Sensibilidade Analítica, Sensibilidade Funcional

Uma das características fundamentais de qualquer método analítico é a menor concentração que pode ser medida de forma confiável. Vários termos e conceitos têm sido usados para descrever a menor concentração que um imunoensaio pode relatar, e esta multiplicidade de termos pode ser genuinamente confusa. O que se segue é uma discussão de alguns desses termos e como eles se relacionam com a resposta à questão fundamental: Qual é a menor concentração que eu posso relatar com este ensaio?
Sensibilidade analítica
A definição formal de sensibilidade analítica é “a menor concentração que se pode distinguir do ruído de fundo”. Esta concentração é adequadamente chamada de limite de detecção do ensaio, mas é mais comumente referida como sensibilidade. Tipicamente, este valor é estabelecido através do ensaio de réplicas de uma amostra que se sabe não ter nenhum analito presente. Em seguida, as contagens medidas (DPC) dessas réplicas são usadas para calcular uma média e um desvio padrão (SD). A sensibilidade analítica é determinada como a concentração equivalente às contagens médias obtidas da amostra zero mais 2 DP para ensaios imunométricos, e a média menos 2 DP para ensaios competitivos. Isto é o que está publicado na seção “Sensibilidade Analítica” dos encartes das embalagens IMMULITE® e IMMULITE® 2000.
No mundo real, a sensibilidade analítica tem um valor prático limitado. A verdadeira limitação é que, para qualquer ensaio, a imprecisão aumenta muito rapidamente à medida que a concentração diminui. Este fenômeno é facilmente visível quando se observa o perfil de precisão do ensaio, que é uma representação gráfica de como a imprecisão de um ensaio muda com a concentração medida. (Ver Figuras 1 e 2 para exemplos.)

Figure 1. Perfil representativo de precisão DPC.

Figure 2. Perfil de precisão do DPC representativo. Note que a sensibilidade funcional na região 0,01-0,02 µIU/mL, é requerida de um ensaio TSH de “terceira geração” por definição.1,2
Não apenas na sensibilidade analítica, mas mesmo em concentrações significativamente acima dela, a imprecisão pode ser tão grande que os resultados não se reproduzem bem o suficiente para serem de utilidade clínica real. Consequentemente, a sensibilidade analítica normalmente não representa a menor concentração mensurável que é clinicamente útil.
Esta limitação da sensibilidade analítica sempre esteve conosco, para RIA e IMMULITE, e se aplica a todos os métodos por todos os fabricantes. Como as amostras dos pacientes não são tipicamente reproduzidas, a falta de reprodutibilidade pode não ser facilmente visível nos testes de rotina. No entanto, a qualidade geral e a utilidade dos resultados são afetadas. É por isso que o limite inferior do intervalo de notificação no software IMMULITE e IMMULITE 2000 é frequentemente fixado numa concentração acima da sensibilidade analítica. O DPC define os limites de notificação para cada ensaio para o que uma avaliação abrangente sugere ser a gama de desempenho eficaz e confiável para o ensaio, em relação ao seu uso clínico pretendido.
As limitações da sensibilidade analítica, para descrever o limite inferior do desempenho clinicamente eficaz do ensaio, levou ao desenvolvimento de outro conceito.
Sensibilidade funcional
A cerca de uma década atrás, em reação à limitada utilidade da sensibilidade analítica como medida de desempenho do ensaio, um grupo de pesquisadores avaliando ensaios TSH desenvolveu um conceito que eles chamaram de sensibilidade funcional.1 Eles o definiram como “a menor concentração na qual um ensaio pode relatar resultados clinicamente úteis”. Os resultados clinicamente úteis para TSH foram considerados como sendo de boa precisão com um CV diário de não mais de 20%. Embora esta escolha do limite de CV fosse um pouco arbitrária, os pesquisadores sentiram que, para a TSH, um CV de 20% era a maior imprecisão que poderia ser tolerada para fins clínicos.1
Desde que o CV seja o desvio padrão expresso como uma porcentagem da média, um CV de 20% implica que o DP seria 20% da média. Para uma amostra com uma concentração de TSH de 0,1 µIU/mL, por exemplo, a faixa abrangendo 95% dos resultados esperados de análises repetidas seria ±40% (±2 DP), ou 0,06 µIU/mL a 0,14 µIU/mL.
