Precipitação de PEG: Uma ferramenta poderosa para a purificação de anticorpos monoclonais

O método de captura de pellets demonstrou ter um impacto significativo na pureza do produto redissolvido. A etapa de precipitação é prontamente escalável e se adapta a um processo totalmente descartável a jusante.

Percivia LLC

Efforts estão em andamento para identificar alternativas à cromatografia de leito de embalagem para reduzir o tempo e o custo do processamento de fluxos de produtos de alto teor de gordura. Embora muitos esforços se concentrem em adsorventes de membrana que substituem diretamente colunas de produtos químicos iguais ou similares, algumas tecnologias mais antigas estão começando a ganhar terreno na fabricação de proteínas recombinantes. Uma alternativa atraente à cromatografia é a precipitação, que tem sido usada na indústria de proteína plasmática por muitos anos.1 Um método simples de precipitação envolve a titulação do fluido de processo até o ponto isoelétrico da proteína a ser precipitada.2 Sais liotrópicos, como o sulfato de amônio, também têm um longo histórico de utilização em processos de precipitação.3 Ácidos graxos de cadeia curta, como o ácido caprílico, são bem conhecidos por sua capacidade de precipitar DNA e proteínas de células hospedeiras (HCPs).4 Espécies poliônicas também são precipitantes úteis para capturar um produto de interesse ou remover proteínas contaminantes.5,6

Polietilenoglicol (PEG) tem sido usado para precipitação de produto e impurezas.7,8 Também pode ser combinado com precipitação isoelétrica para melhorar a eficiência da separação.9,10 Após a precipitação, a centrifugação ou filtração pode ser usada para realizar a separação sólido-líquido.11 Embora a centrifugação seja um método bem estabelecido para realizar essa separação, a lavagem do produto pelotizado para remover as impurezas pode ser problemática e não é adequada para um processo de uso único. A filtração – normal ou tangencial – requer mais desenvolvimento, mas a lavagem do grânulo é mais simples e é facilmente adaptável a um processo de uso único.

Neste trabalho, foi desenvolvida uma etapa de precipitação do produto usando PEG para recuperar um anticorpo monoclonal (MAb) a partir de meios de cultura celular PER.C6 clarificados. Foram identificadas condições apropriadas de precipitação através do uso de desenhos experimentais fatoriais completos. Duas etapas de filtração foram avaliadas para a captura e lavagem do produto precipitado, e o método superior foi escalonado em 10 vezes. O processo de precipitação total resultou em rendimentos de aproximadamente 90% e redução de HCP de 1 LRV sem aumento significativo no nível agregado da MAb redissolvida. Finalmente, foi investigado o impacto da etapa de precipitação na subseqüente etapa de captura da troca catiônica (CEX).

Reagentes de materiais e métodos

Sais de grau USP, Tween 20, ácido clorídrico, ácido acético e hidróxido de sódio foram adquiridos de JT Baker (Phillipsburg, NJ). O PEG foi de grau de reagente e adquirido da JT Baker ou da EMD Chemicals (Gibbstown, NJ). Todos os tampões foram preparados usando água de grau MilliQ (Millipore, Billerica, MA) e foram filtrados por filtração de 0,22-µm antes do uso.

Feedstock

A MAb humana (IgG1, pI = 8.3, 150 kDa) foi produzida em Percivia, LLC usando uma linha de células PER.C6. As células PER.C6 são células da retina embrionária humana imortalizadas pelo gene adenovírus E1, como descrito na patente americana 5.994.128,12 As células foram cultivadas em um processo padrão fed-batch ou o processo XD, ambos usando meios quimicamente definidos.13,14 Os meios de alimentação dos lotes foram clarificados por sedimentação e filtração em profundidade, e os meios XD foram clarificados pelo método de assentamento celular melhorado (ECS) seguido de filtração em profundidade.15 Durante o ECS, a resina Silica-PEI foi usada para melhorar o assentamento celular e também para reduzir o DNA e o HCP.

Otimização da condição de precipitação

As condições usadas para precipitar o peso molecular MAb-PEG, concentração de PEG e pH – foram otimizadas por desenhos experimentais completos usando o software Minitab (State College, PA). O pH do meio XD clarificado foi ajustado para o nível desejado com 2-M Tris em um tubo cônico de 15 ml. O PEG foi adicionado como uma solução de reserva 40% (p/p) para a concentração final desejada. O tubo foi então centrifugado a 1.000g e o sobrenadante decantado. Finalmente, o pellet foi redissolvido em solução salina tampão fosfato (PBS).

