Uma estrutura complexa de arrestin-2 ligada a um receptor acoplado à proteína G

Caracterização funcional e determinação da estrutura do complexo Arr2-NTSR1

Interações de arrestin-2 ligada a um receptor acoplado à proteína GPCR não-visual é relativamente fraca e altamente dinâmica, mas obter um complexo estável é um passo essencial para estudos estruturais. Portanto, antes de nossos estudos estruturais, caracterizamos a interação da NTSR1 com as arrestinas utilizando o sistema comercial NanoBiT, que é um método eficaz para detectar interações proteína-proteína.17 Verificou-se que a NTSR1 interage tanto com Arr2 quanto com Arr3, o que é potencializado pelo aumento das concentrações de peptídeo agonista, neurotensina (NTS). Os mutantes de arrestin com três resíduos hidrofóbicos terminais C mutantes para alanina (3 A mutantes; I386A, V387A e F388A em Arr2, e I387A, V388A e F389A em Arr3),18,19 que são conhecidos como formas pré-ativadas de detritos, mostraram aumento da atividade de ligação à NTSR1 (Fig. 1b),

Testamos ainda a interação arrestin-NTSR1 pelo ensaio Tango, um ensaio baseado em células que determina a atividade de ligação das proteínas da membrana a parceiros de ligação solúveis.7,20 Nossos ensaios de Tango mostraram que a atividade de ligação de NTSR1 a Arr2 foi aumentada em cerca de duas a três vezes, respectivamente, quando o agonista peptídeo NTS ou pequeno agonista molécula ML314, um conhecido modulador positivo-alésterico (PAM),21,22 foi adicionado. A atividade de ligação de Arr2 a NTSR1 foi aumentada em cerca de quatro vezes quando ambos NTS e ML314 foram utilizados. A ligação de NTSR1 a Arr2 foi ainda melhorada com a introdução de mutações 3A (Fig. 1c).

Baseado nos resultados acima, realizamos estudos estruturais utilizando o mutante 3A de Arr2 em complexo com NTSR1 na presença de NTSR e ML314, mas o complexo dissociado em grades crio-EM devido aos efeitos adversos associados à vitrificação da amostra. Para superar este problema de dissociação, fundimos o tipo selvagem humano NTSR1 com o mutante humano 3A Arr2 em seu terminal C com um ligante de três aminoácidos (GSA). O citocromo b562 domínio RIL (BRIL) também foi fundido ao N-termino do receptor para aumentar a expressão complexa. O Arr2 foi ainda estabilizado pela fusão da cadeia leve Fab30, um fragmento de anticorpo utilizado para estabilizar a forma ativa do Arr2,23 em seu terminal C com um ligador de 12 aminoácidos (GSAGSAGSAGSA). A construção do complexo de fusão foi coexpressa com a cadeia pesada Fab30 de 8 marcadores His8 e uma cinase GPCR, GRK5, que fosforilou o receptor para uma melhor ligação do arresto. A proteína complexa foi purificada usando uma coluna de níquel-afinidade na presença de 2 µM NTS e 10 µM ML314, depois concentrada e posteriormente purificada por cromatografia de filtração em gel para estudos estruturais (Fig. 1d, e, veja seção “Materiais e métodos” para detalhes).

A proteína complexa BRIL-NTSR1-Arr2-Fab30 purificada apresentou uma temperatura de fusão (Tm) relativamente alta a 58 °C determinada pelo ensaio de deslocamento de termoestabilidade24 (Fig. 1f). Ela exibiu uma distribuição uniforme quando inspecionada por coloração negativa do EM (Fig. 1g). Os dados de crio-EM de partícula única foram coletados com um microscópio FEI Titan Krios. Um número total de 17.206 micrografias foi registrado, e mais de 5 milhões de partículas complexas foram coletadas e classificadas para processamento de dados adicionais. A classificação 2D identificou múltiplas conformações de partículas complexas. Após a classificação 3D intensiva, 220.464 partículas (~4,5% do total de partículas iniciais) foram selecionadas para reconstrução da estrutura (Informação suplementar, Fig. S1). O mapa de densidade mostrou uma resolução média de 4,8 Å determinada pelo critério de correlação da casca de Fourier (FSC) de 0,143, com a estrutura central composta por Arr2 e região variável Fab (Fv) mostrando uma faixa de resolução de até 4,5 Å (Fig. 2a e Informações complementares, Figs. S1, S2). No entanto, a heterogeneidade conformacional entre NTSR1 e Arr2 ainda está presente como ilustrado na análise multicorpo (Informação suplementar, Fig. S3), apesar de uma fracção muito baixa do conjunto de dados completo ter sido utilizada na reconstrução final.

