Propriedades Anticatérmicas e Anti-isquémicas da Medicina Tradicional Chinesa Xinkeshu via Função Protectora Endotelial

Controle
Rabbits foram alimentados continuamente com os pellets padrão por 12 semanas. Os coelhos foram administrados intra-gastricamente com soro fisiológico normal (10 mL/kg/d).

Modelo
Rabbits foram alimentados continuamente com os pellets da dieta H-ChE. Os outros foram os mesmos do Controle.

XKS
Rabbits foram administrados intra-gástricamente com 184,8 mg/kg/d XKS (dose equivalente para um adulto com peso médio de 60 kg) em soro fisiológico normal (10 mL/kg/d). Os outros foram os mesmos do Modelo.

Atorvastatina
Rabbits foram administrados intra-gástricamente com 5,0 mg/kg/d atorvastatina em soro fisiológico normal (10 mL/kg/d). Os outros foram os mesmos do Modelo.

2,3. Análise de lipoproteínas plasmáticas

Amostras de sangue venoso jejum foram coletadas em heparina da veia marginal antes e após as 12 semanas de experimentos. O plasma foi separado e armazenado a -20°C. Os níveis de lipoproteínas plasmáticas, incluindo colesterol total (TC), triglicerídeos (TG), LDL e HDL foram medidos através de um analisador bioquímico automático (Dimension AR, DuPont, EUA).

2.4. ECG no Modelo de Isquemia Miocárdica Induzida VP

Ao final do período experimental de 12 semanas, de acordo com o método de Serradeil-Le Gal et al. , o experimental de isquemia miocárdica vasospástica coronária foi induzido pela VP. O chumbo padrão do membro II do ECG foi registrado continuamente antes e 25 minutos após a administração da VP (2,0 IU/kg, iv.) com um sistema Powerlab 30 (AD Instruments, Castle Hill, Austrália).

2,5. Avaliação do EDVR

Uma semana após o término dos testes ECG, os coelhos (por grupo) foram anestesiados por 10% de hidrato de cloral (25 mg/kg, ip). Segundo o método de Lee et al. , os corações frescos foram imediatamente obtidos e armazenados em PBS fria. Em seguida, as aortas abdominais foram dissecadas e cortadas em anéis de 3 mm. Os anéis foram esticados até 1,5 g de tensão e deixados em equilíbrio por 60 minutos em um banho de tecido de 10 mL (38,6°C) contendo solução de Krebs-Henseleit (composição em mM: 115 NaCl, 25 NaHCO3, 1,38 NaH2PO4, 2,51 KCl, 2,46 MgSO4, 1,91 CaCl2 e 5,56 dextrose) e aerado com uma mistura de 95% O2 e 5% CO2. A geração de força foi monitorada pelo uso de um transdutor isométrico de conexão com o sistema Powerlab 30. Após o equilíbrio, a vasoconstrição foi induzida com PE 10-6 M. Uma vez que a contração máxima tinha atingido um platô, EDVR foi determinado como a resposta de 10-9 a 10-4 M Ach. O percentual de relaxamento foi calculado com base nas mudanças na tensão para o valor máximo de pré-contração induzida pelo PE.

2,6. Estudos Histomorfológicos

Os outros coelhos (por grupo) foram anestesiados por 10% de hidrato de cloral (25 mg/kg, ip). A fixação da perfusão foi realizada em cada coelho através da artéria carótida comum esquerda com soro normal heparinizado (70 mL/kg) e paraformaldeído a 4% (140 mL/kg) em tampão fosfato 0,1 M pelo uso de cateter aórtico (a cerca de 100 mmHg de pressão), enquanto que a veia jugular externa foi cortada para eliminação de sangue remanescente. Duas horas depois, abaixo de 4,0°C, corações e aortas foram removidos e fixados por imersão em formalina tamponada a 10% durante a noite.

As aortas foram abertas longitudinalmente ao longo do lado posterior e então coradas com Sudan IV para visualização das placas ateroscleróticas. Após a coloração, as aortas foram abertas para achatá-las e fotografadas. A área total () e a área das placas () da aorta foram analisadas morfometricamente através do sistema de análise morfométrica Image-Pro Plus 7.0 (Media Cybernetics, EUA). A relação das placas ateroscleróticas foi calculada como .