Pellet Capture by Depth Filtration or Microfiltration

Filtração em profundidade foi realizada com vários graus de meios filtrantes. Millistak+HC D0HC, C0HC, e X0HC foram comprados da Millipore Corp. (Billerica, MA), e ZetaPlus 60SP02A foram comprados da Cuno (Meriden, CT). A precipitação foi realizada utilizando uma solução de reserva de 40% (p/p) de PEG-3350 e o meio precipitado foi carregado com um fluxo de alimentação de 50 L/m2 /h até que todo o material fosse carregado ou a pressão transmembrana (TMP) fosse de 15 psid. Os filtros foram então lavados com 20-30 L/m2 de 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4% (p/p) de PEG-3350. Após a lavagem, 80 L/m2 de tampão de resolubilização foram passados pelos filtros a 100 L/m2 /h, e o permeado foi recirculado através do dispositivo a 600 L/m2 /h até que o A280 da piscina do permeado estivesse estável, indicando a dissolução completa da MAb. Finalmente, qualquer produto retido foi recuperado com um tampão de 20 L/m2 de descarga e sopro de ar do módulo do filtro. Em alguns testes, o meio filtrante foi subsequentemente lavado com acetato de 85-mM pH 5,3 seguido de NaCl 1-M. Os dados de pressão e fluxo foram coletados usando um sistema de engenharia personalizada da ARC Technology Services (Nashua, NH).

Microfiltração foi realizada com uma membrana de fibra oca de 0,22-µm da GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). O PEG-3350 foi adicionado como uma solução de estoque 40% (p/p) para o experimento em pequena escala e na forma de pó para o trabalho de escalonamento. O fluxo de alimentação foi de 710 L/m2 /h e o retente e o permeado foram irrestritos. O precipitado foi primeiro concentrado 10 a 14 vezes e depois lavado com três volumes de diafiltração de 20 mM Tris pH 8,5 mais 14,4% (p/p) PEG-3350. Finalmente, o precipitado foi redissolvido em acetato de sódio 85 mM pH 5,3 ou 20 mM Tris mais 50 mM NaCl pH 7,5. Os dados de pressão, fluxo e condutividade foram coletados usando um sistema de bancada Slice 200 (Sartorius, Gottingen, Alemanha) para testes em pequena escala e um sistema SciPro (SciLog, Middleton, WI) para o experimento de escalonamento.

Cromatografia de troca catiónica

Toyopearl GigaCap S-650 foi obtida na Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) no formato Toyoscreen 5-mL. Esta resina foi previamente demonstrada como uma etapa de captura de alta capacidade para MAbs.16 A coluna foi balanceada com acetato de sódio 74-mM pH 5.3 e carregada a 90-95 mg-MAb/mL-resina utilizando meios clarificados ou material clarificado e tratado com PEG, cada um ajustado ao mesmo pH e condutividade do tampão de equilíbrio. A coluna foi então lavada com tampão de equilíbrio e o anticorpo eluído com acetato de sódio 50 mM pH 5,3 mais NaCl 90 mM.

Técnicas Analíticas

A concentração de MAb em amostras contendo meio foi determinada pela proteína analítica A HPLC (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os níveis agregados foram medidos por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando uma coluna TSKgel G3000SWXL da Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA), com detecção de pico por absorvância UV a 280 nm. Os níveis de HCP foram quantificados por um ELISA específico PER.C6 da Cygnus Technologies (Southport, NC). SDS-PAGE foi realizado com NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels e a coloração foi feita com SimplyBlue SafeStain, ambos da Invitrogen (Carlsbad, CA).

Resultados e condições de precipitação de discussão

Para ambos os pesos moleculares de PEG, 3.350 e 6.000 Da, a concentração de PEG foi o fator dominante na recuperação e pureza da MAb redissolvida. A precipitação com PEG-3350 resultou na maior recuperação (Figura 1). Entretanto, a maior recuperação veio à custa de uma maior carga de HCP na MAb redissolvida. No caso da MAb agregada, os níveis não foram significativamente diferentes do material inicial, mas deve ser notado que a MAb particular utilizada neste trabalho não é propensa a formar agregados. A melhoria da redução do HCP com o uso do PEG-6000 foi compensada pela redução no rendimento do produto. A condição final selecionada foi 14% (p/v) de PEG-3350 (equivalente a 14,4% p/w) e pH 8,5.

Figure 1

Pellet Capture by Depth Filtration

No primeiro experimento, foi precipitado o meio XD clarificado com ECS e o pellet foi capturado por filtração em profundidade com meio X0HC. Nenhum aumento substancial na pressão transmembrana (TMP) foi observado durante a carga de 361 g-MAb/m2 (dados não mostrados). Após a lavagem, a resolubilização da peletização imobilizada foi feita com acetato de 85 mM de pH 5,3. Mesmo após a recirculação durante 2 h, o anticorpo não tinha sido completamente redissolvido, portanto, 0,1% v/v Tween 20 foi adicionado ao tampão de resolubilização. Após 30 min adicionais de resolubilização, a MAb foi totalmente dissolvida.