Embora a resolução seja moderada, o mapa EM permitiu a determinação clara da posição e orientação do NTSR1, Arr2 e Fab30 no conjunto complexo (Fig. 2). O modelo complexo foi construído acoplando a estrutura cristalina do complexo NTSR1-NTS (PDB: 4GRV),14 e a estrutura de Arr2 ligada com vasopressina fosforilada C-terminal peptídeo (V2Rpp) e Fab30 (PDB: 4JQI)23 no mapa de densidade, seguido de ajuste manual do modelo, refinamento do espaço real e ciclos iterativos de refinamento da Roseta e reconstrução do modelo contra o mapa EM.25 O modelo complexo final contém resíduos NTSR1 de R49 a T416, dos quais faltam ICL3 (A270 a P292) e a região de ligação entre a hélice 8 e a cauda terminal C (P384 a S404). O modelo de Arr2 inclui os resíduos T6 até M352 e o modelo de Fab30 contém um total de 409 resíduos que compreendem tanto a cadeia leve quanto a cadeia pesada da Fab. O N-terminally fused BRIL e a pequena molécula ML314 não são visíveis no mapa de densidade e, portanto, não estão incluídos no modelo complexo. As estatísticas e a geometria do modelo estrutural estão resumidas em Informações complementares, Tabela S1.

A estrutura geral do complexo Arr2-NTSR1

O complexo Arr2-NTSR1 é formado pela montagem assimétrica dos dois componentes com o eixo horizontal de Arr2 intersectando a superfície interna da membrana celular a cerca de 20°, resultando na interação dos loops hidrofóbicos da borda C (L191 e M192, e L334 até L338) do arresto com a membrana celular (Fig. 2a, b). Isso é consistente com a estrutura cristalina do complexo visual arrestin-rhodopsin, que pela primeira vez mostrou o conjunto assimétrico arrestin-GPCR e confirmou a função dos loops de C-edge hidrófobo do arrestin como uma âncora de membrana que estabiliza a ligação do arrestin ao receptor de membrana, o que foi posteriormente confirmado experimentalmente.7,26,27 A interação dos loops hidrófobos em C do complexo Arr2 com a camada de membrana celular sugere que a capacidade de ligação dos lipídios é uma propriedade geral dos membros da família Arrestin.

Apesar da semelhança na montagem assimétrica do complexo Arr2-NTSR1 com a do complexo Arr1-rhodopsin, a orientação relativa do arrestin para o receptor é dramaticamente diferente entre estes dois complexos arrestin-receptor. A sobreposição dos TMDs receptores desses dois complexos revela que a orientação de Arr2 é girada em 90° em torno do eixo transmembrana em relação à de arrestin visual (Fig. 2c). Nesta nova orientação, as posições da ICL3 e ambas TM5 e TM6 do receptor estão apontadas para o domínio N-terminal de Arr2, tornando possível que a ICL3 se pareça com a cauda C-terminal para interagir com o domínio N de Arr2 (Fig. 2b).

Para avaliar a estabilidade conformacional do conjunto complexo, realizamos seis simulações dinâmicas moleculares independentes, com dois microssegundos de comprimento, do complexo Arr2-NTSR1, sem o Fab30 estabilizador. Ao longo da simulação, a alça da borda C L334 até L338 permaneceu associada aos lipídios da membrana e a cauda C-terminal NTSR1 permaneceu em interação com o domínio N-terminal de Arr2 (Informações complementares, Figs. S4 e S5). Entretanto, a estrutura do núcleo de Arrestin pode girar em torno da estrutura crio-EM de forma limitada, e o laço estendido do dedo pode se desencaixar do núcleo NTSR1 TMD (Informações suplementares, Fig. S5). Estes dados de simulação sugerem que o laço do dedo, bem como a interface do núcleo entre Arr2 e o receptor, é altamente dinâmico e o conjunto do complexo Arr2-NTSR1 capturado pela estrutura crio-EM representa provavelmente um dos muitos estados conformacionais, o que é consistente com o facto de a heterogeneidade conformacional do conjunto complexo Arr2-NTSR1 ainda existir nas partículas da classe 3D utilizadas na reconstrução final do crio-EM (Informação suplementar, Fig. S5). S3).

