Sistemas celulares para invaginação epitelial

Invenção epitelial como mecanismo multicelular

No desenvolvimento animal desde os primeiros estágios blastocísticos ou blastodérmicos até os últimos estágios da organogênese, os embriões se organizam em camadas epiteliais. O epitélio é amplamente definido. Pode ser uma folha de células cubóides, colunares ou escamosas (achatadas), ou conter uma mistura de formas celulares de altura variável para dar a aparência de camadas múltiplas (pseudostratificação), ou mesmo consistir de qualquer uma das anteriores em camadas múltiplas e ser verdadeiramente estratificada. No entanto, para todos os estágios e todos os tipos epiteliais, a elaboração da anatomia se baseia na capacidade de auto-flexão dos epitélios em dobras, cristas, fossos e tubos. Como bloco de construção da morfogênese, a dobra epitelial faz quase todos os órgãos, desde o primitivo tubo intestinal que faz o eixo primário do corpo durante a gastrulação até os poros mais finos que são os folículos pilosos na pele. A dobra epitelial é, evidentemente, um processo multicelular no qual múltiplas células conectadas coordenam seus comportamentos para mudar a forma do tecido. Por outras palavras, a flexão epitelial é uma propriedade emergente de um sistema de células cujas acções não podem ser descritas a níveis inferiores: as redes genéticas e a clássica biologia celular (em grande parte subcelular) não podem capturar completamente o processo de flexão epitelial. Notavelmente, apesar de ser um processo muito difundido, nossas descrições detalhadas e nossa compreensão mecanicista da dobra epitelial estão limitadas a poucos casos e tipos.

Espectos da dobra epitelial que levam à invaginação (dobra para dentro) e à evaginação (dobra para fora) foram revistas anteriormente . Esta revisão foca a flexão que resulta na invaginação do epitélio, do ponto de vista dos comportamentos celulares. Iniciamos nosso resumo a partir da constrição apical bastante bem descrita, através da encurvadura apical por cabo, encurtamento celular por outros mecanismos e cunhagem basal, até o cunhamento apical/basal e a telescopagem vertical até a relativamente nova e pouco caracterizada intercalação suprabasal. Esta ordem reflete a hierarquia da complexidade epitelial de uma monocamada a pseudoestratificada, e finalmente estratificada estrutura. Ela também reflete uma hierarquia de complexidade nos processos celulares envolvidos.

A constrição apical

A constrição apical é definida como um mecanismo no qual as células epiteliais sofrem retração apical enquanto mantêm um volume mais ou menos constante. Várias boas revisões foram publicadas recentemente sobre a constrição apical e o leitor é direcionado para aquelas para uma análise abrangente. Aqui vamos delinear algumas características salientes.

Modelos físicos bidimensionais feitos com hastes de aço e tubos de borracha demonstraram que a tensão diferencial entre a superfície apical e basal das células epiteliais levaria a epitélios dobrados, desde que o volume e altura das células fossem mantidos . Além disso, observações iniciais de curvatura epitelial através de uma série de órgãos e organismos mostraram que as células no tecido de curvatura em forma de cunha têm uma camada superficial de gel no lado côncavo da curvatura. Esta camada de gel de contração foi posteriormente descoberta como sendo constituída por filamentos de actina , agindo em conjunto com a miosina II da proteína motora para dobrar o epitélio (figura 1). O enriquecimento da actomiosina apical e a contratilidade tornaram-se características definidoras da constrição apical . A regulação do citoesqueleto da actomiosina é complexa, mas entre os numerosos reguladores, o recrutamento desta maquinaria contrátil é notavelmente promovido por Rock e Shroom . Outros estudos demonstraram que enquanto o Shroom é necessário e suficiente para a distribuição apical da rede contrátil da actomiosina, outras moléculas muito frequentemente funcionam no posicionamento de componentes distintos da maquinaria no local correcto. Por exemplo, Rho GTPase e p120 catenina são necessários para localizar apicalmente a miosina II na célula. BMP, atuando a montante da rocha na invaginação do placódio otico do pinto (neuroepitelial), parece ser necessário para a localização apical da actina independentemente de um papel na especificação do tipo de célula .

