Uma faixa de fluxo lateral baseada em nanopartículas de ouro para detectar 6-monocetilmorfina no fluido oral

Introdução

O abuso da epóide tem aumentado drasticamente nos últimos anos e é uma das principais causas de morbidade e mortalidade. De acordo com o Relatório Mundial sobre Drogas 2017 publicado pelo Escritório das Nações Unidas sobre Drogas e Crime, o uso de opiáceos e opiáceos com receita médica pode não ser tão difundido como a cannabis, mas os opiáceos continuam a ser drogas importantes com potenciais danos e consequências para a saúde. Portanto, a detecção fácil e rápida dos opiáceos é uma necessidade urgente.

O abuso de heroína é uma das formas mais comuns de dependência de opiáceos. A heroína (diacetilmorfina, diamorfina ou Diagesil®) é um derivado semi-sintético da morfina e um poderoso analgésico opióide. O metabolismo da heroína é visualizado na figura 1 . A heroína hidrolisa-se rapidamente à 6-monocetilmorfina (6-MAM) e finalmente à morfina. Como a heroína hidrolisa-se rapidamente após a administração, os seus metabolitos são normalmente utilizados para confirmar o uso. Além disso, a 6-MAM é o único indicador específico de abuso recente de heroína versus morfina, e tem suscitado grande interesse por parte da comunidade de investigação.

Métodos transversais para detectar 6-MAM foram descritos, e estes podem ser divididos nas seguintes categorias: (1) análise cromatográfica incluindo cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alto desempenho; (2) análise espectroscópica como espectroscopia de Ramen, espectroscopia infravermelha, quimioluminescência, etc.; (3) eletroforese capilar; e (4) métodos de imunoensaio (antígeno-anticorpo). Técnicas complexas de instrumentação colocam uma pressão tremenda sobre a triagem básica de medicamentos, devido à necessidade de equipamentos sofisticados e operadores profissionais. O laboratório às vezes é fechado ou distante. Nem mesmo as delegacias de polícia podem abrigar este equipamento complexo e caro. No entanto, um policial tem que julgar imediatamente se um material suspeito contém heroína ou não e precisa de reagir rapidamente. Assim, o desenvolvimento de métodos específicos, confiáveis e simples para detectar drogas ilícitas em amostras biológicas é urgentemente necessário .

Dos métodos para detecção rápida, as tiras de fluxo lateral (LFS) à base de nanopartículas de ouro coloidal (AuNP) têm sido amplamente adotadas para o rastreamento rápido devido à propriedade óptica dependente do tamanho e da distância das AuNPs, com o primeiro relatório de Mirkin e colegas de trabalho . O princípio dos ensaios semi-quantitativos de fluxo lateral é que a cor vermelha das AuNPs pode ser vista a olho nu a partir da combinação antígeno-anticorpo em vários minutos . Vários kits de testes comerciais para detecção de abuso de heroína estão disponíveis, incluindo os das empresas NovaBios e Wondfo. No entanto, a maioria dos kits de teste de heroína medem apenas morfina, mas não 6-MAM, porque é difícil discriminar entre 6-MAM e morfina. A morfina pode ser metabolizada a partir de outras drogas ou pode ter sido prescrita. A 6-MAM é exclusivamente rastreável à heroína.

As amostras incluem sangue, plasma, urina, cabelo, fluidos orais, bem como na respiração, suor, leite materno, dentes, etc. . As amostras mais comuns usadas para testes ilícitos de heroína são sangue, urina e fluidos orais. Destes, o teste de sangue é o mais preciso e confiável, mas também é invasivo. O teste de urina é o mais conveniente e amplamente utilizado na triagem de drogas de abuso. Os fluidos orais são cada vez mais utilizados para testes no ponto de tratamento – são fáceis de recolher em público. Entretanto, os fluidos orais são muito viscosos e têm baixas concentrações do alvo; assim, a maioria dos testes usa a urina para testes de 6-MAM. Todo o desenvolvimento de testes de fluidos orais irá enfrentar o mesmo problema para a coleta de amostras e melhoria da sensibilidade. Um estudo anterior mostrou que a 6-MAM é frequentemente detectada em fluidos orais. O padrão de detecção de IFL no fluido oral 6-MAM é de 4 ng ml-1 . Aqui, desenvolvemos um teste de fluxo lateral para heroína em amostras de fluido oral.