A interface do núcleo Arr2-NTSR1

O complexo Arr2-NTSR1 é montado através de interações intermoleculares que consistem de duas interfaces principais separadas: uma interface do núcleo que consiste de duas manchas separadas entre os loops da crista central do arresto e o lado intracelular do receptor TMD, e uma interface da cauda entre o domínio N-terminal de Arr2 e a cauda terminal do receptor C (Fig. 2b). Um retalho da interface central entre Arr2 e NTSR1 é o laço do dedo (de E66 a L71) do arresto, que é inserido na cavidade intracelular do receptor TMD e rodeado pela ICL1, ICL2, TM5 e 6, do receptor (Fig. 3a). Nesta configuração, a superfície superior do laço do dedo forma uma interface direta com a volta entre TM7 e hélice 8 do receptor (Fig. 3a).

Para validar a interface da estrutura complexa, realizamos experimentos de reticulação de dissulfeto baseado em células. Neste conjunto de experimentos, resíduos de cisteína específicos do local foram introduzidos na interface de Arr2 e NTSR1. Ambas as proteínas com mutações de cisteína foram coexpressas em células como proteínas separadas. Os produtos de reticulação foram formados pelo tratamento de células com reagente oxidante e foram monitorados por SDS-PAGE, seguido de “western blotting” para detectar o tag Flag que foi fundido ao Términus C de Arr2. O mesmo método foi utilizado para validar a interface visual do complexo arrestin-rhodopsin.7,9 Reações de crosslinking de um total de 177 pares de resíduos foram realizadas, dentre as quais observamos fortes sinais de crosslinking entre os resíduos D67 e L68 de Arr2 na região central do laço do dedo, com os resíduos NTSR1 V367 até N370 localizados na curva entre TM7 e hélice 8 (Fig. 3b, e as posições desses resíduos de interface são apresentadas como esferas na Fig. 3a). Como comparação, o resíduo L71 na extremidade terminal C do laço do dedo mostrou nenhum sinal ou sinal muito fraco de reticulação com aqueles resíduos NTSR1 (Fig. 3a, b). Também foram encontrados vários resíduos do laço do dedo para cruzar com resíduos na ICL1 (Q98) e TM6 (R294 e A297), que são componentes da cavidade intracelular do receptor TMD (Informação suplementar, Fig. S6). Esses dados de ligação cruzada validaram o patch de interface entre o loop do dedo Arr2 e o receptor e mostraram que o loop do dedo de Arr2 serve como um componente chave da interface central desse complexo Arr2-GPCR.

As sequências de aminoácidos do loop do dedo de Arr2 são enriquecidas com resíduos ácidos, semelhantes ao do arrestin visual (Fig. 3c), que é conhecido por se ligar à cavidade TMD com carga positiva.7 Quando NTSR1 e rodopsin são sobrepostos, o laço do dedo de Arr2 ocupa o mesmo espaço que a região correspondente do arresto visual, mas não se insere tão profundamente na cavidade da DTM como o arresto visual (Fig. 3d), indicando que a associação do laço do dedo de Arr2 com a cavidade intracelular da DTM NTSR1 poderia ser mais dinâmica do que aquela entre o arresto visual e a rodopsin.

A outra mancha da interface do núcleo entre Arr2 e NTSR1 é a interação das regiões de crista de Arr2 com ICL1 e ICL2 do receptor, que é diferente da do complexo arrestin-rhodopsin visual. Em contraste com as orientações semelhantes dos loops dos dedos dos dois arrestins, a sobreposição dos dois receptores deixou as estruturas centrais dos arrestins em duas orientações que diferem por um ângulo de cerca de 90°, como mostrado na Fig. 2c. As diferentes orientações de Arr2 e estruturas do núcleo visual da parada em seus complexos GPCR resultam em diferentes modos de ligação das regiões de crista das paradas com os loops intracelulares dos receptores, particularmente ICL1 e ICL2, nestes dois complexos GPCR da parada (Fig. 2c). 2c e 4).

