Sequenciamento de bissulfito

Sequenciamento de bissulfito aplica métodos de seqüenciamento de rotina no DNA genômico tratado com bissulfito para determinar o estado de metilação nos dinucleotídeos CpG. Outras estratégias de não sequenciamento também são empregadas para interrogar a metilação em loci específicos ou a nível de todo o genoma. Todas as estratégias assumem que a conversão de citosinas não metiladas em uracil induzida por bissulfito é completa, e isto serve como base de todas as técnicas subsequentes. Idealmente, o método utilizado determinaria o estado de metilação separadamente para cada alelo. Métodos alternativos ao sequenciamento de bissulfito incluem a Análise Combinada de Restrição de Bissulfito e a imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP).

Metodologias para analisar o DNA tratado com bissulfito estão sendo desenvolvidas continuamente. Para resumir estas metodologias em rápida evolução, foram escritos numerosos artigos de revisão.

As metodologias podem ser geralmente divididas em estratégias baseadas na PCR específica da metilação (MSP) (Figura 4), e estratégias empregando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) realizada sob condições não específicas da metilação (Figura 3). Os métodos baseados em microarranjos também utilizam a PCR baseada em condições não específicas de metilação.

Métodos baseados em PCR não específicos de metilaçãoEditar

Figura 3: Métodos de análise de DNA por metilação não baseados em PCR específica de metilação. Após a conversão do bissulfito, o ADN genómico é amplificado com PCR que não discrimina entre sequências metiladas e não metiladas. Os numerosos métodos disponíveis são então usados para fazer a discriminação baseada nas mudanças dentro do amplicon como resultado da conversão do bissulfito.

Sequenciamento diretoEditar

O primeiro método relatado de análise de metilação usando DNA tratado com bissulfito utilizou PCR e seqüenciamento de DNA padrão de dideoxinucleotídeos para determinar diretamente os nucleotídeos resistentes à conversão do bissulfito. Os primers foram concebidos para serem específicos para cada filamento, bem como específicos para cada bissulfito (ou seja, primers contendo citosinas não-CpG de forma a não serem complementares ao ADN não tratado com bissulfito), flanqueando (mas não envolvendo) o local de metilação de interesse. Portanto, amplificará as sequências metiladas e não metiladas, em contraste com a PCR específica da metilação. Todos os locais de citosinas não metiladas são exibidos como timinas na sequência amplificada resultante da cadeia de sentido, e como adeninas na cadeia de anti-senso amplificada. Ao incorporar adaptadores sequenciais de alta produção nos iniciadores de PCR, os produtos PCR podem ser sequenciados com sequenciação maciçamente paralela. Alternativamente, e de forma intensiva, os produtos PCR podem ser clonados e sequenciados. Métodos de PCR aninhados podem ser utilizados para melhorar o produto para sequenciamento.

Todas as técnicas subsequentes de análise de metilação de DNA utilizando DNA tratado com bissulfito são baseadas neste relatório de Frommer et al. (Figura 2). Embora a maioria das outras modalidades não sejam verdadeiras técnicas baseadas em sequenciação, o termo “sequenciação com bissulfito” é frequentemente usado para descrever as técnicas de análise de metilação de ADN por metilação de bissulfito em geral.

PyrosequencingEdit

Pyrosequencing também tem sido usado para analisar ADN tratado com bissulfito sem usar PCR específica de metilação. Após a amplificação PCR da região de interesse, é usada a sequência em pirosequência para determinar a sequência convertida em bissulfito de locais específicos de CpG na região. A proporção de C para T em locais individuais pode ser determinada quantitativamente com base na quantidade de incorporação de C e T durante a extensão da sequência. A principal limitação deste método é o custo da tecnologia. Entretanto, o Pyrosequencing permite a extensão para métodos de triagem de alto rendimento.

Um aperfeiçoamento adicional a esta técnica foi recentemente descrito por Wong et al., que usa primers específicos de alelos que incorporam polimorfismos de nucleotídeos únicos na seqüência do primer de seqüenciamento, permitindo assim uma análise separada dos alelos maternos e paternos. Esta técnica é de particular utilidade para a análise de impressão genómica.