A imagem viva dos tecidos invaginantes tem proporcionado uma imagem cada vez mais sofisticada de como ocorre a constrição apical. Por exemplo, durante muito tempo foi assumido que as células sofrem constrição apical por uma contração de fibras de actina em torno da circunferência da superfície apical. As imagens ao vivo na gastrulação de Drosophila revelaram que, em vez de fibras circunferenciais, uma malha apical de fibras diametrais desempenha na verdade o papel predominante na constrição da área apical (embora não haja atualmente evidências equivalentes em vertebrados). O processo de contração também é menos simples do que se pensava. Em vez de uma contracção suave e síncrona, foi recentemente demonstrado que as células individuais sofrem impulsos transitórios de constrição semelhante a ratchetes de forma assíncrona com os seus vizinhos . Após o início das contrações, o estado contraído é estabilizado entre pulsos de forma que o resultado líquido é uma diminuição na área da extremidade apical da célula . A tensão destas contrações individuais é provavelmente transmitida apicobasalmente por deslocamento citoplasmático, pelo menos como é visto na mesoderme Drosophila ; simultaneamente, a tensão é transmitida no plano do tecido através da rede de actomiosina, que é montada em células individuais e conectada intercelularmente por junções aderentes , para dobrar todo o tecido.

Relaxamento basal

Para conservar o volume celular, a constrição apical deve ser acompanhada de expansão basal ou aumento da altura (ou ambos). O aumento da altura tem sido observado nos placódios traqueais e salivares antes da invaginação em embriões de mosca, e o que aqui chamamos de ‘relaxamento basal’, no qual a actina basal ou rede de miosina é activamente desmontada (figura 2), tem sido relatado como estando envolvido na invaginação do placódio otico do pinto e na formação do sulco ventral de Drosophila na gastrulação. Na vesícula otica do pintinho, o relaxamento basal precede a constrição apical e depende dos sinais FGF apresentados basicamente, e assim não parece estar necessariamente acoplado a eventos apicais, incluindo a constrição subsequente. Na gastrulação de Drosophila, entretanto, a redução da intensidade da miosina basal e, por sua vez, a rigidez basal acompanha a constrição apical e expande a superfície basal, uma fase que muito provavelmente inicia a transição da colonização celular para o encurtamento e invaginação celular. Um trabalho recente de Lomakin et al. sugeriu que o acúmulo de actomiosina em uma parte de uma célula durante a migração causa esgotamento em outra. Isto poderia ser uma forma de relaxamento basal que poderia desencadear ou ser necessário para posterior constrição apical durante a invaginação. Uma modelagem computadorizada não publicada da dobra epitelial no epitélio do disco ala sugeriu que o relaxamento basal nesse contexto pode de facto ser mecanicamente mais importante que a constrição apical (Guillaume Salbreux 2016, comunicação pessoal).

Fivela a cabo metálico

Em vários contextos, a contratilidade de múltiplas células é coordenada através de ‘cabos’ de actomiosina. Os cabos de actomiosina são estruturas supracelulares contidas dentro de células individuais que se alinham entre células adjacentes e são provavelmente ligadas através de junções específicas, embora a forma como estão ligados a nível molecular ainda seja desconhecida. Estas estruturas supracelulares têm sido observadas não apenas durante a invaginação, mas também em outros processos, para coordenar a contração.

Um exemplo de invaginação por cabos de actomiosina é o fechamento do tubo neural de galinha, no qual os cabos de miosina orientados mediolateralmente correm vários comprimentos celulares, promovendo a intercalação celular mediolateralmente tanto para alongar o tubo neural (extensão convergente) como para dobrar o neuroepitelium mediolateralmente . Esta contração planar-polarizada dos cabos de actomiosina é promovida pela sinalização de PCP a montante e também pela distribuição polarizada de Celsr1 e ROCK .

