Relógios biológicos

A alternância do dia e da noite do ciclo da Terra é tão confiável que não é surpreendente que animais, plantas e bactérias ajustem seu comportamento e fisiologia (para uma revisão, ver ref. 1). Os ritmos circadianos são uma adaptação ubíqua de todos os organismos aos mais previsíveis desafios ambientais. Um ritmo biológico que persiste sob condições constantes e tem um período de ≈1 dia é chamado “circadiano” (circa, “ao redor”; dian, “dia”).

Até muito recentemente, as moléculas subjacentes à oscilação têm permanecido desconhecidas. Perturbações de tais oscilações por inibidores de RNA ou síntese de proteínas sugerem que tais moléculas estão envolvidas (2).

Uma abordagem que tem sido bem sucedida em desvendar mecanismos é o uso de alterações genéticas. Os mutantes do primeiro e segundo relógio descobertos na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são genes da época e atemporais (3-5).

Em moscas da fruta, a abundância de mRNA e produtos protéicos da época e o ciclo de genes atemporais para ≈24 horas em sites específicos do cérebro da mosca (6). Maki Kaneko et al. falaram sobre estas células putativas de marcapasso no cérebro da mosca da fruta usando estas oscilações moleculares como marcador (7). Na cabeça adulta, estudos com proteínas mostraram que por é ritmicamente expresso em locais específicos, os neurônios laterais localizados entre o cérebro central e os lobos ópticos. Os neurônios laterais são considerados como as células do marcapasso putativo para o ritmo de atividade locomotora da mosca adulta.

Kaneko et al. (7) demonstraram que os produtos de per e tim são detectáveis em um número limitado de neurônios no cérebro larval. Os padrões de expressão em várias dessas células são cíclicos. Entre esses neurônios, cinco células localizadas lateralmente se expressam. PERÍODO (PER) desde o estágio larval inicial, sugerindo que elas podem ser responsáveis pela manutenção do tempo larval de eclosão e atividade locomotora. Outro achado interessante é um aglomerado de neurônios com a expressão cíclica de per e tim em fase anti-fase para os neurônios laterais. Os resultados implicam a presença de múltiplos osciladores envolvidos em ritmos de diferentes processos fisiológicos ou comportamentais em um único organismo. Kaneko et al. (7) também descreveram a caracterização anatômica dos padrões de fiação dos neurônios marcapasso usando a expressão gênica por promotor-repórter dependente do gene. Tal abordagem anatômica molecular deve trazer uma nova visão sobre o mapeamento funcional deste sistema cerebral. Além disso, a comparação entre células de mamíferos e células do relógio voador deve esclarecer a relação evolutiva entre estes sistemas.

O controle circadiano de transcrição fornece um ponto de entrada para analisar os elementos reguladores de cis-ação e fatores trans-atuantes através dos quais o relógio pode regular muitas expressões gênicas controladas por relógio (6). Estes supostos elementos reguladores de ação cis, chamados de “caixa de tempo” (8), são assumidos como localizados na região promotora e melhoradora dos genes controlados por relógio. Além disso, o elemento reativo controlado por relógio (6) ou caixa de tempo pode regular os fenômenos fisiológicos circadianos endógenos sob condições constantes. Mais recentemente, um possível candidato para a caixa de tempo foi identificado na região promotora do gene do período Drosophila (9). Embora o per tenha sido proposto para mediar o ciclo do mRNA através da repressão transcripcional, a interação direta entre per e DNA é muito improvável devido à falta de um domínio de ligação de DNA no PER. O grupo de Hardin analisou extensivamente a região promotora de por gene em estudos usando moscas transgênicas do gene de fusão per-lacZ (9). Eles identificaram um potenciador transcripcional circadiano dentro de um fragmento de DNA 69-bp contendo uma caixa E a montante de por gene, que é responsável pela ativação noturna da expressão de por gene. A E-box é um sítio de ligação conhecido para a classe básica de factores de transcrição da hélice-helix-loop-helix.

Recentemente, o candidato mais forte para um factor de trans-acção no oscilador é Clock, clonado através da utilização de uma estratégia genética avançada (10). O grupo de Takahashi (10) isolou e analisou a atividade locomotora de cepas de ratos mutantes circadianos. O Relógio mutante exibiu um longo período tornando-se arrítmico após vários dias na escuridão constante. Takahashi e colegas (10) clonaram com sucesso o gene responsável e identificaram a mutação na região codificadora da proteína do gene Relógio. Curiosamente, a proteína Clock contém um domínio de ligação proteína-proteína (PAS), que está localizado no Drosophila por gene e um motivo básico de hélice-helix-loop-helix para a ligação do DNA. Além disso, Takahashi e colegas (10) foram capazes de resgatar completamente o longo período e fenótipo arrítmico de ratos mutantes do relógio por transferência do gene normal do relógio.