Embora originalmente desenvolvido apenas para ensaios TSH, o conceito de sensibilidade funcional e a utilização de um CV de 20% como limite de utilidade clínica têm sido amplamente aplicados a outros imunoensaios. O conceito ganhou aceitação porque fornece ao laboratório uma indicação objectiva e clinicamente significativa do limite inferior prático de um ensaio.
Ao desenvolver um novo ensaio, o CPD utiliza essencialmente a mesma abordagem, avaliando tanto a precisão quanto a exatidão para estabelecer as concentrações nas quais os limites de utilidade clínica são passíveis de serem alcançados. A faixa de relato do software é baseada nesta avaliação. Para ensaios competitivos, especialmente, há geralmente uma diferença significativa entre a sensibilidade analítica e o limite inferior de relato. A faixa de notificação, conforme definida no software IMMULITE e IMMULITE 2000, representa a recomendação da DPC para a “faixa relatável” CLIA’88* – que é a faixa de concentração sobre a qual o desempenho do ensaio é documentado como válido.
Verificando o desempenho do ensaio
Currentemente, para laboratórios que utilizam sistemas automatizados de imunoensaio nos EUA, a única característica de desempenho relacionada com a sensibilidade que o CLIA’88 requer que seja verificada pelo laboratório é o limite inferior da faixa relatável. Alguns laboratórios também podem optar por estimar a sensibilidade funcional de um novo ensaio; e, historicamente, alguns têm querido verificar a sensibilidade analítica. Cada uma destas avaliações é um experimento diferente, com protocolos e requisitos distintos. Assim, o primeiro passo é decidir o que deve ser verificado e depois utilizar o protocolo apropriado e avaliar os dados em conformidade.
Se um laboratório optar por avaliar a sensibilidade analítica, o objetivo normalmente é verificar o valor dado para essa medida de desempenho na bula. É essencial que a amostra utilizada para um estudo de sensibilidade analítica seja uma amostra de concentração verdadeiramente zero com uma matriz de amostra apropriada. Qualquer outro tipo de amostra pode distorcer os resultados. O protocolo usual envolve o ensaio de 20 réplicas da amostra zero, seguido do cálculo da média e do SD da DPC. A sensibilidade analítica é estimada como a concentração igual às contagens médias da amostra zero mais 2 SD para ensaios imunométricos (“sanduíche”) como TSH, ou menos 2 SD para ensaios competitivos como T4. Os Serviços Técnicos podem ajudar no cálculo desta concentração. Este protocolo produz uma estimativa inicial, que normalmente é adequada para comparação com a sensibilidade analítica listada na bula. No entanto, são necessários múltiplos experimentos que abrangem vários lotes de kits para obter uma avaliação robusta e precisa.
Na avaliação da sensibilidade funcional, o objetivo é determinar a menor concentração correspondente a um objetivo especificado laboratorialmente para imprecisão diária (interensaio) representando o limite de utilidade clínica para um determinado ensaio. Comumente, um CV de 20% tem sido utilizado como meta, com base na aplicação original do conceito ao TSH. No entanto, este CV pode nem sempre ser o limite mais apropriado. Para alguns ensaios, um CV superior a 20% pode ser consistente com resultados clinicamente confiáveis e informativos, enquanto para outros, um CV inferior a 20% pode representar o limite de utilidade clínica. O objetivo de desempenho precisa ser estabelecido para cada ensaio, com base na sua aplicação clínica pretendida.
