Variação de Allozyme em uma população natural de Stryphnodendron adstringens no Parque Estadual do Rio Preto, sudeste do Brasil

BIOQUEMISTRIA E FISIOLOGIA

Variação de Allozyme em uma população natural de Stryphnodendron adstringens no Parque Estadual do Rio Preto, sudeste do Brasil

Jacqueline Siqueira GlasenappI,*; Priscila Barros BarbosaI; Vicente Wagner Dias CasaliI; Ernane Ronie MartinsII; Cosme Damião CruzIII

IUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Fitotecnia, Av. PH Rolfs s/n, 36570-000 Viçosa, MG, Brasil
IIUniversidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Agrárias, Avenida Universitária 1.000, Bairro Universitário, Montes Claros, 39404-547 MG, Brasil
IIIUniversidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia, Av. PH Rolfs s/n, 36570-000 Viçosa, MG, Brasil

ABSTRACT

Folhas e frutos de 63 árvores Stryphnodendron adstringens foram amostrados no Parque Estadual do Rio Preto para analisar a segregação de allozyme, a expressão tecidual específica de allozyme loci, e seus parâmetros genéticos. Os sistemas enzimáticos ADH, EST, ACP, PGM, PGI, GDH, G6PDH, GOT, IDH, LAP, MDH, PER e SKDH foram avaliados por meio de eletroforese de amido e gel. Os sistemas polimórficos PGI, IDH, MDH e GOT demonstraram uma estrutura quaternária dimérica, enquanto EST e PER foram monoméricos. A diversidade genética total esperada (HE) para folhas e sementes foi de 0,325 e 0,244, respectivamente. O número efetivo de alelos por locus (AE) foi de 1,58 nas folhas e 1,42 nas sementes. Os valores de HE e AE observados em S. adstringens foram comparativamente superiores aos valores médios observados em estudos allozyme de outras plantas lenhosas. Os valores dos índices de fixação para a população, considerando folhas (f = 0,070) e sementes (f = 0,107), não foram significativos. Os altos valores da diversidade genética e do número efetivo de alelos por locus, assim como o índice de fixação não significativo e os ajustes das proporções de Hardy-Weinberg entre gerações para os loci pgi-1, mdh-2 e idh-1, indicaram o acasalamento aleatório nesta população. Os sistemas enzimáticos EST e PER demonstraram sua melhor resolução em tecidos foliares, enquanto os sistemas MDH, IDH, PGI e GOT demonstraram sua melhor resolução em tecidos de sementes.

Palavras-chave: segregação de allozyme, diversidade genética, heterozygosidade, plantas medicinais

INTRODUÇÃO

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (Mimosoideae, Leguminosae) é uma pequena árvore sempre-verde (localmente chamada barbatimão) que é amplamente distribuída no bioma Cerrado (Cerrado brasileiro) (Ortiz et al. 2003). É usada em práticas medicinais tradicionais para tratar enfermidades como úlceras, feridas, hemorróidas (Barros 1982), gastrite, dores de garganta (Hirschmann & Arias 1990), leucorréia, hérnias, diarréia, sangramento, ténia e oftalmia (Pio Correa 1926, Almeida et al. 1998). Suas inflorescências racemosas e cromonóicas têm flores pequenas e densamente arranjadas. A polinização cruzada é vital para a produção de frutos desta espécie e os principais visitantes florais parecem ser Hymenoptera; outros visitantes florais incluem Diptera, Lepidoptera e Coleoptera. A produção de frutos é limitada pela disponibilidade de recursos (Ortiz et al. 2003).

Stryphnodendron adstringen populações que costumavam cobrir extensas áreas do Cerrado estão agora isoladas em pequenos fragmentos devido ao desmatamento, uso indiscriminado da terra e desenvolvimento urbano. Uma das poucas regiões onde a vegetação do Cerrado ainda é bem conservada está no Parque Estadual do Rio Preto (RPSP), localizado no município de São Gonçalo do Rio Preto na Biosfera da Reserva da Serra do Espinhaço, a 70 km da cidade de Diamantina no estado de Minas Gerais, no sudeste do Brasil. O parque cobre uma área total de 12.185 ha. que é coberta principalmente por cerrado sensu stricto e campos de vegetação de altitude. A fauna e flora do RPSP são muito ricas e incluem muitas espécies ameaçadas de extinção como S. adstringens (IEF 2011). A Serra do Espinhaço serve de divisor de águas para as bacias de muitos rios do centro-leste e do grande rio São Francisco (Saadi 1995), e separa dois importantes biomas em suas porções central e sul: a Mata Atlântica nas encostas leste e o Cerrado nas encostas oeste (Melo Júnior et al. 2001).