Ravi Allada et al. descreveram os componentes moleculares comuns com foco em Relógio, que é responsável pela geração do ritmo circadiano tanto em moscas quanto em humanos (11). Allada e seus colegas (11) pesquisaram moscas mutagenizadas quimicamente à procura de mutantes que alteram ou abolem o ritmo circadiano da atividade locomotora e encontraram um novo mutante arrítmico, inicialmente chamado Jrk. As moscas Jrk expressam níveis baixos de proteínas periódicas e intemporais por causa dos níveis reduzidos de transcrição. O gene foi identificado e exibe uma surpreendente conservação de sequência com o gene do ritmo circadiano dos mamíferos, Clock; por isso, Allada et al. (11) renomearam este gene de mosca dClock. Assim como o relógio do rato, o relógio Drosophila contém domínios básicos de hélice-loop-helix e PAS, assim como um domínio de ativação transcripcional.

Trabalhos recentes tanto de mamíferos como de moscas sugerem que os parceiros proteicos de CLOCK também são conservados evolutivamente (chamados BMAL) (12, 13). Foi mostrado que os dímeros de CLOCK-BMAL se ligam à região promotora dos genes periódicos e intemporais e transacionam ambos os genes em moscas. Além disso, a expressão PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) reprime a indução de CLOCK-BMAL-mediated repórter. Assim, um modelo de feedback negativo tem sido proposto (Fig. 1).

Em mamíferos, o SCN no hipotálamo é considerado como um importante marcapasso para fenômenos do ritmo circadiano, como demonstrado por muitos estudos anatômicos e fisiológicos (14). Recentemente, três homólogos do gene do período Drosophila foram relatados em camundongos e humanos (15). Apesar da existência de três homólogos do período mamífero que mostram oscilação do mRNA circadiano no núcleo supraquiasmático do cérebro de camundongos, nenhuma implicação funcional do comportamento locomotor circadiano tem sido relatada.

Para esclarecer se o mamífero por homólogo pode estar envolvido no ritmo circadiano do comportamento locomotor dos mamíferos, o grupo de Ishida clonou um rato por homólogo e fez ratos arrítmicos com lesão SCN para monitorar o ritmo circadiano nos tecidos periféricos (16).

Para testar se a expressão rítmica do mRNA do rato PERÍODO 2 (RPER2) é observada em outros tecidos que não o SCN, foi realizada a análise do baço do norte nos tecidos do olho, cérebro, coração, baço pulmonar, fígado e rins. Curiosamente, todos os tecidos testados mostraram expressão rítmica do mRNA do RPER2, embora a relação noite/dia fosse diferente em cada tecido. RPER2 se comporta como um homólogo mamífero do gene do período Drosophila (16) porque sua expressão circadiana era alta à noite em uma grande variedade de tecidos como o período está em Drosophila.

Porque o SCN é considerado um marcapasso circadiano em mamíferos, o grupo de Ishida (16) testou se a expressão circadiana de múltiplos tecidos de RPER2 mRNA é afetada por uma lesão de SCN. Surpreendentemente, a natureza rítmica da expressão de múltiplos tecidos do RPER2 foi completamente abolida pela lesão SCN. A expressão múltipla tecidual de RPER2 está, portanto, sob o controlo do SCN. Este é o primeiro relatório a indicar que o ritmo circadiano de múltiplos tecidos é governado por um relógio cerebral de mamíferos, o SCN do hipotálamo. Os dados também sugerem que um mamífero por homólogo (RPER2) pode estar envolvido no ritmo circadiano do comportamento locomotor em mamíferos, pois a perda da expressão circadiana de RPER2 mRNA em todo o corpo ocorreu quando a atividade locomotora circadiana de ratos foi perdida. Para esclarecer tal problema, temos que fazer com que os animais transgênicos tenham uma perda de função ou uma mutação de ganho de função no gene RPER2. O fato da expressão rítmica do mRNA RPER2 em vários tecidos depender completamente do SCN sugere que alguns sinais são necessários para manter coordenadamente o ritmo de todo o corpo (Fig. 2). Um estudo de transplante de SCN também sugere a importância dos fatores humorais do SCN (17). Tais fatores humorais do SCN podem ser importantes para gerar a expressão rítmica circadiana do gene RPER2 nos tecidos periféricos. Assim, parece, como no caso da biologia do desenvolvimento, que moléculas chave deste relógio biológico estão bem conservadas entre moscas e mamíferos. O mecanismo comum do relógio molecular, desde bactérias (18) até ao humano, poderá ser visionado num futuro próximo.