Comparação estrutural de NTSR1 e rodopsin revela que eles compartilham uma conformação de TMD conservada com sua ICL1 adotando um laço estendido e ICL2 formando uma hélice curta em seus respectivos complexos ligados a Arr2. A hélice ICL2 da rodopsina é inserida na fenda formada pela alça central, pela alça inferior e pela alça da lagarta do arresto visual (denominada fenda MBL).7 Entretanto, a mesma fenda MBL em Arr2 é ocupada pela ICL1 da NTSR1 (Fig. 4a) devido à diferente orientação da arresto. Correspondentemente, a ICL2 da NTSR1 é girada para longe da fenda MBL para reposicionar-se no topo do loop do lariat (Fig. 4a). Experimentos de reticulação de dissulfeto mostraram sinais de reticulação entre resíduos receptores L94 até S96 na ICL1 da NTSR1 e resíduos G286 no loop inferior de Arr2, o que é consistente com a interface da ICL1 da NTSR1 com esta região de crista de Arr2 (Fig. 4a). 4b).

ICL3 do receptor, apesar de invisível no mapa de densidade, provavelmente forma uma interface com o domínio N de β-arrestin baseado na conformação do complexo Arr2-NTSR1 (Fig. 2b). Dados de reticulação de dissulfeto mostraram que resíduos ICL3 Q275, C277, T278 e V279 de NTSR1 reticulados com resíduos T56, T58, V81 e N83 na superfície superior do domínio N de Arr2 (Fig. 4c e Informações complementares, Fig. S6). Estes resíduos ICL3 também mostraram fortes sinais de reticulação com o resíduo Arr2 K160 (Fig. 4d). Sinais adicionais de reticulação de dissulfeto foram observados entre a maioria dos resíduos de Q273 até G280 do resíduo NTSR1 ICL3 e o resíduo P14 de Arr2 (Fig. 4d). Estes dados de reticulação indicam que a ICL3 do receptor está posicionada próxima ao domínio N e pode interagir com resíduos na superfície do domínio N de Arr2 (Fig. 4e).

A interface da cauda de Arr2-NTSR1

A interface do núcleo de Arr2-NTSR1 é altamente dinâmica, a interface da cauda entre a cauda terminal NTSR1 C e o domínio N de Arr2 parece ser semelhante à do complexo arrestin-rhodopsin visual9 (Fig. 5). Observamos densidade de elétrons a um nível de contorno de 0,016 (no qual a densidade da estrutura geral complexa pode ser adequadamente mostrada) de cerca de dez resíduos de cauda terminal C do NTSR1 que se ligam na primeira cadeia de Arr2 (Fig. 5a). Entretanto, informações detalhadas sobre esta região da cauda terminal C, incluindo seus resíduos específicos, são difíceis de identificar, devido à resolução limitada do mapa de densidade. A análise da proteína de fusão NTSR1-Arr2-Fab30 por espectrometria de massa (Fig. 5b e Informações complementares, Fig. S7) revelou que sete resíduos serinosos ou troninos de S401 a T416 na cauda terminal NTSR1 C foram fosforilados, sugerindo possível envolvimento desta região na ligação à superfície com carga positiva do dominio N da prisão. Experimentos de reticulação de dissulfeto mostraram que o resíduo de Arr2 P14 na curva terminal C do primeiro fio β fortemente reticulado com resíduos receptores H406 até S410 (Fig. 5d e Informações complementares, Fig. S6), o que indicou que os resíduos receptores C-terminal até H406 são provavelmente a região que se liga ao dominio N (Fig. 5c).

Um modelo para interação Arr3-GPCR

O genoma humano contém dois subtipos de β-arrestin: Arr2 e Arr3, que compartilham mais de 53% de identidade sequencial, mas têm algumas funções sobrepostas e algumas divergentes. Como Arr3 mostrou afinidade de ligação NTSR1 semelhante à de Arr2 (Fig. 1b), quisemos testar se o modo de ligação de Arr3 a NTSR1 é conservado com o de Arr2. Nossos experimentos de reticulação de dissulfeto mostraram que os resíduos do laço do dedo de Arr3 E67 até L72 (correspondente a E66 até L71 de Arr2) se reticulam com o conjunto correspondente de resíduos (A369 e N370) na curva entre TM7 e hélice 8 de NTSR1 (Informação suplementar, Fig. S8), indicando uma interface do laço do dedo conservado com TM7 e H8 do receptor entre esses dois β-arrestins.

Além disso, os dados de reticulação de dissulfeto mostraram que o resíduo de Arr3 P15 (correspondente a P14 de Arr2) reticulado com os resíduos N405 até T407 da cauda terminal do receptor C, sugerindo uma interface semelhante entre Arr3 e NTSR1 (Informação suplementar, Fig. S8). Padrão similar de reticulação entre resíduos NTSR1 ICL3 e resíduos de domínio N de Arr3, incluindo P15 no terminal C do primeiro suporte β e K161 (correspondente a K160 de Arr2) no laço entre as cordas superiores β também foram observadas (Informações complementares, Fig. S8). Juntos, estes dados de reticulação sugerem que a montagem global de Arr3 com NTSR1 é semelhante à de Arr2 a NTSR1 nesta configuração de acoplamento do núcleo.