Análise de conformação de uma única corda sensível à metilação (MS-SSCA)Edit

Este método é baseado no método de análise de polimorfismo de conformação de uma única corda (SSCA) desenvolvido para a análise de polimorfismo de um único nucleótido (SNP). A SSCA diferencia fragmentos de DNA de cadeia única de tamanho idêntico, mas sequência distinta baseada na migração diferencial em eletroforese não-desenatural. Em MS-SSCA, isto é usado para distinguir entre regiões tratadas com bissulfito, amplificadas por PCR, contendo os locais de interesse para CpG. Embora o SSCA não tenha sensibilidade quando apenas uma única diferença de nucleotídeos está presente, o tratamento com bissulfito freqüentemente faz uma série de conversões de C para T na maioria das regiões de interesse, e a sensibilidade resultante aproxima-se de 100%. A MS-SSCA também fornece análise semi-quantitativa do grau de metilação do DNA com base na relação de intensidades de banda. Contudo, este método foi concebido para avaliar todos os locais de CpG como um todo na região de interesse em vez de locais individuais de metilação.

Análise de fusão de alta resolução (HRM)Editar

Um outro método para diferenciar o ADN convertido do ADN não convertido tratado com bissulfito está a utilizar a análise de fusão de alta resolução (HRM), uma técnica quantitativa baseada em PCR inicialmente concebida para distinguir os SNPs. Os amplicons PCR são analisados diretamente por rampa de temperatura e pela liberação resultante de um corante fluorescente intercalado durante a fusão. O grau de metilação, representado pelo conteúdo de C-to-T no amplicon, determina a rapidez da fusão e conseqüente liberação do corante. Este método permite a quantificação directa num ensaio de tubo único, mas avalia a metilação na região amplificada como um todo e não em locais específicos de CpG.

Extensão de primer de nucleótido único sensível à metilação (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE utiliza o método de extensão de primer inicialmente concebido para analisar polimorfismos de nucleótidos únicos. O DNA é convertido em bissulfito, e os primers específicos para bissulfito são recozidos para a seqüência até o par de base imediatamente antes do CpG de interesse. O primer é permitido estender um par de bases para o C (ou T) usando dideoxinucleotídeos terminais de DNA polimerase, e a razão de C para T é determinada quantitativamente.

A número de métodos pode ser usado para determinar esta razão C:T. No início, o MS-SnuPE se baseou em ddNTPs radioativos como o repórter da extensão do primer. Métodos baseados em fluorescência ou Pyrosequencing também podem ser usados. No entanto, a análise por espectrometria de massa com laser de dessorção assistida por matriz/tempo de vôo (MALDI-TOF) para diferenciar entre os dois produtos de extensão de primer polimórfico pode ser usada, em essência, com base no ensaio GOOD projetado para genotipagem do SNP. A cromatografia líquida de alta performance (IP-RP-HPLC) também tem sido usada para distinguir produtos de extensão de primer.

Clivagem de base específica/MALDI-TOFEdit

Um método recentemente descrito por Ehrich et al. aproveita ainda mais as conversões de bissulfito ao adicionar uma etapa de clivagem de base específica para melhorar as informações obtidas a partir das alterações dos nucleotídeos. Usando primeiro a transcrição in vitro da região de interesse no RNA (adicionando um sítio promotor de polimerase do RNA ao iniciador da PCR na amplificação inicial), o RNase A pode ser usado para clivar a transcrição do RNA em sítios específicos da base. Como a RNase A clivagem do RNA especificamente em ribonucleotídeos citosina e uracil, a especificidade da base é obtida pela adição de dTTP resistente à clivagem quando a clivagem específica da citosina (C) é desejada, e incorporação de dCTP quando a clivagem específica do uracil (U) é desejada. Os fragmentos clivados podem então ser analisados por MALDI-TOF. O tratamento com bissulfito resulta na introdução/remoção dos sítios de clivagem por conversões C para U ou no deslocamento da massa do fragmento por conversões G para A no cordão inverso amplificado. A clivagem específica C cortará especificamente em todos os locais de CpG metilados. Ao analisar os tamanhos dos fragmentos resultantes, é possível determinar o padrão específico de metilação do DNA dos locais de CpG dentro da região, ao invés de determinar a extensão da metilação da região como um todo. Este método demonstrou eficácia na triagem de alto rendimento, permitindo a interrogação de numerosos sítios de CpG em múltiplos tecidos de forma econômica.