Exploramos AuNPs como etiquetas de anticorpos em um ensaio de fluxo lateral para detecção rápida e sensível de 6-MAM através de um sinal colorimétrico. Primeiro, sintetizamos a 6-MAM e depois conjugamos com a albumina de soro bovino (BSA) para permitir que ela seja revestida em uma linha T. Além disso, para superar as dificuldades em lidar com amostras de fluido oral, foram escolhidos os tipos de membranas de nitrocelulose (NC), a fórmula de solução do bloco de amostras e o bloco adsorvente de esponja para buscar as melhores condições para o LFS do fluido oral. Finalmente, o IFT de 6-MAM foi validado e demonstrou possuir sensibilidade e especificidade excepcionais.

Experimental

2.1. Materiais

Os anticorpos contra 6-MAM foram fornecidos pela Bioventure (Xangai). BSA e pirrolidona de polivinil (PVP) foram adquiridos da Sigma (Barcelona, Espanha). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) e STANDAPOL ES-1 (S7) foram comprados da BASF (Alemanha). A água destilada (resistividade 18,2 MΩ cm-1) foi feita por um sistema de água RephiLe PURIST UV Ultrapure (China). O sistema de dispersão de bobinas foi da Doyesgo (China). O espectrómetro de massa Vion IMS Q-Tof era de Waters (EUA). Todos os materiais padrão como 6-MAM e morfina foram obtidos dos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Drogas (China). O microscópio foi do Motic AE2000 (Xiamen, China). Todos os outros reagentes químicos e imunológicos não especificados aqui foram produtos comerciais padrão de grau analítico/reagente.

2,2. Os componentes da tira de fluxo lateral

Os LFSs consistem de um suporte plástico, uma tira adsorvente de esponja (esponja), um bloco de amostras, um bloco conjugado, membranas NC e um bloco absorvente. A tira adsorvente de esponja é especialmente concebida para a recolha de líquidos orais e transporta rapidamente o líquido oral para a almofada de amostras. O bloco de amostras contém um sistema tampão e alguns surfactantes. Os conjugados anticorpos-AuNP foram pulverizados na almofada conjugada para reagir com a amostra e ser libertados da almofada e entrar na membrana NC revestida com 6-MAM-BSA na linha T e anticorpos anti-coelho de cabra na linha C. A almofada absorvente é um papel filtro localizado na extremidade da tira; ela mantém o fluxo capilar. O LFS só precisa de ser colocado na boca ou inserido num copo de amostra de fluido oral. Uma visão esquemática do LFS é mostrada na figura 2. Um diagrama esquemático do IFT para detecção de 6-MAM é exibido na figura 3.

2.3. Síntese de conjugado de albumina sérica de 6-monocetilmorfina bovina

A 6-MAM foi preparada como descrito anteriormente em trabalhos de pesquisa . Resumidamente, a morfina foi produzida pela primeira vez por hidrólise alcalina de heroína. Um grupo N-hidroxissuccinimida (NHS) éster foi então adicionado à molécula 6-MAM para conjugá-la com as proteínas portadoras (figura 4). O 6-MAM ativado foi assegurado por um espectrômetro de massa IMS Q-Tof Waters® Vion. Em seguida, a síntese foi realizada conforme descrito (figura 5), com algumas modificações. Primeiro, 80 mg de BSA em 6 ml de tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH = 7,5) foi permitido esfriar a 0°C. Então, 20 mg de 6-MAM ativado em 1 ml de dimetilformamida anidra (DMF) foi adicionado gota a gota a 0°C. A mistura foi aquecida à temperatura ambiente e agitada durante a noite. O conjugado 6-MAM-BSA resultante foi dialisado contra 50 mM de tampão fosfato de potássio (pH = 7,5) com seis trocas de tampão (pelo menos 6 h cada a 4°C).