Um modelo para o recrutamento de Arr3 por 5-HTR1A e 5-HTR1B

Muitos GPCRs, incluindo receptores de serotonina 5-HTR1A e 5-HTR1B, bem como vários receptores de dopamina, ou não possuem ou contêm uma cauda C-terminal muito curta e propõe-se a utilização da sua ICL3 como interface alternativa para recrutar Arr3-arrestins.28 Os 5-HTR1A e 1B têm ICL3s longos com múltiplos sítios de fosforilação para potencial interação com os domínios N de carga positiva de β-arrestins. Os nossos ensaios de ligação bioquímica demonstraram que ambos os receptores ligados a Arr2 e 3 com actividade semelhante à de NTSR1 com Arr2 (Informação suplementar, Fig. S9). No entanto, quando a estrutura do complexo visual arrestin-rhodopsin foi utilizada como modelo, foi difícil modelar o modo de ligação da ICL3 fosforilada de 5-HTR1A ou 1B à fissura com carga positiva no domínio N de β-arrestins. Isso porque TM5 e 6 assim como ICL3 de rodopsina estão posicionados no local oposto à superfície com carga positiva do domínio N do arresto na estrutura do complexo arresto-rhodopsin visual.

A estrutura do complexo Arr2-NTSR1, entretanto, exibe um conjunto complexo distinto com Arr2 girado em 90° da posição do arresto visual no complexo arresto-rhodopsin (Fig. 2c). TM5 e TM6 de NTSR1 estão, portanto, posicionados acima da superfície frontal do domínio N de Arr2, permitindo que ICL3 do receptor (não visível na estrutura) alcance o domínio N de Arr2 com carga positiva (Fig. 4e). Nossos dados de reticulação de dissulfeto fornecem evidências de que o NTSR1 ICL3 pode interagir com a fenda de carga positiva do N-domínio de Arr2 e 3 (Fig. 4c-e, Informações complementares, Figs. S6 e S8). Portanto, a estrutura do complexo Arr2-NTSR1 pode servir como um modelo adequado para modelar a interface de β-arrestins com 5-HTR1A e 5-HTR1B.

Usando a estrutura de Arr2-NTSR1 como modelo, e a estrutura cristalina de 5-HTR1B com ligação à ergotamina como modelo inicial para 5-HTR1B (PDB: 4IAR),29 geramos um modelo homólogo do complexo Arr2-5-HTR1B, no qual a interface central entre Arr2 e 5-HTR1B é similar à do complexo Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, b). Em seguida, realizamos experimentos de reticulação de dissulfeto para testar o conjunto complexo de Arr2-5-HTR1B mostrado no modelo de homologia (Fig. 6c e Informações Suplementares, Fig. S10).

Observamos sinais de reticulação entre os resíduos do anel D67 L68, V70 e L71 de Arr2 e os resíduos N373, E374 e D375 na rotação entre TM7 e hélice 8 de 5-HTR1B (Fig. 6c). Resíduos D67, L68, V70, e L71 do laço do dedo reticulado com resíduos receptores R308 e K311 na superfície interna do TM6 (Informação suplementar, Fig. S10). Estes dados de reticulação suportaram um modo de ligação conservado do laço do dedo Arr2 com a cavidade intracelular do domínio 5-HTR1B TM (Fig. 6a, b). Os dados de reticulação de dissulfeto também mostraram sinais de reticulação entre os resíduos de Arr2 R285 e G286 no laço inferior do arresto com resíduo ICL1 K79 de 5-HTR1B (Fig. 6c e Informações complementares, Fig. S10). Este reticulado específico só é consistente com a orientação do arresto no modelo Arr2-NTSR1, mas não é compatível com o complexo visual arrestin-rhodopsin. Juntos esses dados de reticulação suportam uma interface central entre a região da crista de Arr2 e o lado intracelular do domínio 5-HTR1B TM, que é conservada com a do complexo Arr2-NTSR1 (Fig. 6a-c).