O epitélio na Drosophila em desenvolvimento utiliza a constrição associada ao rearranjo celular e ao arredondamento celular para conseguir a invaginação de múltiplos poços traqueais, que mais tarde formarão a rede traqueal através da qual o oxigénio se difunde em direcção aos tecidos da mosca . Antes do início da invaginação, as células do placódio entram em quiescência mitótica . Curtos arcos circunferencialmente alinhados de cabos de actomiosina se formam transientemente à medida que grupos de algumas células se intercalam (também circunferencialmente) ao redor do buraco formador . A isto se segue uma forte constrição apical das células no centro do placódio e apices menos apertados nas células imediatamente adjacentes, formando um fosso traqueal raso . As células invasoras no centro sofrem um arredondamento mitótico das células que acelera o processo ao causar uma queda rápida na altura da célula, terminando a invaginação numa fase rápida. Foi demonstrado que é o arredondamento das células mitóticas mas não a divisão celular que conduz à fase rápida da invaginação. Pode-se especular que as células arredondadas tornam o epitélio estruturalmente mais fraco. Elas têm um citoesqueleto cortical menos rígido, uma forma menos colunar (desbaste do epitélio) e possivelmente fixações mais fracas aos seus vizinhos. Podem, portanto, funcionar como pontos de dobra em que o epitélio se dobra com menor resistência à tensão mantida pelos cabos circunferenciais nas células não divisórias circundantes (figura 3).

Encurtamento de células

Dobrar o epitélio da perna de Drosophila para fazer articulações entre segmentos representa outra variação da constrição celular, que neste caso é a retracção de células inteiras associada à apoptose. Durante a morfogênese do epitélio da perna de Drosophila, a apoptose é necessária, mas não suficiente, para que a constrição apical ocorra , e um relatório relativamente recente descreve um ‘cabo’ de actomiosina apicobasal que corre verticalmente através do centro da célula no placódio dobrável (figura 4) que aparece como se pudesse exercer uma força de tração vertical para baixo na superfície apical das células vizinhas . Estes ‘cabos’ verticais não devem ser confundidos com os arcos planares dos cabos de actomiosina referidos no §4 e são inteiramente novas estruturas unicelulares cuja estrutura e dinâmica ainda não foram investigadas. Tal como acontece com as células mitoticamente arredondadas, uma célula apoptótica seria presumivelmente mais fraca estruturalmente do que os seus vizinhos não apoptóticos e, portanto, poderia servir como um ponto de encurvadura; no entanto, o “cabo” apicobasal sugere um mecanismo mais ativo, assim como o fato de que a célula apoptótica não é extrudada. Parece provável que o cabo de actomiosina tenha um papel ativo na encurvadura causada pela apoptose.

Cell shortening também tem sido observado em outros casos de invaginação epitelial. Na gastrulação ascidiana, Sherrard et al. mostraram que a constrição apical das células endodérmicas na verdade não impulsiona o processo de invaginação; ao contrário, um acúmulo basolateral de miosina leva ao encurtamento apicobasal das células e inicia a invaginação. Em mais um mecanismo, as dobras dorsais no embrião Drosophila no início da gastrulação são iniciadas por um deslocamento basal das junções aderentes das células invasoras, levando a um desajuste no posicionamento da junção com as células vizinhas que ajuda a impulsionar o encurvamento do tecido. Embora tenha sido demonstrado que as posições das junções aderentes são reguladas pelas proteínas de polaridade Par1 e Bazooka, o mecanismo físico permanece por investigar.