Artéria coronária circunflexa esquerda (2 cm de comprimento) com os tecidos adjacentes do miocárdio foi cuidadosamente cortada. Os espécimes foram embutidos em parafina e cortados em 5 cortes μm em um microtomo, e os cortes transversais foram então corados com hematoxilina e eosina (HE) e escaneados pelo uso do sistema de análise de imagem de Patologia Digital NanoZoomer (Hamamatus, Olympus, JAP). A área do lúmen () e a área delimitada como lâmina elástica interna () foram analisadas morfometricamente pelo uso do sistema de análise Image-Pro Plus 7.0 para ampliações ×200. A razão de estenose coronária foi calculada como .

2,7. Estudos imunoistoquímicos de eNOS e VCAM-1 em artéria coronária

eNOS e expressões VCAM-1 foram avaliadas imunohistoquimicamente em artéria coronária utilizando o kit de estreptavidina/peroxidase de acordo com as instruções do fabricante. As seções foram desparafinizadas, reidratadas e depois embebidas em tampão de recuperação de antígenos (0,01 M Tris-base, 1,0 M EDTA, 0,05% Tween 20, pH 6,0) por 3 min a 95°C. A atividade endógena da peroxidase foi bloqueada através da incubação das seções em solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 3% durante 1 h à temperatura ambiente. Os cortes foram enxaguados três vezes com PBS, e depois incubados com 100 μL eNOS de cabra anti-coelho ou anticorpo VCAM-1. Os cortes foram enxaguados com PBS e incubados com 100 μL biotinylated rato anti-gota IgG (1 : 100 diluições em PBS). A proteína foi visualizada com solução de substrato de diaminobenzidina. O anticorpo primário foi substituído por PBS nos controles negativos. A área de coloração eNOS ou VCAM-1 () e a área observada () foram analisadas morfometricamente pelo uso do sistema de análise Image-Pro Plus 7.0 para ampliação de ×400. O eNOS total existente ou VCAM-1 foi calculado semiquantitativamente como .

2,8. Análise estatística

Análises estatísticas envolveram o uso do SPSS, v13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Variáveis quantitativas são expressas como médias ± SEM. A comparação de variáveis contínuas entre múltiplos grupos foi realizada através da análise de variância com ANOVA, e comparações post hoc foram feitas usando o teste LSD.

3. Resultados

3.1. Análise de lipoproteínas plasmáticas

Antes da experiência de 12 semanas, os valores basais dos níveis de lipoproteínas plasmáticas (TC, TG, LDL e HDL) não variaram significativamente entre os quatro grupos. Após as 12 semanas de experimento, os coelhos do grupo modelo apresentaram incremento significativo nos níveis de TC (), LDL (), TG () e redução significativa no nível de HDL () em relação ao grupo controle. O tratamento atorvastatina durante 12 semanas reduziu significativamente os níveis de TC (), LDL () e TG () e aumentou significativamente o nível de HDL () comparado com o Modelo. Contudo, o tratamento XKS mostrou uma ligeira redução () nos níveis de TC, TG, LDL () e um ligeiro aumento () nos níveis de HDL () em comparação com o Modelo (Tabela 1).

3.2. Teste de ECG no Modelo de Isquemia Miocárdica Induzida VP

Injeção da VP (iv.) em coelhos conscientes induziu a elevação transitória do segmento ST no ECG em cada grupo. A elevação máxima do segmento ST foi observada 5-10 minutos após a administração da VP no Controle. Os coelhos do grupo modelo mostraram uma elevação do segmento ST significativamente maior () do que os do grupo Controle. O tratamento XKS mostrou um efeito anti-isquêmico significativo () (inibição da elevação do segmento ST induzida pela VP) em relação ao modelo. Atorvastatina também mostrou efeito anti-isquêmico significativo (); entretanto, o XKS foi mais efetivo () que Atorvastatina (Tabela 2 e Figura 2).