Os recursos genéticos das plantas medicinais (especialmente espécies arbóreas) são finitos, e muitas plantas do Cerrado têm sido amplamente utilizadas sem preocupação com sua conservação ou renovação. É essencial que nossos recursos florestais remanescentes sejam utilizados com prudência – e os estudos genéticos são fundamentais para a compreensão plena de seus processos evolutivos e para o desenvolvimento de estratégias de conservação que possam garantir o futuro das espécies manejadas. As técnicas de Isozyme fornecem uma forma de avaliar os níveis de variação genética em populações naturais de árvores florestais tropicais e de medir processos populacionais importantes para ecologistas, conservacionistas e pessoal de manejo florestal (Loveless 1992). Muito poucos estudos sobre os níveis de variações genéticas em plantas de cerrado lenhosas estão disponíveis, no entanto. Dois estudos de diversidade genética em S. adstringens foram publicados, o primeiro foi baseado em dados de microsatélites (Branco et al. 2010) e o segundo em marcadores RAPD (Camillo et al. 2001), mas nenhum estudo de isozyme foi relatado.

De acordo com o facto dos genes que controlam a expressão do isozyme se manifestarem em certas fases de desenvolvimento e em órgãos e tecidos específicos, ou em resposta a certos estímulos (Ramírez et al. 1991), zimogramas de extractos de sementes, plântulas e folhas de plantas adultas podem ser bastante distintos (Alfenas & Brune 1998). Muitas enzimas, tais como esterases, peroxidases, fosfatases e peptidases também demonstraram variações de desenvolvimento e ambientais que imitam a segregação Mendeliana (Conckle 1971b, Kelley & Adamns 1977) e modificações genéticas (Lei 1967) ou ambientais pós-tradução (Cullis 1977), de modo que as análises Mendelianas são essenciais em estudos de ensaios enzimáticos não específicos (Hart & Langston 1977). A melhor maneira de abordar este problema é verificar através de análises Mendelianas que um determinado conjunto de variantes de isozimas são verdadeiros allozimas, ou seja, são codificados por diferentes alelos no mesmo local (Broun & Moran 1979).

Os objetivos do presente estudo foram avaliar a expressão e segregação tecidual específica de allozyme loci, medir parâmetros genéticos, e descrever variantes alozimáticas úteis para futuras avaliações da estrutura genética das populações de S. adstringens.

MATERIAL E MÉTODOS

A vegetação na reserva de S. adstringens é bem conservada e S. adstringens é muito comum dentro e fora do parque, ocorrendo quase continuamente nos municípios de Olhos D’Água e Diamantina, Estado de Minas Gerais, Brasil. Foram recolhidas amostras de folhas e frutos (em seu estágio final de maturação) de 63 árvores individuais de S. adstringens. O espaçamento médio entre as árvores amostradas foi de 60 m. Os frutos foram transportados em sacos de papel e as folhas foram imersas em nitrogênio líquido até serem ensaiadas no Laboratório de Reprodução Vegetal da Universidade Federal de Viçosa.

O presente estudo focalizou as variantes isozimas (allozymes) presentes nesta população de S. adstringens. As análises foram realizadas utilizando a técnica de eletroforese amido-gel, extraindo as alozimas das folhas e três sementes de cada árvore amostrada. Foram utilizadas as proporções de 1 g de tecido foliar ou uma semente para cada 3 mL de solução extrativa #1, como recomendado por Alfenas et al. (2006). Os géis foram preparados com 12 g de sacarose e 60 g de amido por 500 mL de solução tampão de gel. Os sistemas tampão utilizados seguiram Soltis et al. (1983) (tampão A) e Shaw & Prasad (1970) (tampão B). Foi realizada uma préexecução a 15 mA durante 30 min. com tampão A, e durante 1 h com tampão B. As execuções do extrato foram realizadas a 35 mA e duraram cerca de 5 h. Os sistemas allozyme analisados e a composição dos sistemas de eletrodos/gel tampão estão descritos na tabela 1.