2.4. Preparação de conjugados nanopartículas-anticorpos de ouro

As AuNPs de 20 nm foram preparadas através de um método de redução de citratos . Aqui, 2 ml de solução de HAuCl4 a 1% foram adicionados em 100 ml de água fervente com agitação vigorosa, e então 2 ml de solução de citrato de sódio a 1% foram imediatamente adicionados. Quando a solução ficou vermelha, ela foi fervida por mais 15 minutos. A solução foi resfriada à temperatura ambiente e armazenada a 4°C para uso posterior.

Após ajustar o valor de pH da solução de AuNPs para 9,0 por 0,1 M K2CO3, 30 µg de anticorpos 6-MAM foram adicionados em 10 ml de solução de AuNPs e incubados por 30 min. Isto foi seguido por 20 µl de 100,0 g l-1 BSA durante 15 min para bloquear locais reactivos. A solução foi centrifugada a 3740g durante 15 min, e o sobrenadante foi re-centrifugado a 12 100g durante mais 30 min. Todos os precipitados de ouro foram misturados e medidos para identificar a absorvância máxima através de espectroscopia visível por UV. Foi então armazenado a 4°C para uso posterior.

O mesmo método foi usado para conjugar AuNPs a anticorpos IgG de coelho. Ao fazer o bloco conjugado, os anticorpos conjugados foram diluídos para absorver cinco com tampão (0,05 M Tris-HCl contendo 10,0 g l-1 BSA, 0,4% Triton X-100, 5% trehalose, 10% sacarose, pH 8,2). Finalmente, 500 µl de AuNPs-anticorpos conjugados foram pulverizados sobre uma fibra de vidro de 20 mm2 e depois secos a 37°C durante a noite.

2,5. Preparação da membrana de nitrocelulose revestida

Para fazer a tira de teste de fluxo lateral, antígenos 6-MAM-BSA (0,6 mg ml-1) foram distribuídos nas membranas NC como linhas de teste (linha T). As linhas de controle (linha C) foram revestidas por anticorpos policlonais de cabra anti-coelho (0,15 mg ml-1). As membranas NC revestidas foram secas a 37°C durante a noite. Nove membranas NC comerciais de quatro empresas foram avaliadas: Millipore (HF90, HF135 e HF180), GE-Whatman (FF120HP e AE100), Sartorius (CN95 e CN150) e Pall (Vivid90 e Vivid170).

2,6. Sensibilidade e especificidade

A tira é um ensaio competitivo, e ambas as posições tinham tiras de 6-MAM. Quando a amostra contém 6-MAM, liga-se ao anticorpo marcado com nanogold na almofada conjugada. O excesso de anticorpos continua a avançar na direcção cromatográfica devido à acção capilar e depois liga-se ao antigénio 6-MAM na linha T. A intensidade do sinal da linha T está directamente relacionada com a concentração de 6-MAM na amostra. Uma cor mais escura indica uma menor concentração de 6-MAM.

O líquido oral negativo foi coletado de seis pessoas e perfurado com 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0.4, 0.1 ng ml-1) para detecção de sensibilidade. Dez drogas comumente abusadas foram utilizadas para verificar a especificidade das IFTs. Estas drogas foram morfina (MOP, 100 µg ml-1), codeína (COD, 100 µg ml-1), tetrahidrocanabinol (THC, 10 µg ml-1), metileno dioximetafetamina (MDMA, 100 µg ml-1), cetamina (KET, 100 µg ml-1), metilanfetamina (MET, 100 µg ml-1), cocaína (COC, 100 µg ml-1), metadona (MTD, 100 µg ml-1), efedrina (EPH, 100 µg ml-1) e pseudoefedrina (PEPH, 100 µg ml-1).