Grupo Tempo (min) 2 5 10 15 20 25 Controle 0.08 ± 0.01 0.19 ± 0.04 0.24 ± 0,05 0,17 ± 0,06 0,04 ± 0,01 0,02 ± 0,00 Modelo 0.07 ± 0.02 0.40 ± 0.12aa 0.56 ± 0.12aaa 0.33 ± 0.08a 0.25 ± 0.12aa 0.07 ± 0.01 XKS 0.08 ± 0.01 0.27 ± 0.08ab 0.37 ± 0.10aabb 0.20 ± 0.10b 0.12 ± 0.10ab 0.04 ± 0.00 Atorvastatina 0,06 ± 0,01 0,38 ± 0,15abc 0,46 ± 0,11aabc 0,26 ± 0,09a 0,16 ± 0.06ab 0.06 ± 0.01

Os dados são expressos como média ± SEM, , aa versus Controle; b bb versus Modelo; c versus XKS.

Tabela 2

>

ST elevação de segmento (mV) no ECG após administração de vasopressina.

Figura 2

>
Altura máxima do segmento ST no ECG após administração de vasopressina.

Diminuição da frequência cardíaca (FC) transitória ocorreu após administração de VP em cada grupo. O efeito atingiu seu pico após 10-15 min. no Controle. Os coelhos do grupo modelo mostraram um decréscimo mais óbvio da FC () em comparação com o Controle. O tratamento com XKS mostrou inibição significativa () no decremento da FC comparado com o modelo. Entretanto, nenhum efeito de inibição significativo () foi observado com o tratamento com atorvastatina comparado com o Modelo (Figura 3).

Figura 3

Curvas de taxa de calor após a administração de vasopressina.

3.3. Avaliação do EDVR

Ach (10-9 a 10-4 M) causou um relaxamento dependente da concentração em anéis de aorta abdominal pré-constrição. O EDVR máximo foi significativamente prejudicado () em coelhos do grupo Modelo comparado com o Controle. O tratamento com XKS e Atorvastatina atenuou significativamente () o comprometimento em comparação com o Modelo. Atorvastatina foi mais eficaz () que XKS (Figura 4).

Figura 4

Curvas de relaxamento dos vasos dependentes dos anéis de aorta abdominal.

3.4. Estudos Histomorfológicos

Nenhum coelho do grupo controle mostrou qualquer alteração histológica anormal na aorta. Placas ateroscleróticas macroscópicas típicas na superfície intimal das aortas podem ser vistas distintamente e comumente em coelhos modelo. Placas ateroscleróticas tornaram-se vermelhas pela coloração sudanesa IV. O tratamento com XKS e Atorvastatina () reduziu significativamente a área das placas ateroscleróticas em comparação com o Modelo. O efeito foi semelhante () entre os dois grupos (Figura 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 5

Placas ateroscleróticas na superfície intimal da aorta por coloração Sudan IV.

Não foram apresentadas alterações ateroscleróticas de qualquer parede arterial em coelhos do grupo controle. Mas em coelhos modelo, algumas pequenas arteríolas intramiocárdicas mostraram alterações ateroscleróticas significativas, incluindo que as laminas basais ao redor das células musculares lisas eram irregularmente espessadas e multilaminadas. As fibrilas de colágeno tinham aumentado significativamente na mídia, e um grande número de lipídios tinha se infiltrado na íntima espessada. Os lúmenes coronários tornaram-se estenoses acompanhadas de deposição de lipídios que continham células de espuma. Os coelhos do grupo modelo mostraram uma estenose coronária significativa () do que o controle. O tratamento com XKS e Atorvastatina () inibiu significativamente () a estenose coronária em comparação com o Modelo. O efeito foi semelhante () entre os dois grupos (Figura 6).

Figura 6

Estenose coronária por coloração HE (micrografia leve, média 100×, superior esquerdo 400×).

3,5. Estudos imunohistoquímicos de eNOS e VCAM-1 sobre artéria coronária

No grupo controle, a coloração eNOS positiva pode ser observada na área da camada íntima coronária do citoplasma. A existência da eNOS foi significativamente reduzida () no grupo Modelo em comparação com o grupo Controle. O tratamento com XKS e Atorvastatina aumentou significativamente () a eNOS existente em comparação com o Modelo. Atorvastatina foi mais eficaz () que XKS (Figura 7).