Tabela 1. Rendimento e remoção de impurezas para a operação de precipitação de PEG usando filtração de profundidade com X0HC para recuperar o produto

Dados de balanço de massa estão resumidos na Tabela 1. A redução de HCP foi menor do que no experimento anterior (Figura 1), onde apenas 5.000 ppm de HCP estavam na piscina final em comparação com 8.300 ppm neste experimento. Alguns filtros de profundidade, entretanto, são conhecidos por terem características adsorventes hidrofóbicas e de troca aniônica (AEX).17 O meio precipitado foi carregado a um pH relativamente alto (8,5) e baixa condutividade (<10 mS/cm), o que pode ter induzido a ligação de proteínas ácidas em uma matriz AEX. Além disso, na presença de PEG, a capacidade de ligação protéica das matrizes de troca iônica mostrou-se aumentada.18,19 Portanto, é provável que alguns dos HCPs que permaneceram em solução após a precipitação tenham sido ligados ao meio filtrante de profundidade e eluídos no produto durante a resolubilização. Esta hipótese também é suportada pela diferença no conteúdo de HCP do sobrenadante de precipitação e o fluxo do filtro de profundidade (9.900 versus 240 mg) que indica a remoção de HCP da solução pelo filtro de profundidade. Após a imobilização do anticorpo no filtro de profundidade, este foi redissolvido a um pH significativamente mais baixo (5,3) resultando na eluição de HCP ligado, e reduzindo a pureza do produto final. Este fenômeno poderia ser mitigado usando meios filtrantes de profundidade menos adsorventes, como os filtros Millistak+HC D0HC/C0HC e ZetaPlus SP como 60SP02A, ou redissolvendo o produto em um tampão de baixo sal e alto-pH, como o Tris pH 7,5 de 20-mM.

Figure 2

Estas estratégias foram testadas carregando meios de alimentação precipitados em filtros D0HC, C0HC, X0HC, e 60SP02A. Todos os filtros foram lavados de forma idêntica com o tampão PEG/Tris, mas a resolubilização foi feita com 20 mM Tris pH 7,5 mais Tween 20 para os filtros Millipore e 85 mM pH 5,3 mais Tween 20 para o filtro Cuno. Os filtros Millipore também foram removidos com um tampão de pH baixo (85 mM de acetato de pH 5,3) e sal alto (1 M de NaCl) após a recuperação do produto para determinar se algum HCP ligado poderia ser eluído. A Figura 2 mostra que houve incrustação substancial de todos os filtros testados. Como o meio de alimentação do lote não foi esclarecido pelo método ECS, que demonstrou reduzir significativamente os níveis de DNA nas colheitas de XD, pode haver mais DNA presente, que precipita em altas concentrações de PEG.20 O maior conteúdo de DNA no precipitado pode ter reduzido a capacidade de filtração, mas isto não foi investigado. A Tabela 2 mostra que cada um dos experimentos resultou em melhor redução de HCP (84-88% versus 46%), e mesmo que a carga inicial de HCP tenha sido maior (49.000 ppm versus 13.000 ppm), os pools de MAb redissolvidos geralmente tinham menores teores de HCP (6.000-7.800 ppm versus 8.300 ppm). O uso de filtros de baixaadsorção e a redissolução em um tampão de pH mais alto parecem resolver o problema de HCPs eluindo do meio filtrante de profundidade. A SDS-PAGE das frações de tiras revelou que tanto os HCPs quanto o produto estavam ligados aos filtros – incluindo os filtros menos adsorventes D0HC e C0HC – e confirmou que os meios X0HC eram mais adsorventes que os meios D0HC e C0HC (Figura 3).

Tabela 2. Rendimento e remoção de impurezas para a operação de precipitação de PEG usando filtração em profundidade com vários meios filtrantes para recuperar o produto

Pellet Capture by Microfiltration

Embora a carga de HCP da MAb redissolvida tenha sido reduzida usando um tampão com pH mais alto e meios filtrantes com menor profundidade adsorvente, as capacidades dos filtros de profundidade foram baixas para meios filtrantes alimentados por lote (<400 g-MAb/m2 ). A microfiltração (filtração de fluxo tangencial, MF TFF) foi testada com o objetivo de melhorar a capacidade com o benefício adicional de poder usar qualquer tampão para resolução de problemas, devido à característica de baixa ligação da fibra oca. O desempenho hidráulico da concentração de MF TFF e a lavagem do precipitado do lote alimentado é mostrado na Figura 4. O fluxo de permeado foi cerca de 100 L/m2 /h e o TMP ficou entre 1,0 e 2,5 psid para toda a operação. A carga de massa de 475 g-MAb/m2 foi melhor do que aquela alcançada em qualquer uma das operações de filtração em profundidade. A recuperação do produto e a redução de HCP foram ambas em torno de 90%, ligeiramente melhor do que aquela alcançada na filtração em profundidade (Tabela 3).