Cunha basal

Células em forma de borda num tecido invasor são uma consequência inevitável da geometria do tecido e não indicam necessariamente constrição apical. Durante o desenvolvimento do tubo neural, um processo chamado de cunha basal entra em jogo, no qual ocorre o cunhamento que é bastante distinto da constrição apical. Na linha média de grande parte do tubo neural amniote formador, o epitélio se dobra bruscamente para formar o que é conhecido como ponto médio da dobradiça (PPM). As células nestas posições de dobradiça são quase todas em forma de cunha, enquanto que as suas vizinhas são uma mistura de formas, na sua maioria em forma de fuso, reflectindo a natureza pseudoestratificada deste epitélio (figura 5). É importante notar que as células estão muito apertadas no plano do epitélio, e são tão estreitas que cada célula se projeta ao redor do seu núcleo. A forma de cunha das células em forma de dobradiça é, pelo menos substancialmente, o resultado de núcleos localizados basicamente. Isto parece estar relacionado à migração nuclear intercinética, que é o movimento apicobasal do núcleo à medida que o ciclo celular progride: as células dividem-se apicalmente e quando na fase S o núcleo reside basicamente e, consistente com isto, as células na dobradiça passam mais tempo na fase S. O ciclo de divisão celular tem sido implicado de forma semelhante na morfogênese de flexão do copo óptico . No entanto, se o controle do ciclo celular é o condutor único ou necessário da posição nuclear apicobasal permanece uma questão em aberto. Importante, a cunha basal foi experimentalmente distinguida da constrição apical pela descoberta de que a inibição da polimerização da actina, ao mesmo tempo em que fez com que a maior parte do tubo neural se abrisse e as superfícies apicais se expandissem por toda a placa neural , não conseguiu abolir a flexão no ponto médio da dobradiça . Isto também mostra que a flexão da dobradiça mediana é intrínseca, já que o relaxamento do epitélio de flanco desacopla a dobradiça mediana das forças extrínsecas e que o encunhamento basal ocorre de forma diferente da constrição apical.

Telescopagem vertical e aglomeração apical/basal

Intrigualmente, em certas regiões anteroposteriores do tubo neural existem também pontos de dobradiça dorsolaterais que não envolvem nem a cunha basal nem a constrição apical (citochalasin-sensitive). Embora a força de empuxo extrínseca do ectoderme de flanco tenha sido sugerida como um mecanismo de flexão, evidências mais recentes têm argumentado contra isso e sugerido que o empacotamento celular diferencial gerado pela proliferação e translocação celular no tubo neural do rato leva à dobra da estrutura .

Relacionado a isso, em 1986 Jacobson, Oster et al. descreveram nas rãs Xenopus um comportamento celular para a elevação da prega neural (o início lateral da neurulação) que eles chamaram de ‘tratorização’. O termo ‘tratoring’ foi captado e usado novamente no contexto de flexão epitelial na gastrulação do ouriço-do-mar em mais dois trabalhos. Vale a pena considerar em detalhes o que esses três documentos abordam (ver próximo parágrafo). Infelizmente, o termo “tratores” também foi usado no mesmo artigo de 1986 para descrever não só os comportamentos celulares como tal, mas também um mecanismo subcelular especulativo que os poderia impulsionar. Neste uso especulativo do termo ‘tratores’, o córtex celular flui como uma lagarta ao redor da célula para movê-la em relação aos seus vizinhos . É difícil imaginar um trator cortical em epitélios com junções estreitas, o que impediria o movimento cortical, e a idéia nunca foi seguida (embora epitélios embrionários, especialmente em embriões de mamíferos, muitas vezes careçam de junções estreitas e podem ter uma aderência mais labial). Um artigo recente reavivou a ideia de um tractor cortical para células isoladas que migram em espaços confinados. Para evitar confusão, vamos abandonar completamente o termo ‘tratorização’ (exceto entre aspas, onde esses autores o utilizaram). Em vez disso, oferecemos dois novos termos – pois de fato há dois comportamentos celulares envolvidos – o telescópico vertical e o basal (ou apical) bunching.

