Top Five Methods for Primary Antibody Labeling

Em qualquer aplicação que use anticorpos para detecção de sinais (por exemplo, Western blotting, ELISA, imunohistochemistry, ou FACS), há duas abordagens para a rotulagem de anticorpos: rotulagem direta e indireta. A Western blotting padrão usa rotulagem indireta porque você usa um anticorpo primário para detectar o antígeno alvo, seguido por um anticorpo secundário ao qual uma molécula de detecção está presa.

Em algumas situações, pode ser melhor pular o anticorpo secundário e todos os passos associados e rotular diretamente seu anticorpo primário. Os casos que gritam por etiquetagem direta de anticorpos primários incluem:

• Não há ligação específica de anticorpos secundários
• Você está usando anticorpos nãoanticorpos primários do organismo padrão – neste caso pode ser difícil encontrar bons anticorpos secundários
• Quando se multiplica com anticorpos originários da mesma espécie
• Quando é necessário encurtar o tempo experimental eliminando a incubação de anticorpos secundários e os passos de lavagem associados

Parâmetros de anticorpos

Pode rotular o anticorpo escolhido não só com corantes fluorescentes mas também com proteínas fluorescentes, enzimas, e partículas coloridas. Todas elas são normalmente fixadas através de um grupo terminal de lisina, portanto você precisa evitar buffers contendo aminas (por exemplo, Tris) e moléculas em todas as etapas. Caso contrário, você rotulará suas moléculas tampão na maioria das vezes! Você também deve evitar o conservante tampão comum de azida sódica, pois ele irá interferir com a reação de rotulagem.

O anticorpo para rotulagem deve estar em uma concentração não inferior a 0,5 mg/ml e >90% de pureza. Quanto menos proteínas interferentes e amino-grupo contendo moléculas você tiver na sua preparação de anticorpos, mais eficiente será a reação de etiquetagem. Mas mesmo que o seu anticorpo esteja nadando em glicina e BSA, você pode sempre remover as substâncias interferentes por diálise. Você também pode melhorar a pureza do seu anticorpo passando-o por uma coluna de proteína A ou pode até mesmo preparar sua própria coluna de purificação de afinidade com um antígeno adequado.

Métodos de Rotulagem de Anticorpos Internos Principais

NHS (Succinimidyl) Método do Éster

Este método é útil para a conjugação de anticorpos com corantes fluorescentes amplamente disponíveis, tais como derivados de rodamina. É tipicamente realizado em um tampão fosfato com subsequente separação na coluna do corante não rotulado. A principal desvantagem é que os ésteres são instáveis porque são sensíveis à umidade. O anticorpo rotulado deve ser usado imediatamente após o fim da reação.

Iotiocianato Método

Você pode usar este método para fazer isotiocianato de fluoresceína (FITC), que é muito popular na preparação de proteínas fluorescentes e anticorpos. Se você já trabalhou com microscopia fluorescente, você já lidou com FITC. Análogos de isotiocianato de diferentes corantes padrão também estão disponíveis.

Isotiocianato é mais estável que o NHS, mas é mais difícil de fazer e sua reação de rotulagem provavelmente será menos eficiente com este método. Como no NHS, o excesso de corante deve ser removido após a reação por cromatografia.

Método carbodiimida

Compostos derivados de carbodiimida convertem grupos carboxílicos em proteínas em intermediários reativos que podem reagir com lisinas. A alta reatividade dos carbodiimidas significa que eles podem ser usados para rotular anticorpos com materiais relativamente inertes, como partículas magnéticas ou de ouro. A carbodiimida mais comumente usada é a EDC. O NHS às vezes é adicionado à reação para ajudar na formação de intermediários relativamente estáveis.

O método é simples, mas similar ao NHS, o EDS é higroscópico, então você precisará usar seu anticorpo imediatamente após a rotulagem.

Two-Tag Method

Aqui, você rotula seu anticorpo com outra proteína que serve como catalisador, por exemplo, HRP ou fosfatase alcalina. Como ambas as moléculas contêm numerosos grupos amino, a ligação cruzada direta (como com o método NHS) levaria a polímeros da mesma molécula. Portanto, você realizaria a ligação em duas etapas separadas. Você faz a ligação cruzada do anticorpo à molécula X e do catalisador à molécula Y. Você precisa escolher X e Y cuidadosamente porque eles devem interagir para formar o conjugado. Por exemplo, você poderia escolher maleimida como X e um tiol como Y.

Embora o conjugado resultante seja mais estável do que o que você obtém com o método do NHS, este método exigirá três vezes mais trabalho; etapas separadas de etiquetagem e purificação para o anticorpo, catalisador, e a reação conjugada. A boa notícia é que você pode comprar uma molécula catalítica pré-rotulada e depois rotular seu anticorpo de acordo.

Periodate Method

Este método é útil para a geração de conjugados de anticorpos HRP específicos. Periodate ativa o HRP criando moléculas de aldeído que interagem com os resíduos de lisina. O HRP em si tem apenas alguns resíduos de lisina, portanto a polimerização enzimática não é uma preocupação significativa. As ligações entre o HRP e o anticorpo são reversíveis a menos que sejam estabilizadas pela adição de cianidrido de sódio.

Foi o meu método de etiquetagem de anticorpos caseiros de topo. Existem muitos kits comerciais no mercado com química subjacente semelhante que podem tornar a sua vida muito mais fácil. Se o seu laboratório tem o dinheiro.

Você tem outro método de etiquetagem de anticorpos que gostaria de compartilhar conosco? Entre em contato escrevendo na seção de comentários.

Literatura:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Clique em Chemistry and Radiochemistry: Os Primeiros 10 Anos. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.