Validação de anticorpos

Recursos “Centros de recursos técnicos” Recursos técnicos de anticorpos “Validação de anticorpos

Nem todos os anticorpos são válidos para cada experiência e condição, devem ser validados para a aplicação específica e para a espécie. Actualmente, não existe um meio padrão de “validação de anticorpos”, e isto pode ter um grande impacto na reprodutibilidade experimental e na fiabilidade. Os periódicos e as agências de fomento tomaram medidas para preencher esta lacuna. Muitos agora têm requisitos para declarar explicitamente como você validará um anticorpo para um uso específico. Infelizmente, não existem critérios universalmente aceites para a validação de anticorpos. Portanto, cabe a cada pesquisador validar cada anticorpo para a aplicação pretendida.

Basic Validation

Standard antibody validation methods include western blot, ELISA, flow cytometry, and IHC. A maioria dos pesquisadores está confortável com estes métodos testados e confiáveis. O processo de validação pode ser demorado porque o pesquisador ou o fabricante deve validar o anticorpo para cada aplicação. Esta dificuldade é agravada porque cada uma das condições de cada ensaio é diferente. Por exemplo, uma mancha ocidental depende da desnaturalização das proteínas. Assim, um anticorpo western blot-validated pode funcionar bem em condições de desnaturação, mas pode falhar no reconhecimento de antígenos em sua conformação nativa (isto é, ELISA).1 Da mesma forma, um anticorpo validado para afinidade de proteínas nativas pode falhar em ligar o mesmo antígeno após desnaturação ou fixação.

Os métodos acima desempenham papéis necessários na validação de anticorpos. No entanto, não podemos contar apenas com estes métodos, pois eles não representam as aplicações em constante expansão. O nível de confiança dos anticorpos validados pode ser aumentado incluindo outras técnicas de validação.

Técnicas Antigas, Novas Utilizações

Para abordar os encurtamentos da validação básica de anticorpos, um grupo de cientistas se reuniu recentemente para “propor um conjunto de diretrizes padrão para validação de anticorpos”.2 Eles sugerem que, além dos métodos básicos de validação de anticorpos, os pesquisadores começam a se apoiar em pilares conceituais. Estes incluem estratégias genéticas, estratégias de anticorpos independentes e expressão de proteínas marcadas.2

• Genetic Strategies: CRISPR-Cas9 e Mais

  As estratégias genéticas consistem em técnicas comoCRISPR-Cas9, RNAi e siRNA knockdown, usadas em conjunto com um ensaio de detecção de proteínas. Estes métodos detectam qualquer ligação não específica pelo anticorpo em questão depois de derrubar ou derrubar o gene apropriado. Se o anticorpo for específico, então nenhum ou sinal reduzido do anticorpo deve ser detectado nas linhas de células eliminadas ou para baixo, respectivamente.

• Abordagem de anticorpos independentes

  O uso de anticorpos independentes é outro método que poderia detectar ligação não específica. A abordagem de anticorpos independentes emprega dois anticorpos diferentes (independentes) que ligam o mesmo antígeno mas epitopos diferentes. Portanto, os dois anticorpos devem exibir o mesmo padrão de detecção e nenhuma ligação fora do alvo.2 Esta técnica requer várias amostras para teste para controlar a expressão variável da proteína alvo, o que pode se tornar caro e demorado.2 Além disso, a técnica de validação depende da disponibilidade de anticorpos múltiplos que reconhecem epitopos diferentes na mesma proteína alvo. GenScript oferece serviços de epitopagem inMonoExpress™ mAb que incluem “anticorpos independentes” para antígenos protéicos.

• Expressão de Proteína Variável

  Analizando a detecção de proteínas alvo marcadas também pode fornecer uma forma de medir a ligação não específica de anticorpos. Neste método, as proteínas alvo são modificadas com uma etiqueta de afinidade (ou seja, FLAG) ou uma proteína fluorescente (ou seja, GFP). Então, semelhante à abordagem de anticorpos independentes, o padrão de detecção do anticorpo validado é comparado com o do anticorpo específico da etiqueta. Embora simples, uma questão com este método é assegurar que as proteínas marcadas são expressas a níveis endógenos, porque “a superexpressão poderia mascarar a detecção de eventos de ligação off-target”.2

  Anticorpos recombinantes como alternativa aos anticorpos monoclonais?

  Uma recente chamada à ação relativa à validação de anticorpos sugeriu que os pesquisadores usassem apenas anticorpos recombinantes, ao invés de anticorpos policlonais ou mesmo monoclonais. Anticorpos monoclonais são produzidos usando linhas celulares de hibridoma. Infelizmente, as linhas celulares de hibridoma podem morrer, perder os seus genes codificadores de anticorpos ou não crescer quando retiradas do armazenamento congelado.3 Além disso, os anticorpos monoclonais produzidos com hibridoma podem ligar-se a mais do que um alvo. Portanto, determinar a sequência do anticorpo codificado pelo hibridoma e produzir o anticorpo de forma recombinante supera esses problemas. Além disso, porque da sequência definida, os anticorpos recombinantes podem fornecer outra camada de validação em comparação com o uso apenas das técnicas acima.3

  Estes métodos de validação adicionais propõem “fornecer evidências de que um anticorpo liga seu alvo e, na maioria dos casos, eles também devem permitir a avaliação de potencial reactividade cruzada sob as condições testadas”.2 No entanto, estratégias antigas e novas provavelmente precisarão ser executadas em combinação para validar adequadamente o anticorpo.

Selecionar o Método Apropriado de Validação de Anticorpos

Com todos estes problemas em torno dos anticorpos, como escolher o método apropriado?

Primeiro, você precisa decidir em qual ensaio você usará o anticorpo. Por exemplo, o método CRISPR-Cas9 não envolve modificação da proteína alvo e valida que o anticorpo carece de reactividade cruzada com outras proteínas. Portanto, você pode usar esta técnica para validar anticorpos para uma ampla variedade de ensaios, incluindo western blot, IHC, imunocitoquímica (ICC), citometria de fluxo, ELISA, imunoprecipitação (IP), imunoprecipitação de cromatina (ChIP), e ensaios de proteína de fase reversa.2 Entretanto, devido às dificuldades em expressar uma proteína modificada, a validação de um anticorpo usando expressão de proteína marcada é sugerida apenas para bloqueios ocidentais, IHC, ICC e citometria de fluxo.

Segundo, o pesquisador deve estar ciente das limitações da amostra de tais métodos de validação. Como exemplo, tanto o CRISPR-Cas9/KO como as técnicas de expressão de proteínas marcadas não podem ser usadas para validar anticorpos em amostras de tecido humano e fluidos corporais, tais como plasma e soro.2 Isto porque você não pode realizar manipulação genética em humanos, ao contrário das linhas celulares.

Finalmente, independentemente do anticorpo e respectivo método de validação utilizado pelo fornecedor do anticorpo, o pesquisador deve realizar pelo menos uma estratégia de validação em sua aplicação particular ou contexto de amostra.2

Validar cada anticorpo para sua aplicação específica e espécie é a chave para alcançar resultados reprodutíveis e confiáveis. A informação ajudará a orientar a sua decisão quanto aos métodos apropriados a utilizar no seu laboratório. Para mais ajuda na validação de anticorpos ou outras aplicações, visiteGenScript Antibody Technical Resources.

Adaptado do conteúdo criado por BitesizeBio em nome do GenScript.