Os zimogramas foram analisados e os loci alozime identificados usando as mesmas abreviaturas usadas para designar cada sistema enzimático (por exemplo, PGI para a fosfoglucose isomerase) em letras minúsculas em itálico, seguido por sua ordem numérica ascendente começando com o locus migratório mais lento (por exemplo, pgi-1). O alelo migratório mais rápido em cada locus foi identificado pela letra a, enquanto aqueles que migram mais lentamente foram seguidos por ordem alfabética. Testes estatísticos envolvendo frequências de alelos foram realizados apenas para loci que apresentavam padrões de banda simples que podiam ser facilmente identificados.

Experimentos de cruzamento controlado ou estudos de allozyme usando tecidos haplóides (como o pólen) são necessários para testar a herança mendeliana e interpretar corretamente os zimogramas (Hart & Langston 1977, Broun & Moran 1979, Alfenas & Brune 1998). Estes estudos são difíceis de realizar em S. adstringens por ser uma planta não domesticada, alogâmica e de crescimento lento, e a maioria dos seus racemos não conseguiu produzir frutos por auto-polinização (Rocha & Moraes 1997, Ortiz et al. 2003).

Brown & Moran (1979) observam que a melhor maneira de evitar a má interpretação dos dados de isozyme é usar análises Mendelianas para verificar que conjuntos de variantes de isozyme são realmente allozymes e que eles são codificados por alelos em um único locus. Portanto, a fim de identificar corretamente os modos de herança de allozyme sem realizar cruzamentos genéticos ou estudos de tecidos haplóides, analisamos as proporções genotípicas dos allozyme entre gerações, medindo as frequências alélicas das folhas e sementes de uma mesma planta. Utilizando as frequências alélicas observadas nas folhas de 63 árvores, calculamos as frequências genotípicas esperadas sob um Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) para a mesma amostra de progenitura do mesmo tamanho (189 sementes). Sementes ou plântulas individuais podem ser testadas como membros de matrizes de descendência (Brown & Moran 1979). As frequências alélicas esperadas da descendência foram então comparadas com o mesmo tamanho de amostra da descendência testada usando o teste do qui-quadrado (X2). Como esta espécie é alogâmica e os progenitores machos são desconhecidos, os próprios indivíduos da população foram considerados como formando o conjunto de gameta macho (Cruz 2005), e as frequências alélicas dos machos foram consideradas iguais às das fêmeas, assumindo um HWE.

Os parâmetros genéticos do número efetivo de alelos, diversidade genética (HE e HO) (Nei 1973), e índice de fixação (Wright 1951) foram estimados. As proporções esperadas de loci heterozigotos por indivíduo (HE) é uma medida composta que resume a variação genética ao nível dos alelos. Este parâmetro, que é frequentemente referido como diversidade genética, foi calculado para cada locus e calculou a média de todos os loci (Berg & Hamrick 1997). O teste Li & Horvitz (1953) do índice de fixação (f) foi conduzido. Cada locus foi testado separadamente e os valores χ2 e df’s foram somados sobre todos os loci para dar um teste global da média multilocus f. As análises estatísticas foram realizadas usando o sistema do software Genes para genética e estatística. Os testes exato e qui-quadrado de Fisher (χ2 ) foram usados para calcular as probabilidades dos arranjos genotípicos observados nas folhas e sementes.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Diferenças foram observadas em termos das regiões ativas e dos números de loci e alelos entre as folhas e sementes para os sistemas polimórficos de malato desidrogenase (MDH), fosfoglucose isomerase (PGI), isocitrato desidrogenase (IDH), glutamato oxaloacetato transaminase (GOT), peroxidase (PER), e esterase (EST); os sistemas PGI, IDH, EST e SKDH, por outro lado, demonstraram atividade no mesmo loci. As regiões ativas, número de loci, número de alelos, a estrutura quaternária observada nos sistemas polimórficos e as estruturas quaternárias registradas na literatura estão listadas na tabela 2. As representações esquemáticas da variação dos sistemas polimórficos utilizados nas análises estatísticas (PGI, IDH, GOT e PER) são apresentadas na figura 1.