Um efeito descrito por Jacobsen et al. como ocorrendo durante a flexão da placa neural foi que as células deslizam verticalmente umas sobre as outras, da mesma forma que os passos de uma escada rolante ascendente, para criar uma inclinação ou dobra. Outra forma útil de descrever isto é que o epitélio se estende para baixo por deslocamento vertical, efetivamente cisalhando, entre suas células organizadas ao redor do centro da invaginação, muito na forma que um telescópio se estende pelo deslizamento de suas seções (figura 6a). Sugerimos a ‘telescopagem vertical’ como termo para este processo de captar a ideia não só de ‘cisalhamento’ vertical, mas também a sua disposição concêntrica. O cisalhamento real entre células é improvável: o movimento vertical das células é muito mais parecido com a migração celular clássica, na qual as células se arrastam ou rolam sobre pontos de adesão fixos, sendo o movimento realizado pela extensão de saliências basais ou apicais (figura 6b,c). Temos algumas evidências preliminares de telescopagem vertical que ocorrem na morfogênese dos dentes e invaginação da glândula salivar (E. Panousopoulou, J.Li e J.B.A. Green 2016, dados não publicados). As observações no tubo neural lateral do mouse mencionadas acima são consistentes com esse tipo de mecanismo, mas o movimento vertical tipo cisalhamento permanece a ser observado diretamente.

Um mecanismo diferente que tem sido descrito pelo termo ‘tratoring’ está na gastrulação do ouriço-do-mar e consiste em protusões apicais de células ‘arrastando-se’ centricamente, forçando as células em orientações de limpeza centrípeta e conseqüentemente dobrando o epitélio (figura 6d) . Este processo é mais explicitamente modelado como extensões de células apicais contráteis em um segundo trabalho que usa o termo ‘tratoring’ , e nós aqui renomeamos este processo como ‘apical bunching’ (figura 6d), com a palavra ‘bunching’ transmitindo a idéia de juntar (de apices de células) apertando de fora (pelas protuberâncias apicais de células vizinhas estendidas lateralmente). O bunching apical difere do bunching telescópico vertical na medida em que o bunching impulsiona a mudança de forma sem deslocamento vertical, enquanto que o bunching telescópico vertical é definido, inversamente, como cisalhamento vertical sem mudança de forma. No entanto, estas definições são teóricas: na prática, o cisalhamento lateral das saliências apicais pode simultaneamente deformar e deprimir as células vizinhas (figura 6d). O cisalhamento apical também difere da constrição apical porque no cisalhamento, a força é extrínseca à célula deformada, enquanto que na constrição é intrínseca.

Jacobson et al. também sugeriram protusões basais de células na placa neural avançando lateralmente ao longo da lâmina basal, alcançando por baixo das células vizinhas. Um efeito disso parece ser a compressão lateral dessas células em suas bases, levando a dobra neural a evaginar (criando uma dobra côncava em forma de invaginação na parte adjacente da placa neural passivamente). Isto poderia ser descrito como ‘basal bunching’ em oposição ao bunching apical, mas ainda não há observações claras ao vivo deste fenómeno experimentalmente para confirmar a sua existência.

Intervalação basal: dobrando um epitélio de várias camadas

A maior parte dos mecanismos acima diz respeito a monocamadas ou epitélio pseudoestratificado; portanto, um mistério restante é como um epitélio estratificado, que muitas vezes aparece na organogênese inicial, como no placódio dentário, folículo piloso e glândula mamária, se dobra em um primórdio de um botão ou órgão em forma de tubo. Um estudo recente mostrou que, nestes epitélios dobrados, a actina e a miosina fosforilada não se enriquecem apicalmente nas células da camada basal em forma de cunha, e os núcleos não estão predominantemente localizados na base. Portanto, nem a constrição apical nem o cunhamento basal parecem estar envolvidos neste processo.