5-HTR1B contém múltiplos resíduos de serina e treonina na área central de sua ICL3 longa que podem ser fosforilados para ligação à superfície do domínio N de arresto carregado positivamente (Fig. 6d). Projetamos mutações do par de cisteína na interface potencial entre ICL3 do receptor e o domínio N de Arr2 e descobrimos que os resíduos de ICL3 T268, S295, L298 e E300 foram reticulados com resíduos na superfície da folha superior β, incluindo T56, V81, N83, K147 e K157 de Arr2 (Fig. 6e e Informações complementares, Fig. S10). Os resíduos S260 e T268 da ICL3 apresentaram sinais de reticulação com os resíduos K11 na primeira corda β e N15 na curva após a primeira corda β da Arr2 (Fig. 6e e Informações Suplementares, Fig. S10). O resíduo S260 está perto da extremidade terminal C do TM5, e seu crosslinking com K11 no lado de carga positiva do domínio N de Arr2 só é possível na orientação Arr2-NTSR1, mas não na orientação visual arrestin-rhodopsin porque na estrutura do complexo arrestin-rhodopsin visual, tanto o TM5 como o 6 do receptor estão posicionados na parte posterior da superfície de carga positiva do domínio N do arrestin.

Observamos também um padrão de reticulação Arr2 quase idêntico entre 5HTR1A e 5-HTR1B. Foram observados sinais de reticulação entre os resíduos do laço de dedos D67, L68, V70 e L71 de Arr2 e os resíduos N404, K405 e D406 (correspondentes a N373, E374 e D375 de 5-HTR1B) na rotação entre TM7 e hélice 8 de 5-HTR1A (Informação suplementar, Fig. S11). Os resíduos D67 e L68 do laço do dedo também foram cruzados com os resíduos receptores R339 e K342 (correspondentes a R308 e K311 de 5-HTR1B) na superfície interna da TM6 (Informação suplementar, Fig. S11). Observamos ainda o reticulado de dissulfeto entre os resíduos do laço inferior de Arr2 R285 e G286 e os resíduos de ICL1 L67 de 5-HTR1A (correspondente a K79 de 5-HTR1B) (Informação suplementar, Fig. S11). Esses dados de reticulação suportam uma interface central semelhante entre Arr2 com 5-HTR1A e 5-HTR1B, que é conservada com a do complexo Arr2-NTSR1 (Fig. 6a, c).

O ICL3 do 5-HTR1A contém mais de 100 resíduos de aminoácidos (233 a 336) com 12 resíduos de serina ou tronina que constituem seis códigos de fosforilação parcial juntamente com resíduos de ácido glutâmico ou ácido aspártico (Informações complementares, Fig. S12). Projetamos mutações do par de cisteína para mapear a interface potencial entre a ICL3 deste receptor e o N-domínio de Arr2. Os dados de ligação cruzada indicaram que os resíduos ICL3 V230, T240, P250, R261, K270 e D285 se cruzaram com V81 e K160 no domínio N do Arr2 (Informação suplementar, Fig. S11). Resíduo P14 do primeiro ramal β do Arr2 fortemente reticulado com resíduos ICL3 N300, P308, P315, P318, P321 e R323 do 5-HTR1A (Informações suplementares, Fig. S11).Estes dados cruzados, juntamente com o modelo de homologia do complexo Arr2-5-HTR1B, forneceram um quadro geral de como 5-HTR1A e 5-HTR1B recrutam Arr2.

Neste trabalho, relatamos uma estrutura de Arr2 em complexo com NTSR1, um GPCR classe A, por análise de partícula única crio-EM. Enquanto o modo de ligação da interface da cauda entre a cauda terminal C do receptor e o N-domínio do arresto positivamente carregado é conservado com o do complexo visual arrestin-rhodopsin, esta estrutura exibe uma orientação de Arr2 diferente daquela vista no complexo visual arrestin-rhodopsin. A modelagem da homologia e o mapeamento da interface de dissulfeto reticulado demonstram que esta interface central é conservada nos complexos Arr2 com subfamília 5-HTR1A e 1B. Nestes modelos complexos, a orientação do Arr2 permite que o ICL3 do receptor chegue à superfície do domínio N do Arr2, proporcionando a possibilidade de um GPCR que não possui uma cauda terminal C utilizar o seu ICL3 para interagir com o domínio N do arresto. Como Arr2 e Arr3 são parceiros proteicos ubíquamente expressos para a transdução de sinal de muitos GPCRs não visuais, nossos estudos estruturais e bioquímicos da interação de Arr2 com os membros da subfamília NTSR1 e 5-HTR1 forneceram um modelo alternativo para entender a interação de Arr2 e Arr3 com GPCRs não visuais.