PLOS ONE
Discussão
A maioria das drogas quimioterápicas são especificamente projetadas para interferir na síntese de DNA, metabolismo celular e divisão celular. Devido a esse modo de ação, espera-se que essas drogas causem vários tipos de mutações. A mutagenicidade das drogas quimioterápicas para células normais é um dos problemas mais graves da quimioterapia, devido à possibilidade de induzir malignidades secundárias e resultados reprodutivos anormais, como as síndromes de Down, Klinefelter e Turner. Portanto, é imperativo determinar o efeito mutagênico dos medicamentos quimioterápicos sobre as células normais. O teste do micronúcleo tem sido amplamente utilizado para medir danos genómicos não reparados, e o aumento da frequência de MN prevê o risco de cancro em humanos. Como o MN pode resultar de quebra cromossômica (clastogenicidade) ou cromossomos retardatários (aneugenicidade), a detecção de MN tem potencial para ser usada como tela de indução de aberração cromossômica numérica se forem incluídos ensaios que permitam a identificação de cromossomos inteiros dentro do MN, como o ensaio FISH.
A atividade clastogênica da epirubicina durante a mitose in vivo foi relatada pelo teste de MN da medula óssea . Atualmente, a origem do MN induzido pela epirubicina ainda não foi determinada. Portanto, o presente estudo foi projetado para investigar a capacidade da epirubicina de induzir aneuploidia em células somáticas e germinais de camundongos masculinos. Para determinar a eficiência do método, dois modelos mutagênicos, colchicina e mitomicina C, conhecidos por terem ações aneugênicas e clastogênicas, respectivamente, foram usados como controles positivos. Os resultados observados do MNPCE e a distribuição de sinais por MN no controle e os dois mutagênios positivos no presente estudo correspondem bem com os dados publicados , . Esses dados confirmaram a sensibilidade do protocolo experimental seguido na detecção de efeitos genotóxicos.
Os resultados do teste MN mostraram que a epirubicina produz aumentos dose-dependentes na formação de MN na medula óssea de camundongos in vivo (Fig. 1) e um aumento na coloração centrômero-negativa e centrômero-positiva de MN, indicando a indução de ambos, clastogenicidade e aneugenicidade (Fig. 2). Tanto o potencial clastogênico quanto o aneugênico da epirubicina nas células somáticas podem dar origem ao desenvolvimento de tumores secundários. Os resultados da clastogenicidade confirmam os achados de estudos in vivo anteriores, onde aumentos na formação de MN e aberrações cromossômicas estruturais em células somáticas de camundongos em uma faixa de dose semelhante foram observados após o tratamento com epirubicina. Os resultados destes estudos também concordam com a indução micronúcleo por epirubicina em células de câncer de murino in vitro , nos eritrócitos de ovos de galinha incubados e na linha celular humana linfoblastóide TK6 . Além disso, a indução de aberrações cromossômicas estruturais e numéricas também foi relatada anteriormente em pacientes com câncer que receberam quimioterapia contendo epirubicina. Estudos anteriores também mostraram que a epirubicina induz aberrações cromossômicas estruturais em células HeLa cultivadas, aberrações cromossômicas estruturais e numéricas e trocas cromatídicas irmãs em uma linha de células de hamster chinês, e aberrações cromossômicas em culturas de linfócitos do sangue periférico de mulheres com câncer de mama tratadas in vitro por um regime contendo epirubicina.