PCR específica de metilação (MSP)Editar

Figura 4: A PCR específica de metilação é um método sensível para amplificar e detectar uma região metilada de interesse usando primers específicos metilados em DNA genômico convertido em bissulfito. Tais primers recoagem apenas a sequências que são metiladas, e assim contendo 5-metilcitosinas que são resistentes à conversão por bissulfito. Em alternativa, podem ser usados iniciadores específicos não metilados.

Este método alternativo de análise de metilação também usa DNA tratado com bissulfito mas evita a necessidade de sequenciar a área de interesse. Em vez disso, os pares de primers são concebidos para serem “específicos da metilação”, incluindo sequências que complementam apenas 5-metil-citosinas não convertidas, ou, no conversor, “específicos da metilação”, complementando as timinas convertidas a partir de citosinas não metiladas. A metilação é determinada pela capacidade do iniciador específico de alcançar a amplificação. Este método é particularmente útil para interrogar as ilhas CpG com uma densidade de metilação possivelmente elevada, uma vez que o aumento do número de pares CpG no primário aumenta a especificidade do ensaio. A colocação do par CpG na extremidade de 3′- fim do primer também melhora a sensibilidade. O relatório inicial usando MSP descreveu sensibilidade suficiente para detectar a metilação de 0,1% dos alelos. Em geral, a MSP e os seus protocolos relacionados são considerados como os mais sensíveis quando se interroga o estado de metilação num locus específico.

O método MethyLight é baseado na MSP, mas fornece uma análise quantitativa usando PCR quantitativa. São usados primers específicos de metilação, e também é usada uma sonda de fluorescência específica de metilação que repõe a região amplificada. De forma alternativa, os primers ou sonda podem ser concebidos sem especificidade de metilação se for necessária a discriminação entre os pares CpG dentro das sequências envolvidas. A quantificação é feita em referência a um DNA de referência metilado. Uma modificação a este protocolo para aumentar a especificidade da PCR para ADN convertido com sucesso em bissulfito (ConLight-MSP) usa uma sonda adicional para ADN não convertido em bissulfito para quantificar esta amplificação não específica.

Outra metodologia usando MSP-amplified DNA analisa os produtos usando a análise da curva de fusão (Mc-MSP). Este método amplifica o DNA bissulfito-convertido com primers específicos metilados e não metilados, e determina a relação quantitativa dos dois produtos comparando os picos diferenciais gerados em uma análise de curva de fusão. Um método de análise de fusão de alta resolução que utiliza tanto a PCR quantitativa como a análise de fusão foi introduzido, em particular, para a detecção sensível da metilação de baixo nível

Métodos baseados em microarranjosEditar

Métodos baseados em microarranjos são uma extensão lógica das tecnologias disponíveis para analisar o ADN tratado com bissulfito para permitir a análise da metilação em todo o genoma. Os microarrays de oligonucleotídeos são projetados usando pares de sondas de hibridização de oligonucleotídeos visando locais de interesse para CpG. Uma é complementar à sequência de metilação inalterada, e a outra é complementar à sequência de C para U não convertida e não metilada. As sondas também são específicas para bissulfito para evitar a ligação ao DNA incompletamente convertido pelo bissulfito. O Ensaio de Metilação Illumina é um desses ensaios que aplica a tecnologia de sequenciamento de bissulfito a um nível de microarranjo para gerar dados de metilação em todo o genoma.