A partir da determinação do CV diário que representa o limite de reprodutibilidade clinicamente útil, o próximo passo é estimar a concentração na qual o CV poderá atingir esse limite. Com base em estudos prévios, dados de inserção de pacotes e estimativas feitas a partir do perfil de precisão do ensaio, os Serviços Técnicos podem normalmente ajudar a identificar um “intervalo alvo” de concentrações que escalonam o limite de CV pré-determinado.
De facto, este estudo deve ser realizado utilizando várias amostras de pacientes não diluídas, ou conjuntos de amostras de pacientes, com concentrações que abranjam o intervalo alvo. No entanto, estas amostras podem ser difíceis de obter. Alternativas razoáveis incluem amostras de pacientes diluídas até concentrações que abranjam o intervalo alvo, ou materiais de controle dentro ou perto deste intervalo. Se houver a necessidade de diluir qualquer tipo de amostra para o estudo, o diluente usado é crítico. Os diluentes de amostras de rotina destinam-se apenas a diluir amostras com concentrações muito elevadas; para alguns ensaios, podem ter uma concentração aparente mensurável, embora muito baixa. A utilização destes diluentes pode enviesar os resultados do estudo.
As amostras devem ser analisadas repetidamente ao longo de várias séries, idealmente ao longo de um período de dias ou semanas, para avaliar a precisão do dia-a-dia. (Uma única série de 20 réplicas não fornece uma avaliação válida da sensibilidade funcional). Uma vez recolhidos os dados, calcular o CV para cada amostra testada. A sensibilidade funcional é a concentração na qual o CV atinge o limite pré-determinado. Esta concentração pode ser estimada a partir dos resultados do estudo por interpolação, caso não coincida com um dos níveis testados.
Verificar o limite inferior da faixa relatável é uma parte do processo de verificação de toda a faixa relatável. Isto é normalmente realizado através da análise de réplicas em uma série de três a cinco amostras com concentrações conhecidas que abrangem a faixa relatável. Essas amostras podem ser obtidas usando uma única amostra, com uma concentração próxima ao limite superior do intervalo, que é então diluída para dar amostras adicionais abrangendo todo o intervalo relatável. Os resultados obtidos são avaliados tanto quanto à reprodutibilidade como à recuperação dos valores esperados para determinar se o desempenho do ensaio atende às necessidades de utilidade clínica em toda a faixa relatável.
Conclusão
Então, porque é que o limite inferior da gama de relatórios do software é 1,0 µg/dL (13 nmol/L) quando a inserção da embalagem diz que a sensibilidade é 0,3 µg/dL (3,9 nmol/L)? Neste exemplo, o ensaio é um ensaio competitivo e a imprecisão do ensaio excede os limites clinicamente úteis a uma concentração bem acima da sensibilidade analítica.
Se a imprecisão é tal que não se pode dizer com certeza que os resultados de, digamos, 0,4 µg/dL (5 nmol/L) e 0,7 µg/dL (9 nmol/L) são de facto diferentes, não seria melhor relatar ambos como ”
Ultimamente, normalmente não é o limite de detecção do ensaio (sensibilidade analítica) mas sim a reprodutibilidade dos resultados que determina o limite inferior do desempenho clinicamente fiável do ensaio na prática de rotina.

1. Spencer CA. Perfil da tiróide para os anos 90: estimativa T4 livre ou medida TSH sensível. J Clin Immunoassay 1989; 12:82-9.
2. Spencer CA, et al. Diferenças interlaboratoriais/intermédias na sensibilidade funcional dos ensaios imunométricos de tirotropina (TSH) e impacto na fiabilidade da medição de concentrações subnormais de TSH. Clin Chem 1995;41:367-74. Reimpressão (número de catálogo ZD060) disponível na DPC mediante solicitação.
*CLIA’88: a Lei de Melhoria do Laboratório Clínico dos EUA.