Duas regiões de atividade MDH eram aparentes nos géis de folhas (progenitores femininos), enquanto apenas uma região era aparente nos géis de sementes (progenitura). A atividade da região catodal foi observada principalmente nas folhas, e parecia ser controlada por um único locus (mdh-1); exibia um padrão de isozyme monomérico em contraste com os padrões diméricos ou tetraméricos normalmente observados (Brune et al. 2006). O locus mdh-2 monomórfico na região anodal era aparente apenas em sementes, e o locus mdh-3 dimérico era coincidente em folhas e sementes, exibindo um padrão dimérico com dois alelos que eram clara e consistentemente observados em ambos os órgãos. O MDH tem sido isolado de diferentes fontes, incluindo arquebactérias, eubactérias, fungos, plantas e mamíferos, e tem sido descrito como consistindo de duas ou quatro subunidades (Musrati et al. 1998, Brune et al. 2006).

Duas regiões ativas coincidentes foram observadas nos géis IGP tanto em folhas quanto em sementes que pareciam ser controladas por um locus e por dois alelos cada. O locus pgi-1 exibiu um padrão dimérico com bandas híbridas típicas de indivíduos heterozigotos e dois alelos. O locus anodal (pgi-2) mostrou um padrão de bandas típico de enzimas monoméricas. Embora um padrão monomérico de IGP tenha sido observado em microorganismos como Archaeoglobus fulgidus e Methanosarcina mazei (Hansen et al. 2005), esta enzima é geralmente dimérica (Cini et al. 1988, Tekamp-Olson et al. 1988, Sun et al. 1990, Brune et al. 2006). Os géis IDH de folhas e sementes demonstraram uma zona de atividade controlada por um locus (idh-1) com três alelos. A enzima IDH foi bem estudada em fungos e animais e é geralmente dimérica ou oligomérica (Brune et al. 2006); uma estrutura dimérica foi confirmada em plantas como Cucumis sativus (Watanabe et al. 2007) e a cerejeira (Granger et al. 1992). Os géis GOT mostraram duas regiões activas nas sementes e uma região activa nas folhas. A região anodal mostrou um padrão de duas bandas fixas que eram evidentes tanto nas folhas como nas sementes (got-2 e got-3). Uma região catodal ativa a partir de extratos de sementes mostrou apenas um único locus (got-1) com dois alelos e um padrão de banda dimérica. GOT allozymes são conhecidos por terem padrões diméricos em plantas (Kephart 1990).

Três regiões ativas foram observadas nos géis PER das folhas, e duas regiões ativas foram observadas nos géis das sementes. Embora os padrões de bandagem dos descendentes (sementes) concordassem com os das árvores (folhas), as comparações entre folhas e sementes não foram possíveis devido à má resolução da maioria dos indivíduos descendentes. Um padrão monomérico com um locus (per-1 e per-2) e dois alelos foi evidente em cada região anodal e intermediária de extratos de folhas, de acordo com os resultados de Brune et al. (2006). Cerejeiras demonstraram uma estrutura quaternária dimérica (Granger et al. 1992), mas foram observados monômeros em Cucumis sativus, Roystonea regia (Watanabe et al. 2007) e Allium sativum (Marzouki et al. 2005).

Três regiões ativas eram aparentes nos géis EST, e embora os números de loci e alelos fossem os mesmos para folhas e sementes, os padrões de bandagem não eram suficientemente claros em todos os indivíduos para permitir análises estatísticas. Um padrão monomérico foi observado com um locus e dois alelos em cada região anodal e intermediária, enquanto dois loci fixos foram observados na região catodal. A esterase é um dos sistemas enzimáticos mais polimórficos nas plantas (Weeden & Wendel 1990) e o sistema mais investigado no arroz (Endo & Morishma 1983), e as variantes monoméricas ou diméricas destas enzimas são geralmente encontradas nas plantas (Brune et al. 2006). No presente estudo, apenas os padrões de bandagem got-1, idh-1, pgi1, mdh-2, per-1 e per-2 loci foram clara e consistentemente observados nos géis e puderam ser usados para fins estatísticos. Os tamanhos das amostras e as frequências dos alelos dos loci polimórficos analisados são apresentados na tabela 3.

