Precipitação de Proteína de Sulfato de Amónio: A chave para o Salting-Out

A precipitação de sal pode ser uma ferramenta muito poderosa para purificar proteínas por precipitação. O sulfato de amônio é geralmente o sal de escolha, pois é barato, muito solúvel em água, e é capaz de se tornar muito mais hidratado (interage com mais moléculas de água) do que quase qualquer outro solvente iônico. Na prática, o sulfato de amônia é adicionado diretamente como um sólido ou adicionado como uma solução (geralmente) saturada para precipitar as proteínas desejadas.

Em baixas concentrações de sal (<0.15M) a adição de mais sal em geral tende a aumentar a solubilidade das proteínas já que os íons protegem as moléculas proteicas das cargas de outras moléculas; esta tendência é chamada de ‘salting-in’. A certa altura a força iónica torna-se demasiado elevada e começa a ter um efeito negativo na solubilidade das proteínas, denominada ‘salting-out’. Isto acontece porque o sal dissolvido compete com as proteínas por moléculas de água escassas, aumentando a tensão superficial da água e, portanto, fazendo com que a proteína se dobre mais. A redução da área de superfície da proteína significa menos interações proteína-água, o que permite mais interações hidrofóbicas entre as moléculas protéicas, causando agregação e subsequentemente precipitação.

Proteínas em solução também podem ser fracionadas, uma vez que elas se precipitarão em função da concentração de sal. Desta forma é possível purificar proteínas específicas adicionando uma quantidade específica de sulfato de amónio para precipitar proteínas não desejáveis, recuperando o sobrenadante, e depois adicionar um pouco mais de sulfato de amónio para precipitar para fora a proteína desejada e, em seguida, salvar esse pellet de proteína precipitada. Como a precipitação de sal só afecta a solubilidade das proteínas e não as desnaturar, a fracção recuperada pode ser armazenada na solução salina por períodos prolongados sem ter de se preocupar com a contaminação bacteriana, uma vez que o elevado teor de sal inibe qualquer crescimento microbiano ou actividade proteica.

Porque a precipitação de sulfato de amónio apenas reduz a solubilidade das proteínas e não as desnaturaliza as proteínas podem ser concentradas pela remoção da solução de sulfato de amónio restante, então o pellet da proteína pode ser resolvido em tampões padrão ou uma concentração mais baixa de sulfato de amónio. A cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de filtração em gel pode então ser usada para purificar ainda mais a solução protéica. O sulfato de amónio também pode ser usado para orientar algumas proteínas desdobradas por desnaturantes como a ureia de volta às suas próprias conformações nativas aumentando gradualmente a concentração de sulfato de amónio.

Existem algumas melhores práticas que devem ser consideradas quando se trabalha com sulfato de amónio tais como:

• Utilizar um almofariz e pilão para quebrar tufos e moer o sulfato de amónio para facilitar a adição e dissolução.
• Adicionar apenas uma pequena quantidade de sulfato de amónio de cada vez, esperar que se dissolva e agitar suavemente para evitar a formação de espuma.
• Utilizar um tampão como 50 mM HEPES ou Tris para minimizar a natureza acidificante do sulfato de amónio.
• Utilizar sulfato de amónio de grau analítico uma vez que graus mais baixos tipicamente exibem contaminação por metais pesados.

O processo de precipitação de sal tem algumas desvantagens. A salga das proteínas requer o conhecimento prévio da solubilidade da proteína. Além disso, qualquer contaminante presente na amostra inicial pode ainda estar presente na fração que contém a proteína de interesse; este processo concentra a proteína mas não a purifica. Além disso, pode ser necessário remover o sal da amostra de proteína e, portanto, será necessário um processamento posterior na forma de diálise ou cromatografia.

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