Resultados e discussão

3.1. Síntese de conjugado de albumina sérica de 6-monocetilmorfina bovina

Membranas NC são normalmente revestidas com uma proteína transportadora antes da conjugação de anticorpos. Os Linkers são usados para manter a especificidade estrutural. Aqui, um grupo éster do NHS foi primeiro adicionado à molécula 6-MAM como um ligante para a proteína portadora. Isto foi validado com um espectrômetro de massa IMS Q-Tof Waters® Vion. Encontramos um amplo pico na cromatografia líquida de ultra performance (UPLC) de 6-MAM ativado a 8,8 min com um m/z de 706,27645 (figura 6) contra um m/z previsto de 706,2758. Isto indica que o linker foi ligado com sucesso ao 6-MAM. O significado da síntese precisa é evidente porque apenas a estrutura é corretamente estabelecida, e isto poderia levar ao emparelhamento com anticorpos 6-MAM.

5416

Figure 6. Confirmação de 6-MAM ativado por um espectrômetro de massa IMS Q-Tof Waters® Vion. (a) Cromatograma. (b) Espectro.

Não utilizamos diálise de dimetilsulfóxido de gradiente porque o produto é solúvel e o protocolo de conjugação anterior é muito complexo. O BSA teve vários picos no cromatograma UPLC (dados não mostrados) por causa dos vários análogos. Isto levou a uma gama de rácios de conjugação. Portanto, houve vários picos no cromatograma UPLC correspondentes às diferentes razões de conjugação. Os resultados da conjugação puderam ser confirmados de forma mais eficaz através do emparelhamento antígeno-anticorpo do que a razão conjugatória.

3,2. Tipos de seleção de membrana nitrocelulósica

membranas NC ligam as proteínas eletrostaticamente através de interações do dipolo forte do éster de nitrato com o dipolo forte das ligações do peptídeo da proteína. As propriedades incluindo o fluxo capilar, intensidade do sinal e fundo foram avaliadas porque poderiam influenciar o desempenho final do IFT. Além disso, a taxa de fluxo recebe mais atenção porque pode afetar a capacidade de adsorção da proteína e até mesmo a sensibilidade. A taxa de fluxo de uma membrana depende das propriedades agregadas das estruturas porosas, tais como tamanho dos poros, distribuição do tamanho dos poros e porosidade. Um tamanho maior dos poros leva a uma adsorção proteica mais fraca.

Comparamos nove membranas NC (tabela 1). Cada teste foi repetido três vezes, e o resultado médio foi registrado. Os resultados da IFT foram medidos em 3 min, e o melhor fluxo de amostra foi inferior a 20 s cm-1. A intensidade do sinal na linha T também foi necessária no nível normal. Uma cor de fundo mais profunda dificultou a precisão. A membrana Millipore HF135 foi a melhor escolha para 6-MAM após uma consideração abrangente do fluxo de amostra, intensidade do sinal na linha T e cor de fundo.

3.3. O bloco de amostras

A solução para tratar o bloco de amostras é muito importante para o teste porque serviu como sistema tampão de reacção quando as amostras de fluido oral reidratam o bloco. A solução geralmente inclui um sistema tampão com força iônica e valor pH adequados; alguns materiais de bloqueio e surfactantes podem acelerar o fluxo do fluido oral na membrana. O bloco de amostras lida com as complexidades dos efeitos da matriz do fluido oral e torna-o compatível com a membrana NC. Além disso, o sistema tampão garante a liberação dos analitos e estabiliza o fluxo porque o fluido oral é muito viscoso.

Four fórmulas diferentes foram consideradas. As fórmulas de solução são apresentadas na tabela 2. Os resultados indicaram que o sistema tampão 4 com o surfactante STANDAPOL ES-1 (S7) deu o melhor desempenho com um fluxo de amostra de 17 s cm-1, com uma intensidade de sinal normal e um fundo branco. O tensoactivo S7 é um tensoactivo aniónico forte que oferece maior capacidade de lavagem do que o S17 e S9.

3.4. Recolha de fluidos orais

Os fluidos orais são mais difíceis de recolher do que a urina devido à sua elevada viscosidade. Existem muitos tipos de dispositivos de coleta de fluidos orais: cotonetes, esponjas, tubos de plástico e copos. Alguns métodos estimulam os fluidos orais através do vinagre, lavagens bucais, pastilhas, etc. No entanto, tal estimulação pode alterar a concentração de analitos no fluido oral e é mais complicada e demorada. Finalmente recolhemos o líquido oral directamente da boca através de um adsorvente de esponja (ESSENTRA, UK), que é uma mistura de fibras poliméricas com um tamanho de poro adequado.

