Raíz Adventícia
Métodos para raízes de Microsshoots
Se os microsshoots não formam raízes durante a fase de multiplicação, devem receber tratamentos especiais para iniciar e desenvolver um sistema radicular adventício. Os microshoots podem ser enraizados in vitro e depois aclimatados ao meio ambiente, ou podem ser enraizados ex vitro, combinando assim enraizamento e aclimatação.
A facilidade e a taxa de sucesso do enraizamento determinam qual o método utilizado numa determinada cultivar. O método mais rentável é o de enraizamento ex vitro. O enraizamento ex vitro poupa uma transferência in vitro adicional para o meio de enraizamento e acelera a aclimatação tornando a micropropagação mais eficiente. O enraizamento in vitro é utilizado se faltarem instalações de enraizamento e aclimatação ex vitro, se as taxas de sucesso forem baixas com o enraizamento ex vitro e a critério do gerente do laboratório.
Enraizamento in vitro. Os ingredientes no meio e as condições de incubação são fáceis de alterar quando as condições in vitro são utilizadas para promover o enraizamento e o desenvolvimento precoce. As formulações de sal nutritivo podem permanecer as mesmas, ser alteradas ou reduzidas, muitas vezes para macrossaltos de meia força, e a humidade relativa reduzida pela utilização de tampas ventiladas (Figura 5). As condições de incubação com luz e temperatura podem ser alteradas para o enraizamento. Muitos microshoots são incubados na escuridão durante um período de iniciação radicular e depois transferidos para condições iluminadas.
Figure 5. A fita micropore cirúrgica fornece ventilação a este vaso de rebentos enraizados; isto ajuda a reduzir a humidade relativa e prepara as novas plantas para o ambiente da estufa.
O meio nutriente enraizado no qual são colocados os micropoços recém-cortados contém geralmente auxina. Tipicamente as concentrações micromolares de IBA e/ou NAA são adicionadas ao meio antes do autoclavamento. A concentração da auxina depende da espécie e da cultivar. Esta informação está tipicamente disponível online usando um motor de busca acadêmica, como o Google Scholar http://scholar.google.com/. Tipicamente o nome da planta, as palavras ‘vitro’ e ‘raiz’ (ou raiz adventícia) na cadeia de busca produzirão informação específica. Se a literatura estiver ausente para uma determinada planta, use parentes próximos na busca para determinar como eles responderam.
Por ser reconhecido que as mesmas concentrações de auxina que estimulam a iniciação adventícia da raiz podem inibir o desenvolvimento radicular, alguns usam uma abordagem de dois meios. Quando microshoots de Cotinus coggygria estavam em meio contendo 10 µM IBA por 5 dias antes da transferência para meio livre de auxina, 100% enraizadas; enquanto apenas 40% enraizadas com cultura contínua em meio com 10 µM IBA (Metivier et al., 2007). Padilla e Burgos (2010) cultivaram micropoços de oliveira em meio contendo até 4 µM IBA por 2 semanas, seguido de transferência para meio basal sem auxina que resultou em 65-93% de enraizamento, dependendo da cultivar.
Em alguns casos, soluções de IBA foram aplicadas em micropoços como um mergulho basal por um minuto ou mais. Tsvetkov et al. (2007) obtiveram seu melhor enraizamento de microshoots Sorbus domestica quando foram mergulhados em uma solução IBA de 14,8 µM por 80 s antes de serem colocados em meio basal.
A escuridão durante ou antes do enraizamento pode aumentar o sucesso do enraizamento e a sincronicidade do enraizamento entre os microshoots. Etiolação, desenvolvimento de brotos sem luz, aumentará a competência celular para enraizamento adventício (Murray et al., 1994). Quando os microshoots de noz foram etiolados, o enraizamento foi melhor com a emergência mais rápida das raízes do que a partir de brotos verdes (Leslie et al., 2010); entretanto, os brotos etiolados foram quebradiços e exigiram um manuseio mais cuidadoso.
Cultivar microshoots verdes em meio de enraizamento na escuridão por um período relativamente curto pode melhorar muito o enraizamento. Um período de escuridão por 4-7 dias em meio de força Murashige e Skoog meio contendo 1 µM phloroglucinol e 1,4 µM IBA seguido de incubação sob condições iluminadas resultou em melhor enraizamento dos microshoots de maçã ‘Delicious’ do que se cultivados apenas em luz ou na escuridão por períodos mais longos (Zimmerman, 1984). Ao cultivar microscópios de porta-enxertos de maçã ‘MM106’ em meio com 4 µM IBA na escuridão por 0-10 dias, foi descoberto através de investigação histológica que a indução radicular ocorreu durante os primeiros 3 dias ou menos na escuridão e que a raiz primordia cônica era visível no 7º dia (Naija et al., 2008). O tempo de tratamento na escuridão é crítico e pode precisar ser determinado para cada cultura ou genótipo; no entanto, pode aumentar muito o sucesso do enraizamento.