Faixas cromáticas sem padrões detectáveis de distribuição foram observadas com glicose desidrogenase (GDH), álcool desidrogenase (ADH) e glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Uma região ativa foi observada com um padrão fixo de bandas triplex nos géis progenitores de ADH; as bandas variaram em suas intensidades de cor, e as bandas migratórias mais lentas foram geralmente mais intensamente coloridas. Uma região ativa com um padrão fixo de cinco bandas consecutivas foi observada nos géis descendentes de GDH, com a terceira e quinta bandas mostrando intensidades de cor muito mais profundas. Os sistemas enzimáticos leucina aminopeptidase (LAP), fosfoglucomutase (PGM), shikimate desidrogenase (SKDH) e fosfatase ácida (ACP) eram monomórficos.

Surpresa, os testes de ajuste às proporções de HWE, e os testes de Fisher e χ2 não foram significativos para todos os sistemas de allozyme analisados nos diferentes tipos de tecidos e entre gerações (tabelas 4, 5). Deve-se notar, entretanto, que nos testes de HWE (como em qualquer outro teste estatístico) a incapacidade de rejeitar a hipótese nula não indica necessariamente a sua validade. É possível que as frequências genotípicas em populações onde não existem acasalamentos aleatórios sejam distribuídas de tal forma que imitem as distribuições multinomiais (Li 1988). Também é possível que fatores que causam desvios das expectativas de HWE levem a frequências genotípicas em direções opostas, com resultados finais não significativos entre os números de genótipos observados e os esperados (Workman 1969, Cavalli-Sforza & Bodmer 1971).

Os frutos maduros de S. adstringens são intensamente atacados por vários tipos de insetos, e poucas ou mesmo nenhuma semente é deixada em cada vagem (Branco et al. 2009), e não se sabe se existe um fator ambiental seletivo nesta predação ou se é direcional. Entretanto, como os frutos amostrados foram colhidos em seus estágios finais de maturação e as sementes usadas para estimar as frequências de alelos de progenitura não foram submetidas a nenhuma pressão seletiva putativa, isso pode ter levado a resultados não significativos. Poderia ser postulado que esses resultados seriam diferentes se apenas sementes maduras (que tivessem sido submetidas à pressão seletiva natural) tivessem sido utilizadas. Outro ponto que deve ser considerado é que a igualdade entre as frequências alélicas de machos e fêmeas foi presumida neste estudo. Assim, o HWE observado entre gerações poderia não ser real se as frequências de alelos entre os gametas masculinos e femininos fossem, de fato, diferentes. O outcrossing em populações com baixos tamanhos efetivos pode servir como mecanismo de acumulação de excesso de heterozigotos, com as frequências alélicas entre homens e mulheres em uma pequena população diferindo apenas por acaso (Balloux 2004, Souza et al. 2004) devido a processos de deriva que resultam em cruzamentos mais freqüentes entre indivíduos portadores de alelos diferentes.

Os maiores valores de diversidade genética e número efetivo de alelos por locus, o índice de fixação não significativo, e os ajustes das proporções HWE entre gerações observadas para os loci pgi-1, mdh-2 e idh-1 indicam acasalamento aleatório nessa população de S. adstringens. Os sistemas allozyme EST e PER foram mais claramente determinados no tecido foliar, enquanto os sistemas MDH, IDH, PGI, e GOT foram mais claramente determinados no tecido da semente.

Agradecimentos – Os autores agradecem à Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais (Fapemig) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro e pelas bolsas de Doutorado e Iniciação Científica; ao Instituto Estadual de Florestas (IEF); e ao Instituto de Ciências Agronômicas (ICA) da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Adams WT, Joly EJ. 1980. Genética das variantes allozyme em pinheiro loblolly. Diário de Hereditariedade 71:33-40.

Alfenas AC, Brune W. 1998. Eletroforese em gel de amido. In Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins: fundamentos e aplicações em plantas e microorganismos (AC Alfenas, ed.). Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.47-63.