Teóricamente, a proliferação localmente elevada, e mais especificamente a estratificação, das células acima da camada basal tem sido proposta para ser suficiente para impulsionar o ‘crescimento para baixo’ de um epitélio (figura 7); de fato, o exame da orientação do fuso no dente molar, um dos maiores placódios de órgãos epiteliais, mostrou que a divisão celular no placódio ocorre perpendicularmente ao plano do tecido, criando as células suprabasais (figura 7b) . Entretanto, a priori, seria de se esperar que a estratificação engrossasse um epitélio tanto para cima quanto para baixo, ou mesmo apenas para cima se o tecido subjacente (mesenquimal) fosse rígido. Além disso, experimentalmente, também foi descoberto no mesmo trabalho que a estratificação por si só não é suficiente para conduzir à invaginação e a inibição da proliferação não inibe a invaginação. Em outras palavras, “crescimento para baixo” é uma descrição inadequada para a invaginação precoce do placódio. Em vez disso, verificou-se que as células suprabasais geram a tensão essencial de flexão, como revelado pela observação de actina elevada e fosfomiosina, movimentos de intercalação celular e recuo no corte físico . A tensão planar criada nas camadas suprabasais pela intercalação das células planas mostrou-se transmitida à lâmina basal por células da camada basal que são ancoradas basalmente mas simultaneamente se estendem protusões apicais orientadas centralmente que participam da intercalação (figura 7c) . A camada basal resiste à compressão lateral e por isso deve dobrar-se em resposta à contração supra basal. Topologicamente, as células suprabasais nos placódios ectodérmicos assumem o papel de cabos de actomiosina apicais, mas numa escala muito maior.

Conclusão

Como especificado em §1, tentamos aqui fornecer um breve e atualizado resumo dos principais mecanismos que se pensa estarem envolvidos na invaginação epitelial. Vale a pena mencionar que os diferentes mecanismos aqui discutidos não são necessariamente mutuamente exclusivos. Por exemplo, a proliferação é uma condição necessária para a intercalação supra-básica no epitélio estratificado, o relaxamento basal normalmente precede a constrição apical, e o amontoado apical ou basal pode agir em conjunto com a constrição apical ou o acunhamento basal. A hierarquia dos mecanismos discutidos também representa as limitações do nosso conhecimento. A constrição apical é, talvez, assumida como comum principalmente com base na sua obviedade no desenvolvimento precoce de organismos laboratoriais modelo. Os outros mecanismos são progressivamente menos apreciados, mas merecem ser considerados em pé de igualdade, pois poderiam ser mais comuns e importantes no desenvolvimento posterior e entre diversas espécies do que até então apreciados. A invaginação é apenas um tipo de dobramento epitelial. Omitimos, por razões de espaço, a discussão sobre o processo morfogenético mais obviamente relacionado, nomeadamente a evaginação, por exemplo, por constrição basal, levando a uma dobra de tecido para fora. Também limitamos esta revisão, focalizando a flexão que é impulsionada por forças intrínsecas. Por ‘intrínsecas’ entendemos as forças geradas dentro do próprio epitélio (embora não necessariamente apenas no ponto de flexão, como exemplificado pela flexão por cabo). Além das forças intrínsecas, a flexão de tubos como o intestino ou o coração pode ser impulsionada por forças extrínsecas ao epitélio, tais como forças resistivas geradas no tecido inelástico anexo ou enclausurado à medida que o próprio epitélio cresce .

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Cuidado do que focar, por exemplo, em aspectos biomecânicos de curvatura epitelial ou rever exaustivamente a morfogênese epitelial como um todo , fornecemos um esboço de uma variedade de sistemas celulares que por comportamentos de conjunto coordenado geram a anatomia necessária. Para alguns deles, há uma certa compreensão dos mecanismos moleculares, mas para a maioria, a conexão entre os processos moleculares subcelulares e os resultados em nível de tecido supracelular permanece crua. Entretanto, o que é claro é que é esclarecedor considerar o mecanismo em uma escala supracelular ou multicelular. Ao considerar as invasões epiteliais desta forma como sistemas de células, a deslumbrante variedade de eventos de desenvolvimento pode ser redutível a um pequeno número de motivos traçáveis. Identificar e caracterizar estes motivos (mesmo com variações) torna-se assim uma agenda viável tanto para o progresso experimental como teórico.

Contribuições dos autores

Todos os autores contribuíram para a concepção, elaboração, figuras e edição do manuscrito.

Interesses concorrentes

Não temos interesses concorrentes.

Funding

Este trabalho foi financiado pela subvenção da BBSRC no. BB/L002965/1 a J.B.A.G.

Pés

Uma contribuição de 13 para um tema ‘Systems morphodynamics: understanding the development of tissue hardware’.