Uma raiz de alguma espécie é melhor se os topos dos microscópios estiverem iluminados e a porção basal no meio estiver na escuridão, semelhante à forma como os macro-cortes estão enraizados num meio de estufa sob neblina. O escurecimento do meio de cultura pode ser conseguido pintando o exterior dos vasos de cultura de preto até ligeiramente acima do nível do meio de cultura e cobrindo o meio de cultura com grânulos estéreis de policarbonato ou outra luz, excluindo a substância ou escurecendo o próprio meio de cultura, pela adição de carvão ativado. Às vezes, um meio de cultura em estufa, como a vermiculita, que também exclui a luz, é utilizado para enraizamento in vitro, após ser molhado com o meio nutriente.
Demonstrou-se que o escurecimento apenas das bases dos microscópios aumentava o enraizamento de amêndoas, pêssegos e azeitonas (Rugini, 1988) e maçãs (Mencuccini e Rugini, 1993), em comparação com os controles incubados na escuridão ou sob luz. Entretanto, em um estudo separado, Mencuccini e Rugini (1993) relataram que o escurecimento basal teve pouco efeito no enraizamento de amêndoas, damascos, castanhas, jojobas e microenxertos de azeitonas e foi inibidor de nozes. Portanto, se o sucesso do enraizamento estiver abaixo do desejável, o escurecimento basal pode ser útil.
Ex vitro enraizamento. Se as percentagens de enraizamento forem semelhantes, o enraizamento ex vitro pode ser mais eficiente e económico do que o enraizamento in vitro (Leva, 2011). Os custos são mais elevados ao enraizar in vitro devido aos ingredientes, tempo de preparação, meios de autoclavagem, mão-de-obra para transferências e culturas em movimento, e espaço de incubação. O movimento para a estufa é semelhante entre o enraizamento in vitro e ex vitro, e o tempo de transplante pode ser semelhante ou mais lento quando há raízes nos microshoots (Figuras 4 e 6). A eficiência é obtida através do enraizamento ex vitro. Tem sido relatado que a qualidade da raiz das microplantas de nozes é superior quando as raízes formam ex vitro sob nevoeiro do que in vitro num meio gelificado (Leslie et al., 2010).
Figure 6. (a) e (b) Plantas de cerejeira micropropagadas in vitro prontas para transplantar para uma estufa de turfa sphagnum antes de serem colocadas sob elevada humidade relativa para aclimatação. (c) As cerejeiras plantadas como primeiro passo para a aclimatação em estufa. (d) As plântulas de nozes a serem plantadas numa estufa plana antes de serem colocadas sob humidade relativa elevada.
O enraizamento in vitro pode ser uma melhoria do enraizamento in vitro. Embora os microshoots in vitro de Gardenia jasminoides enraizados em 10 dias, comparados com 14 para os microshoots ex vitro, todos os microshoots enraizados ex vitro sobreviveram à aclimatação comparados com 80% de sobrevivência para os microshoots enraizados in vitro (Hatzilazarou et al., 2006). Sobrevivência mais fraca dos microshoots enraizados in vitro em comparação com os microshoots ex vitro também foi relatada para nozes (Leslie et al., 2010).
Pode ser necessário tratar os microshoots com auxina antes do plantio em meio de enraizamento para enraizamento ex vitro. Microsshoots de pistácio tratados com 2% de IBA em talco enraizado ex vitro a 79% comparado com 48% de enraizamento para os controles (Benmahioul et al., 2012).
Improvado enraizamento ex vitro também pode ser obtido com auxina aplicada como um mergulho líquido aplicado na porção basal dos microshoots. Um pulso de 15 minutos em 250 µM IBA causou 90% da espécie de árvore Melia azedarach microshoots à raiz em comparação com nenhum enraizamento em microshoots de controle (Husain e Anis, 2009). Um mergulho de 2 h em uma solução aquosa de 588 µM IBA causou 90% dos microscópios de Malus zumi na raiz em comparação com o enraizamento dos controles em 20% (Xu et al., 2008).
Talvez devido a uma reversão à juvenilidade, o tempo crescente sendo multiplicado in vitro pode aumentar o enraizamento dos microscópios. Leva e Petruccelli (2012) testaram o enraizamento através de sete subculturas e descobriram que o enraizamento foi melhor após a sétima subcultura.
As instalações, a espécie, o método de envio, a demanda do cliente e as preferências gerenciais ditam como os microshoots são enraizados. Espécies que radicam muito facilmente ou radicam durante a fase de proliferação de rebentos podem ser aclimatadas para o ambiente ex vitro rapidamente. São as espécies desafiadoras que recebem atenção especial, em relação à iluminação, tratamento de auxinas, enraizamento in vitro ou ex vitro, e outros fatores. Os clones que são difíceis de enraizar exigem maiores preços dos clientes porque o enraizamento é um impedimento para uma produção eficiente. O enraizamento pode ser melhorado se for abordado como um processo em várias etapas de aquisição de competência, iniciação radicular e subsequente crescimento radicular. Todas estas etapas devem ser consideradas e abordadas, especialmente com os clones mais difíceis de serem enraizados.