Alfenas AC, Dusi A, Zerbini Júnior FM, Robinson IP, Micales JA, Oliveira JR, Dias LAS, Scortichini M, Pereira MCB, Bonde RB, Alonso SK, Junghans TG, Brune W. 2006. Eletroforese e marcadores bioquímicos em plantas e microorganismos. 2 ed., Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.85-148.

Almeida SP, Proença CEB, Sano SM, Ribeiro JF. 1998. Cerrado: espécies vegetais úteis. Embrapa-CPAC, Planaltina.

Balloux F. 2004. Heterozygote excess in small populations and heterozygote-excess effective population size. Evolution 58:1891-1900.

Barros MAG. 1982. Flora medicinal do Distrito Federal. Brasil Florestal 12:35-45.

Berg EE, Hamrick JL. 1997. Quantification of genetic diversity at allozyme loci. Canadian Journal of Forest Research 27:215-424.

Branco EA, Zimback L, Lima AB, Mori ES, Aoki H. 2009. Estrutura genética de populações de Stryphnodendron adstringens (Mart.). 4º Seminário de Iniciação Científica do Instituto florestal, 24 de junho de 2010. Instituto Federal – IF Série Registros 42-37.

Brown AHD, Moran GF. 1979. Isozymes and the genetic resources of forest trees. In Proceedings of the Symposium on Isozymes of North American Forest Trees and Forest Insects (MT Conkle, Technical Coord.). Pacific Southwest Forest and Range Experiment Station, Berkeley, p.1-10.

Brune W, Alfenas AC, Junghan, TG. 2006. Identificações específicas de enzimas em géis. In Eletroforese e marcadores bioquímicos em plantas e microrganismos (AC Alfenas, ed). Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.202-328.

Camillo J, Ciampi A, Vieira RF. 2001. Análise da variabilidade genética em barbatimão (Stryphnodendron adstringens) usando marcadores RAPD. In Anais do Encontro do Talento Estudantil da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 6, Brasília, DF. Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, p.50.

Cavalli-Sforza LL, Bodmer WF. 1971. The genetics of human populations. W.H. Freeman and Company, San Francisco.

Cini JK, Cook PF, Gracy RW. 1988. Molecular basis for the allozymes of bovine glucose-6-phosphate isomerase. Archives of Biochemistry and Biophysics 263:96-106.

Cruz CD. 2005. Princípios de genética quantitativa. Editora Universidade Federal de Viçosa – UFV, Viçosa, p.252-254.

Cullis CA. 1977. Aspectos moleculares da indução ambiental de alterações hereditárias no linho. Hereditariedade 38:129-154.

Endo T, Morishma, H. 1983. Arroz. Em Isozymes em genética e melhoramento vegetal (SD Tanksley, TJ Ortton, eds.). Elsevier, Amsterdam, parte B, p.129-146.

Granger AR, Clarke GR, Jacson JF. 1993. Sweet cherry identification by leaf allozyme polymorphism. Genética Teórica e Aplicada 86:458-464.

Hamrick JL, Godt MJW, Sherman-Broyles S. 1992. Factores que influenciam os níveis de diversidade genética nas espécies de plantas de madeira. New Forest 6:95-124.

Hansen T, Schlichting B, Felgendreher M, Schonheit PJ. 2005. As isomerases de fosfoglucose tipo cupin (Cupin-PGIs) constituem uma nova família de IGP metal-dependente, representando uma linha convergente de evolução da IGP. Journal of Bacteriology 187:1621-1631.

Har GE, Langston PJ. 1977. Localização cromossômica e evolução dos genes estruturais isozigotos no trigo hexaplóide. Hereditariedade 39:263-277.

Hirschmann GS, Arias AR. 1990. Um levantamento de plantas medicinais de Minas Gerais, Brasil. Journal of Ethnopharmacology 29:159-172.

Kelley WA, Adams RP. 1977. Variação sazonal de allozymes em Juniperius scopulorum: significância sistemática. American Journal of Botany 64:1092-1096.

Kephart SR. 1990. Electroforese de amido e gel de aluzimas de plantas uma análise comparativa de técnicas. American Journal of Botany 77:693-712.

Law GRJ. 1967. Fosfatase alcalina e associação de leucina aminopeptidase no plasma da galinha. Ciência 156:1106-1107.