Dois tipos de adsorventes de esponja (K1 e K2) foram desenhados à medida, e as estruturas de ambos os absorventes de esponja são mostradas na figura 7. K2 era muito mais solto e regular em relação a K1. Ambos foram avaliados testando o desempenho de manuseio do fluido, incluindo a queda de água na esponja, colocando o IFT final no tampão negativo de fosfato de potássio (pH = 7,0) e colocando o IFT final na boca. A esponja K2 teve um fluxo de amostra duas vezes mais rápido (média 20 s cm-1) do que a esponja K1 para água, tampão PBS ou fluidos orais reais. Esta é uma questão muito importante para o teste de fluidos orais. Em conclusão, a K2 foi escolhida pelo seu desempenho distinto no tratamento de amostras de fluidos orais.

3.5. Sensibilidade e especificidade

As pequenas moléculas são normalmente detectadas através de um ensaio competitivo em LFSs. Aqui, não há sinal (linha vermelha) na linha T. Isto representou uma concentração de 6-MAM na amostra que está acima do valor de corte. A sensibilidade para o teste de fluido oral deve ser muito maior do que o teste de urina, devido à baixa concentração de metabólitos de drogas no fluido oral. Aqui, fizemos com sucesso um LFS qualitativo para 6-MAM com uma sensibilidade de 4 ng ml-1, que cumpre os requisitos para os limites gerais de detecção do fluido oral. Os resultados são mostrados na figura 8. Além disso, a figura 9 mostra a especificidade em relação aos fármacos normalmente utilizados de forma abusiva. O IFT de 6-MAM foi específico para 6-MAM sem reacção cruzada, especialmente com morfina ou codeína.

Conclusão

O 6-MAM é o metabolito específico da heroína. Relatamos aqui um LFA para 6-MAM através de um conjugado especial emparelhado com um anticorpo específico. Fizemos um conjugado que ligava a 6-MAM à proteína transportadora através de um grupo éster do NHS na posição C3 (figura 10). Aqui, o anticorpo identificou o grupo acetil do 6-MAM. Este é um pré-requisito para a especificidade do 6-MAM. Finalmente, fizemos um teste LFS muito sensível, sem reação cruzada com 10 drogas comumente abusadas, incluindo morfina e codeína. Identificamos as membranas NC adequadas, almofada da amostra, tamanho dos poros e adsorvente da esponja para fazer um teste que usa fluidos orais no ponto de tratamento.

Com as vantagens acima, o 6-MAM LFS para amostra de fluidos orais poderia ser aplicado tanto para pesquisa como para usos industriais. Poderia ajudar a polícia a poupar mão-de-obra e tempo/custos no rastreio preliminar. Os fluidos orais são convenientes e menos invasivos e são adequados para o rastreio de tráfego. Em conclusão, um fluido oral LFS para abuso de heroína destinado ao 6-MAM é um produto promissor para combater a condução drogada.

Ethics

O uso das amostras de heroína para pesquisa foi supervisionado pelo Terceiro Instituto de Pesquisa do Ministério de Segurança Pública da China. Todos os autores declaram estar de acordo com os padrões éticos.

A acessibilidade aos dados

Os dados são depositados no Repositório Digital da Dryad: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

A contribuições dos autores

L.Z. concebeu este estudo, e X.H e J.Z. ajudaram a realizar os experimentos das figuras 4 e 5. F.C. e Y.Z. executaram os estudos da figura 6. J.L. analisou os dados e escreveu o trabalho. Todos os autores deram sua aprovação final para publicação.

Interesses concorrentes

Nós declaramos que não temos interesses concorrentes.

Funding

Não foi recebido financiamento para este artigo.

Disclaimer

Todas as opiniões, resultados e conclusões ou recomendações aqui expressas são dos autores.

Pés

Este artigo foi editado pela Royal Society of Chemistry, incluindo o comissionamento, processo de revisão por pares e aspectos editoriais até o ponto de aceitação.