Estudos em humanos têm mostrado que certos regimes de quimioterapia aumentam a frequência de aneuploidia em células germinativas , sugerindo que tais pacientes podem estar em maior risco de resultados reprodutivos anormais, particularmente na idade reprodutiva. Portanto, é de preocupação geral diminuir o risco de produção de aneuploidia, detectar aneugênios de células germinativas e compreender os mecanismos causais. No estudo atual, a aneuploidia foi determinada em células germinativas pelo ensaio de espermatozóides-FISH com sondas de DNA específicas para cromossomos de camundongos 8, X e Y, cada um rotulado com uma cor diferente. Para determinar a confiabilidade dos métodos, a colchicina, conhecida por ser predominantemente aneugênica, foi utilizada como substância de controle positivo, e os resultados do controle positivo e negativo estavam na mesma faixa que os de estudos anteriores, -. Estes dados confirmaram a sensibilidade do protocolo experimental na detecção dos efeitos aneuploidogênicos dos compostos testados.
Epirubicina é mais ativa nas fases S e G2 do ciclo celular; entretanto, tem alguma atividade detectável em todas as fases do ciclo celular. Tem sido relatado frequentemente que produtos químicos com propriedades aneugênicas podem alterar a progressão da divisão celular tanto em células mitóticas quanto em células mitóticas . No estudo atual, o tempo de desenvolvimento de divisões meióticas em espermatócitos para espermatozóides epidídimos foi avaliado pelo ensaio de incorporação de BrdU. Os resultados indicam claramente que a epirubicina prolongou a duração das divisões meióticas nos espermatócitos de camundongos por 48 h (Fig. 3). Estas observações confirmam, portanto, resultados anteriores de que a inibição da função topoisomerase II induzida pela epirubicina durante diferentes fases do ciclo celular retarda a progressão do ciclo celular e causa a paragem das células na fase G2/M. Tal parada de G2/M pode ser devida à indução de máquinas de ponto de controle G2, que permite que o DNA danificado seja reparado antes que as células passem para a fase seguinte do ciclo celular .
A informação in vivo sobre os efeitos da epirubicina na não disjunção durante a meiose é limitada, mas algumas outras anthraciclinas, como a doxorrubicina e sua derivada idarubicina, evitam a segregação cromossômica e induzem aumentos significativos nas frequências de espermatozóides disômicos e diplóides . Além disso, um estudo in vitro mostrou que o tratamento de culturas de hamsters chineses com epirubicina induziu aberrações numéricas sob a forma de hipodiploidia e hiperdiploidia . Além disso, a análise citométrica e histológica de fluxo da espermatogênese de camundongos mostrou um aumento do coeficiente de variação do histograma de DNA como medida de aneuploidia, e um aumento de espermatide diplóide após o tratamento com epirubicina . De acordo com os relatos acima, o presente experimento mostrou que a exposição à epirubicina causou aumentos significativos dose-dependentes nas frequências de espermatozóides disômicos e diplóides e que a indução da aneuploidia foi linearmente dose-resposta entre 0 e 12 mg/kg de epirubicina (Fig. 4). Estas observações in vivo também estão de acordo com um relatório in vitro anterior sobre linfócitos humanos cultivados em indivíduos saudáveis e pacientes com câncer nos quais a exposição à doxorubicina causou um aumento nas trissomias dos cromossomos 7 e 17 . Além disso, Ganapathi et al. relataram que a leucemia humana HL-60 células que carregam monossomia 8 como a única alteração cariotípica adquiriu marcadores 7q21 após a exposição à doxorubicina. Além disso, os achados citogenéticos mostraram trissomia 8 em pacientes que receberam cursos de quimioterapia sistêmica com antraciclina . Monossomia 7, 7q-, e translocação desequilibrada incluindo cromossomo 7 foram observados em pacientes que receberam quimioterapia contendo antraciclina . Além disso, aberrações cromossômicas estruturais dos cromossomos 1, 9 e 16 foram relacionadas a medicamentos quimioterápicos contendo antraciclina .