>

Li CC, Horvitz DG. 1953. Alguns métodos de estimar o coeficiente de consanguinidade. American Journal of Human Genetics 5:107-117.

Li CC. 1988. Pseudo-acasalamento aleatório de populações. Em celebração do 80º aniversário da lei Hardy-Weinberg. Genetics 119:731-737.

Médico Sem Amor. 1992. Variação isoenzimática em árvores tropicais: padrões de organização genética. New Forests 6:67-94.

Marzouki SM, Limam F, Smaali MI, Ulber R, Marzouki MN. 2005. Uma nova peroxidase termoestável do alho Allium sativum: purificação, propriedades bioquímicas, imobilização e utilização na detecção de H2O2 no leite. Bioquímica Aplicada e Biotecnologia 127:201-214.

Melo Júnior TA, Vasconcelos MF, Fernandes GW, Marini MA. 2001. Distribuição e conservação de espécies de aves na Serra do Cipó, Minas Gerais, Brasil. Bird Conservation International 11:189-204.

Minas Gerais. Secretaria de Estado de Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável. Instituto Estadual de Florestas. http://www.ief.mg.gov.br/component/content/196?task=view (acessado em 2011 Fev 12).

Musrati RA, Kollárová M, Mernik N, Mikulásová D. 1998. Malate dehydrogenase: distribuição, função e propriedades. Fisiologia Geral e Biofísica 17:193-210.

Nei M. 1973. Análise da diversidade genética em populações subdivididas. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 70:3321-3323.

Ortiz PL, Arista M, Oliveira PE, Talavera S. 2003. Pattern of flower and fruit production in Stryphnodendron adstringens, an andromonoecious legume tree of Central Brazil. Plant Biology 5:592-599.

Pio Corrêa M. 1926. Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Imprensa Oficial, Rio de Janeiro, v.1.

Ramirez H, Calderon A, RoccaW. 1991. Técnicas moleculares para evaluar y mejorar el germoplasma vegetal. In Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones (W Rocca, L Mroginski, eds.). International Center for Tropical Agriculture – CIAT, Cali, p.825-856.

Rocha AMS, Moraes JAPV. 1997. Influência do estresse hídrico sobre as trocas gasosas em plantas jovens envasadas de Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal 9:41-46.

Saadi A. 1995. A geomorfologia da Serra do Espinhaço em Minas Gerais e de suas margens. Geonomos 3:41-63.

Shaw CR, Prasad R. 1970. Electroforese de enzimas em gel de amido: uma compilação de receitas. Genética Bioquímica 4:297-320.

Soltis DE, Haufler CH, Darrow DC, Gastony GJ. 1983. Electroforese em gel de amido de feto: uma compilação de amortecedores de moagem, amortecedores de gel e eléctrodos, e horários de coloração. Revista Americana de samambaia 73:9-27.

Sousa VA, Robinson IP, Hattemer HH. 2004. Variation and population structure at enzyme gene loci in Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. Silvae Genetica 53:12-19.

Sun AQ, Yuksel K, Jacobson TM, Grac RW. 1990. Isolamento e caracterização de isoformas isomerase de glucose-6-fosfato humano contendo duas subunidades de tamanho diferente. Archives of Biochemistry and Biophysics 283:120-129.

Tekamp-Olson P, Najarian R, Burke RL. 1988. O isolamento, caracterização e sequência nucleotídica do gene da fosfoglucoisomerase de Saccharomyces cerevisiae. Gene 73:153-161.

Watanabe L, Nascimento AS, Zamorano LS, Shnyrov VL, Polikarpov I. 2007. Purificação, cristalização e análise preliminar da difração de raios X da peroxidase da palmeira real (Roystonea regia). Acta Crystallographica, Secção F, Biologia Estrutural e Comunicações de Cristalização 63:780-783.

Weeden NF, Wendel JF. 1990. Genética de allozymes de plantas. Em Allozymes em biologia vegetal (DE Soltis, PS Soltis, eds.). Chapman and Hall, Londres, p.46-72.

Workman PL. 1969. A análise do polimorfismo genético simples. Biologia Humana 41:97-114.

Wright S. 1951. A estrutura geral das populações. Anais de Eugenia 15:323-354.