Figura 7

Existência de eNOS e VCAM-1 na artéria coronária por coloração imunohistoquímica (micrografia leve, 400×).

No grupo controle, a coloração positiva do VCAM-1 foi raramente observada em toda a parede da artéria coronária. Entretanto, pôde ser observada em grande parte nas fibrilas de colágeno e na área rica em células de espuma da parede vascular no grupo Modelo, e a existência do VCAM-1 foi significativamente () aumentada do que no grupo Controle. O tratamento com XKS e Atorvastatina diminuiu significativamente () a existência do VCAM-1 em comparação com o Modelo. A XKS foi mais eficaz () do que a Atorvastatina (Figura 7).

4. Discussão

CAM incluindo fitoterapia ganhou uma popularidade mundial nos últimos 20 anos. Argumenta-se que pacientes com condições crônicas, incluindo doenças cardiovasculares, provavelmente usam CAM . A medicina herbal é o método com o uso de plantas medicinais ou ervas medicinais para prevenção e tratamento de doenças, e varia desde medicamentos tradicionais e populares de cada país até o uso de extratos de ervas padronizados e titulados .

XKS comprimido estava sendo amplamente utilizado para tratar CHD pelos praticantes tradicionais na China durante dez anos . Pesquisas clínicas revelaram que o XKS tinha muitas atividades biológicas, incluindo a melhoria da variabilidade da freqüência cardíaca, a redução do episódio de angina de peito, a melhoria da elasticidade arterial . Enquanto isso, pesquisas básicas farmacológicas revelaram que a administração de XKS teve uma variedade de efeitos terapêuticos como a diminuição do consumo de oxigênio no miocárdio, diminuição dos lipídios e antiapoptose.

No presente estudo, a atorvastatina foi escolhida como uma terapia de controle positivo. Os achados mostraram que o tratamento com atorvastatina por 12 semanas foi muito eficaz na redução dos níveis plasmáticos de TC e LDL, aumentando o HDL, diminuindo a isquemia miocárdica experimental, resgatando o EDVR e inibindo o progresso aterosclerótico. O tratamento com XKS durante 12 semanas apresentou os mesmos efeitos no resgate de EDVR e na inibição do progresso aterosclerótico que a atorvastatina. Mesmo a XKS foi mais eficaz na prevenção da isquemia miocárdica e na manutenção do ritmo cardíaco do que a atorvastatina. Talvez estas propriedades tenham sido os principais mecanismos da XKS para a angina pectoris clínica e terapia da arritmia. Por outro lado, um dos achados importantes no presente estudo foi que não ocorreram alterações significativas no perfil lipídico dos coelhos administrados com a XKS. Em outras palavras, a XKS não mostrou nenhum efeito de redução das lipoproteínas para a hipercolesterolemia induzida pela dieta H-ChE.

É bem conhecido que a lesão endotelial é um evento chave na patogênese da aterosclerose. A aterosclerose pode ser induzida por disfunção simples do revestimento endotelial como ocorre com a hipercolesterolemia. A homeostase das células endoteliais é mantida em grande parte através da síntese de óxido nítrico (NO), um potente vasodilatador sintetizado por eNOS. O NO serve funções importantes, incluindo a regulação do tônus vascular e do fluxo sanguíneo regional e a supressão da proliferação de células musculares lisas vasculares. A eNOS é afetada por diferentes estímulos, incluindo hipóxia, estresse de cisalhamento, LDL e o desenvolvimento e progressão da aterosclerose. A diminuição da expressão ou inactivação da eNOS é reconhecida como um factor crucial no desenvolvimento da disfunção endotelial. O importante papel das moléculas de adesão vascular na aterosclerose foi descoberto e essas moléculas desempenham um papel importante na adesão dos leucócitos circulantes ao endotélio, que é o primeiro passo no início da aterosclerose. Como uma glicoproteína transmembrana, a VCAM-1 é upregulada e expressa em locais propensos à aterosclerose, mesmo antes da doença macroscópica ser aparente, com expressão persistente em lesões ateroscleróticas mais avançadas. A dieta aterogênica poderia rapidamente induzir a expressão do VCAM-1 no endotélio aórtico em culturas de órgãos aórticos.