entre outras classes de inibidores da topoisomerase II, a etoposida foi estudada anteriormente em espermatócitos de camundongos , . Os resultados destes estudos indicam que o etoposide age como um agente genotóxico e induz aneuploidias em células germinativas primariamente meióticas após o tratamento das células paquítenas. Por outro lado, Kallio e Lähdetie, descobriram que a sensibilidade ao etoposídio em ratos era maior durante a diploteno-diacinese de espermatócitos primários, reduzida durante o paquíteno tardio e baixa durante os estágios pré-leptótenos; um padrão muito diferente do que com as substâncias químicas alquilantes do DNA. Esses autores sugeriram que o etoposídio causou uma falha na resolução dos braços cromossômicos recombinados, provavelmente associada à parada do ciclo celular e ao desencadeamento da via apoptótica. Em seus estudos citogenéticos detalhados, Marchetti et al. relataram que o paquíteno foi o estágio mais sensível da espermatogênese para a indução de aberrações cromossômicas estruturais e aneuploidia. Como os dados de Schmid et al. e os de Kallio e Lähdetie puderam demonstrar que o etoposídio prolongou o ciclo celular meiótico, parece possível que os efeitos observados nas primeiras divisões de clivagem por Marchetti et al. no grupo de acasalamento de 24,5 dias possam ter sido realmente induzidos em um estágio posterior, ou seja Durante a diacinese meiótica, MMI ou MMII ao invés de paquíteno, como os autores sugeriram.
No estudo atual, planejamos o estudo espermatório-FISH para determinar se o tratamento subagudo com baixas doses do inibidor da topoisomerase II epirubicina teria efeito, pois os estágios anteriores da prófase seriam incluídos no tratamento da epirubicina. Doses individuais de 0,25, 0,5 e 1 mg/kg de epirubicina foram injetadas em 12 dias consecutivos, e os espermatozóides foram amostrados 23 dias após o último tratamento com epirubicina. Um total de 12 mg/kg de epirubicina aplicada a toda a prófase da meiose aumentou significativamente as frequências desómicas e diploides dos espermatozóides, enquanto uma dose total de 3 e 6 mg/kg de doxorubicina foi negativa (Fig. 5). Em contraste, uma dose única de 6 mg/kg de epirubicina aplicada aos espermatócitos durante o MMI/MMII deu um resultado positivo (Fig. 4). Estes dados sugerem que estágios anteriores da prófase contribuem relativamente menos para a aneuploidia induzida pela epirubicina em células germinativas masculinas.
Neste estudo, verificou-se que a epirubicina causou aumentos notáveis de espermatozóides auto-diplóides (XX88 e YY88). Após o tratamento com epirubicina, os espermatozóides auto-diplóides resultantes da paragem do MMII foram mais frequentes do que os espermatozóides diplóides resultantes da paragem durante o MMI (XY88). Assim, a segunda divisão meiótica foi mais sensível ao tratamento com epirubicina do que a primeira divisão meiótica. A conclusão de que a segunda divisão meiótica era mais sensível ao tratamento com epirubicina do que a primeira divisão meiótica também é apoiada pelas freqüências observadas de cromossomos sexuais disômicos. Os espermatozóides com sinais de XX8 ou YY8 foram mais frequentes que os espermatozóides com sinais de XY8. Estas observações confirmam que o ensaio do esperma-FISH para disomia ou diploidia é capaz de detectar efeitos induzidos durante ambas as divisões meióticas e comparar a sensibilidade de ambas as divisões meióticas, como previamente relatado , .
No presente ensaio do esperma FISH, verificou-se que a dose positiva mais baixa para causar espermatozóides disómicos ou diplóides foi de 6 mg/kg de epirubicina. Entretanto, estudos com medula óssea de camundongos com MN mostraram que a exposição a 3 mg/kg de epirubicina produziu um aumento significativo no MNPCE. Esta observação sugere que o MN na medula óssea é induzido em doses mais baixas do que as disomias ou diploidias nos espermatozóides. Portanto, a medula óssea é o tecido mais sensível. No entanto, os ensaios medem diferentes pontos finais. A perda e quebra cromossômica é medida no teste de MN e a não disjunção é detectada no ensaio de espermatozóides-FISH. Portanto, os dados atuais confirmam o paradigma geral de avaliação de risco, que afirma que um resultado positivo do teste MN da medula óssea é um indicador do potencial genotóxico de um composto em células germinativas. Entretanto, a quantificação da aneuploidia em células germinativas é importante para fins de avaliação de risco.
