-up

Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) os cartuchos foram condicionados com 6 ml de metanol seguido de 6 ml de água e 6 ml de tampão em forma de 50 mM. Reservatórios de 75 ml foram ligados aos cartuchos e as amostras foram carregadas nos reservatórios. Em seguida, as amostras foram passadas por gota a gota. Em seguida, as colunas SPE são lavadas com 6 ml de metanol-água (15/85, v/v) e posteriormente com 6 ml de n-hexano. Os cartuchos foram secos a vácuo durante 5 min. antes de se proceder à eluição das amostras em tubos de vidro com 5 ml de metanol. As amostras foram evaporadas até secar a 45 °C sob uma suave corrente de nitrogénio e foram re-dissolvidas em 250 μl metanol por vortex-mixagem durante 20 segundos. Como passo final, as amostras foram filtradas através de filtros de celulose regenerada em frascos de HPLC.

Instrumentação e equipamento

O desenvolvimento do método foi realizado utilizando um Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) Sistema UPLC LG 500 nm (Accucore RP-MS 100 × 3.0 MM, 2.6UM, ACQ-TQD-QBB1152, Waters acuity PDA detector, Waters Corporation, Milford, MA, EUA) acoplado a um detector MS quadrupolar triplo MassLynx (Waters, Milford, MA, EUA). A aquisição e avaliação dos dados foram realizadas com o MassLynx versão 4.0. O método final também foi transferido para um sistema Quantum Ultra LC-MS/MS Thermo ACQ-TQD (Thermo Finnigan, San Jose, CA, EUA) que envolveu uma bomba binária QSM Waters acquity (SN- L10QSM943A), um amostrador automático de aletas Waters acquity fin (SN-M10SDI443M), um termostato de coluna e um detector MS Quantum Ultra triplo quadrupole TQD. A temperatura alvo da coluna e a temperatura alvo da amostra foram de 30 °C e 10 °C, respectivamente. A aquisição e avaliação dos dados foram realizadas utilizando o software Xcalibur 2.0.7. SP1. Ambos os sistemas foram equipados com uma interface electrospray (ESI) na qual apenas a ionização negativa foi utilizada durante a aquisição. O nitrogênio foi utilizado como gás de secagem e de colisão. Os parâmetros da fonte de íons estão resumidos na Tabela Complementar S2. Além disso, a transferibilidade do método foi investigada com um sistema LC-MS/MS que consistia de um Agilent 1100 HPLC acoplado a um AB Sciex 4000 triple quadrupole MS (Framingham, MA, EUA).

Condições do instrumento

As toxinas Alternaria são separadas em uma coluna UPLC Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) equipada com uma pré-coluna C-18 de 2,1 mm usando eluição de gradiente linear. Quatro solventes (solventes A, B, C e D) foram misturados pela bomba binária. O solvente A contido; acetonitrilo (ACN) + água (5:95), solvente B contido; ACN: 5% álcool isopropílico (IPA), solvente C contido; 100% metanol e solvente D contido; acetato de amônio puro. A vazão foi de 0,5 ml/min. A fase móvel dos solventes no tempo inicial foi 0,0% A, 30% B, 30% C e 40% D. No tempo final (5 min) os solventes foram 0,0% A, 30% B, 30% C e 40% D. Uma etapa de lavagem suficiente no programa de gradiente foi necessária para remover os solutos de matriz lipofílica acumulados. O tempo total de análise foi de 5 min. O termostato da coluna manteve a temperatura a 30 °C com o volume de injeção foi de 1,0 μl. O auto-amplificador foi operado a 20 °C.

O sistema UPLC LG 500 nm foi acoplado a um detector MS/MS (Micromass Quattro Ultima PT) através de uma interface electrospray (ESI) que opera em modo negativo. Os ajustes otimizados do ESI foram os seguintes: temperatura da fonte 120 °C, temperatura de desolvação 350 °C, fluxo de gás de secagem 650 L/Hr, fluxo de gás cone 30 L/Hr e tensão capilar 3,50 kV. O nitrogênio é utilizado como gás de secagem e de colisão (2,67 × 10-6 bar). O modo Multiply monitoring reaction (MRM) foi aplicado na EM durante a detecção e duas transições de íons foram escaneadas para cada toxina alvo. O modo MRM foi aplicado no detector MS/MS e duas transições de íons (quantificador e qualificador) foram registradas para cada composto alvo. As transições iônicas selecionadas com as tensões otimizadas (cone ou lente tubular), energias de colisão (EC) e tempos de permanência estão resumidas na tabela (Tabela Complementar S2).

Avaliação do potencial toxicológico de diferentes micotoxinas Alternaria (TeA, AOH e AME)

Medição da extensão da morte celular induzida por diferentes micotoxinas foram determinadas pelo método de inoculação foliar descolada. Para isso, amostras de folhas frescas foram separadas das plantas cultivadas em estufa e lavadas adequadamente por 3-4 minutos em água corrente da torneira, esterilizadas em hipoclorito de sódio a 1,0% (0,01 g/ml) por cerca de 1 minuto e, em seguida, limpa-se a superfície com etanol a 70% e, finalmente, enxagua-se assepticamente com água destilada estéril. Finalmente, as folhas foram colocadas em papel filtro umedecido e perfurado por uma agulha esterilizada na superfície inferior. As toxinas foram dissolvidas em água desionizada estéril na concentração de 100 μg/ml. Gotas (100 µl) de cada uma das três toxinas foram injetadas nas folhas feridas com uma agulha fina (Dispovan, 1 ml). Uma amostra de controlo foi ajustada através da injecção de água destilada estéril. As amostras de folhas tratadas foram mantidas dentro de câmara úmida (27 ± 0,5 °C de temperatura e 60% de umidade relativa) sob condições de estufa (14 h de ciclo claro e 10 h de ciclo escuro a 27 °C). Uma observação regular (a cada 24 h durante 6 dias) foi feita a fim de descobrir quaisquer alterações relevantes para os efeitos toxicológicos desenvolvidos nas amostras injetadas em relação às amostras de controle. A instalação experimental foi mantida em três réplicas e a percentagem da área foliar afectada devido à morte de células tóxicas induzidas foi medida por (Systronic leaf area meter 211) e calculada através da fórmula abaixo indicada.

Determinação da morte celular pelo ensaio de captação azul de Evans

A perda de viabilidade celular (morte celular) foi avaliada usando o método de coloração azul de Evans (Baker and Mock, 1994). As folhas de tomate foram tratadas com a mesma concentração (250 μg/ml) de todas as três toxinas. As folhas tratadas foram coradas com solução aquosa a 0,25% (v/v) de azul de Evans durante 15 minutos. Após lavagem com água destilada durante 30 min., as folhas foram excisadas e embebidas com 500 µl de N, N-dimetilformamida durante 1 h à temperatura ambiente. A densidade óptica do azul de Evans liberado foi medida espectrofotometricamente a 600 nm.

Análise estatística

Análise estatística foi realizada usando o IBM SPSS Statistics ver. 20 via análise de variância (ANOVA unidirecional) seguida pelo teste de variância múltipla de Duncan no nível de significância P ≤ 0,05. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três réplicas de cada metabólito. As análises estatísticas dos dados foram analisadas em 48 isolados selecionados de espécies Alternaria que eram patogênicas por natureza.