De acordo com a nova propriedade dos antiaterogênicos e antiisquemia não via via anti-hiperlipidemia, nós focamos na proteção endotelial como o alvo para investigar o mecanismo de fato da XKS. eNOS e VCAM-1 foram escolhidos como fatores antiaterogênicos e aterogênicos, respectivamente. Os achados mostraram que as 12 semanas de dieta H-ChE causaram diminuição da expressão da eNOS, bem como aumento da expressão do VCAM-1 durante o procedimento de aterosclerose. O tratamento com Atorvastatina e XKS mostrou propriedades protetoras vasculares ao alterar a expressão da eNOS e do VCAM-1. Portanto, a significativa proteção endotelial ao vascular foi provavelmente um dos mecanismos importantes envolvidos nas propriedades cardioprotetoras da XKS.

XKS inclui 5 componentes medicinais herbais, e são eles Salvia miltiorrhiza Bunge, Panax notoginseng (PN), Fructus Crataegi, Radix Puerariae, e Radix Aucklandiae (Tabela 3). Os materiais foram originalmente moídos a um pó fino por um micronizador e preparados como comprimidos, que foram autenticados e padronizados com base nos compostos marcadores da Farmacopeia Chinesa 2010 . Diversos grupos de monômeros com atividades biológicas especiais foram extraídos de cada componente, por exemplo, atenuando a fibrose pulmonar do extrato PN, diminuindo o colesterol plasmático do extrato de Hawthorn, melhorando a resistência insulínica do extrato de Puerarin e atenuando o edema idiopático do extrato de radix Aucklandiae. Segundo a teoria da MTC, a Salvia miltiorrhiza Bunge foi vista como uma espécie de “droga principal”, o Panax notoginseng como “droga ministerial”, e os outros 3 componentes serviram como “droga adjuvante” entre os componentes do XKS . Tanshinone IIA era um dos ingredientes monómeros mais importantes do extracto de Salvia miltiorrhiza Bunge . As atividades biológicas do Tanshinone IIA foram a diminuição do consumo de oxigênio no miocárdio, a dilatação das artérias coronárias e a melhoria da regeneração neuronal, anti-hipertensão e antioxidante.

Binómio latino Fontes de erva ou plantas Parte usado Porção (%) Radix salviae miltiorrhiae Salvia miltiorrhiza Bge. Raízes e rizoma 32 Panax notoginseng Panax Notogin seng (Burk) F.H Chen Root e rizoma 2 Hawthorn Crataegus pinnatifida Bge. Fruit 32 Radix Puerariae Pueraria lobata Root e rizoma 32 Radix Aucklandiae Aucklandia lappa Decne. Raíz e rizoma 2

Tabela 3

Formulação da pastilha xinkeshu.

No presente estudo, vimos o XKS como um único “medicamento” e investigámos a acção farmacológica de todos os componentes em conjunto. Embora os resultados deste estudo tenham impulsionado outros estudos sobre a acção terapêutica da XKS, a relação destes componentes e as suas interacções ainda não foram esclarecidas. Estas foram as principais limitações do presente estudo. Portanto, o mecanismo molecular detalhado da XKS e outros estudos em animais sobre a farmacologia dos princípios ativos e metabólitos devem ser investigados.

5. Conclusão

Em conclusão, foi explicitamente demonstrado que a MTC XKS exerceu potentes propriedades antiaterogênicas e anti-isquêmicas no modelo de coelho isquêmico aterosclerótico miocárdico. Um efeito protetor endotelial pode estar envolvido no mecanismo, além do efeito anti-hiperlipidêmico. Nós acreditamos que uma melhor compreensão dos mecanismos pelos quais o XKS protege os endotélios e as interações dos princípios ativos poderia levar a novas intervenções farmacológicas de CAM para pacientes com CHD.

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pelo Major State Basic Research Development Program (G2000056905), National Natural Science Foundation (No. 81073021), e Education Ministry Science Foundation (108019) da China. Xu Tao e Peng Jing-bo contribuíram igualmente para este trabalho.