Figure 3

A resolubilização foi muito mais simples e rápida do que para a filtração em profundidade; ao invés de recircular o tampão através do dispositivo, o tampão foi bombeado através do interior dos lúmens para dentro do vaso retentor com o permeado fechado e deixado misturar durante cerca de 60 min. Isto foi suficiente para redissolver o anticorpo, e não foram necessários excipientes. Devido à dificuldade de resolução com filtração em profundidade, o produto foi redissolvido na concentração do meio de alimentação ou próximo a ela. O pool final do processo MF TFF foi quase duas vezes mais concentrado do que o material inicial.

Figure 4

Porque o retentato e o permeado estavam abertos à pressão atmosférica, foi necessária uma instrumentação mínima: uma bomba de fluxo cruzado, um sensor de pressão e uma bomba de transferência para a diafiltração. A combinação de alta capacidade, alta recuperação e folga de HCP, e simplicidade operacional fazem de MF TFF uma opção preferível para a captura de pelotas em comparação com a filtração em profundidade. A etapa de precipitação e MF TFF foi escalonada 10 vezes para um dispositivo de fibra oca de 0,12 m2 , e o desempenho foi comparável à pequena escala (Tabela 4).

Tabela 3. Rendimento e remoção de impurezas para a operação de precipitação de PEG usando microfiltração para recuperar o produto em escala de bancada

Cromatografia de troca catiônica

Cromatografia de troca catiônica de alta capacidade (CEX) foi avaliada com rações pré-tratadas com ou sem precipitação de PEG. A etapa de precipitação não teve qualquer impacto significativo no rendimento da etapa ou na redução percentual de HCP, mas o eluato resultante do material de carga precipitada teve sete vezes menos HCP (Tabela 5).

Tabela 4. Rendimento e remoção de impurezas para a operação de precipitação de PEG usando microfiltração para recuperar o produto em escala piloto

Conclusões

Precipitação tem sido usada há muito tempo na indústria de proteína plasmática para purificar proteínas em grandes escalas. A técnica foi adaptada aqui para a purificação inicial de MAb a partir de meios clarificados alimentados por lote e XD de forma escalável. Duas etapas de filtração de uso único foram desenvolvidas para capturar e lavar o produto precipitado, eliminando a necessidade de centrifugação. Foi demonstrado que a operação de precipitação não afetou negativamente o rendimento da etapa de captura CEX, e reduziu o conteúdo de HCP do eluato por um fator de sete.

Tabela 5. Rendimento e remoção de HCP para GigaCap S-650 carregado com anticorpos precipitados (+PEG) e não precipitados (âPEG)

A capacidade de reduzir a carga de impurezas até agora a montante no trem de purificação é fundamental para trunccionar o processo a jusante ou substituir a cromatografia tradicional por outras tecnologias de uso único. Uma menor carga de impurezas pode melhorar a capacidade de carga de adsorventes de membrana e possivelmente filtros de vírus, que são geralmente itens muito caros em um processo.

Um benefício adicional é a capacidade de redissolver o anticorpo em um buffer que facilita a operação da unidade subseqüente. Por exemplo, meios de cultura celular normalmente requerem uma titulação e diluição extensiva ou um passo UF-DF para preparar a cromatografia de captura com um trocador catiônico. Aqui, o anticorpo precipitado pode ser dissolvido em tampão de equilíbrio em alta concentração, encurtando assim o tempo de processamento. Isto pode ser importante para produtos que não toleram longa exposição a condições de baixo pH/condutividade. No caso deste anticorpo em particular, o meio clarificado requer uma diluição mais do dobro para ser carregado em uma coluna CEX, enquanto que a MAb redissolvida poderia ser carregada diretamente a quase o dobro da concentração do meio não ajustado. Isto é pelo menos uma redução de quatro vezes no volume de carga, o que pode resultar em economias substanciais de tempo para resinas CEX modernas e de alta capacidade.

Acredcimentos

Os autores gostariam de agradecer à proteína Percivia e às ciências analíticas pelo apoio ao ensaio neste trabalho e ao grupo de desenvolvimento do processo Percivia a montante para fornecer os meios de cultura celular.

Nota de marca registrada

PER.C6 é uma marca registrada da Crucell Holland BV Corporation; XD é uma marca registrada da DSM NV; e ECS é uma marca registrada da DSM NV. Todos os outros nomes de marcas são marcas comerciais dos seus respectivos proprietários.

MICHAEL KUCZEWSKI é cientista I, EMILY SCHIRMER, PhD, é cientista II, BLANCA LAIN, PhD, é cientista sênior, e GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, PhD, é diretor sênior, todos em desenvolvimento de processos downstream, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

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