Os inibidores de topoisomerase de DNA têm clara tendência a causar quebras de DNA de dupla cadeia, que resultam principalmente na formação de MN centrômero negativo. Da mesma forma, a demonstração de que a epirubicina é um inibidor efetivo da topoisomerase II sugere que a epirubicina elica seus efeitos clastogênicos através deste mecanismo. Os metabolitos da epirubicina também podem ativar as células para aumentar a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio, das quais as formas estáveis e difusíveis podem danificar o DNA nuclear . Se os mecanismos de reparação celular forem sobrecarregados, os danos do DNA primário podem levar a aberrações cromossómicas estruturais ou numéricas e eventualmente causar tumores . Esta sugestão é apoiada pelo fato de que os indivíduos que desenvolveram uma segunda neoplasia maligna após o tratamento de uma primeira neoplasia maligna tinham uma capacidade menor de reparar as quebras de DNA de dupla cadeia do que aqueles que não desenvolveram uma segunda neoplasia maligna, medida pela intensidade de γH2AX . A indução de MN centrômero positivo pela epirubicina indica que pode haver outro mecanismo pelo qual a epirubicina induz seu efeito genotóxico. Esta observação ressalta a importância de utilizar a modificação FISH do ensaio MN para determinar a origem do MN induzido. O mecanismo potencial pelo qual a epirubicina pode exercer seu efeito aneugênico é através da inibição da topoisomerase II, o que pode resultar na má segregação dos cromossomos durante a divisão celular. Isto ocorre porque a topoisomerase II do DNA é necessária para a separação adequada dos cromossomos irmãos durante a divisão celular, com a não disjunção e a quebra ocorrendo em sua ausência , . Assim, a epirubicina pode ser capaz de inibir dois papéis-chave da topoisomerase II; sua capacidade de segregar corretamente cromossomos recém replicados, bem como sua função de re-ligar as quebras transitórias de DNA de dupla cadeia.
Em resumo, usando o ensaio FISH com uma sonda de DNA centrômica para eritrócitos MN, foi mostrado que a epirubicina não é apenas clastogênica, mas também aneugênica em células somáticas in vivo. Usando o ensaio de incorporação de BrdU, foi mostrado que o atraso meiótico causado pela epirubicina foi de aproximadamente 48 h. Com a análise do esperma-FISH, foi mostrado que a epirubicina induz aneuploidias durante a meiose que resultam em espermatozóides disómicos bem como uma paragem meiótica completa que cria espermatozóides diplóides. A prevalência de espermatozóides auto-diplóides (XX88, YY88) e disómicos (XX8 ou YY8) indica que a segunda divisão meiótica é mais sensível à epirubicina do que a primeira divisão meiótica. Os resultados também sugerem que os estágios anteriores da prófase contribuem relativamente menos para a aneuploidia induzida pela epirubicina. Tanto os potenciais clastogênicos como aneugênicos da epirubicina podem dar origem ao desenvolvimento de tumores secundários e resultados reprodutivos anormais em pacientes com câncer e pessoal médico exposto a regimes medicamentosos que incluem a epirubicina. Embora a epirubicina tenha menos toxicidade sistêmica e cardíaca do que a doxorrubicina e outras antraciclinas com um espectro equivalente de ação antitumoral, ela tem efeitos aneuploidogênicos e citotóxicos em células não tumorais. Este efeito aneuploidogênico do medicamento pode ser responsável pelo aparecimento de resultados reprodutivos anormais e tumores secundários, que são notados em alguns pacientes com câncer algum tempo após o tratamento bem sucedido de seus cancros primários com quimioterapia contendo epirubicina.