Îmbunătățirea fermentării L-arabinozei prin modificarea căii metabolice și a transportului în Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Calea de utilizare a L-arabinozei a fost stabilită în Saccharomyces cerevisiae, prin exprimarea genelor araA, araB și araD optimizate din punct de vedere al codonului din Lactobacillus plantarum. După supraexprimarea genelor TAL1, TKL1, RPE1, RKI1 și GAL2 și evoluția adaptivă, utilizarea L-arabinozei de către tulpina recombinantă a devenit eficientă. Tulpina rezultată a prezentat o rată specifică maximă de creștere de 0,075 h-1, o rată specifică maximă de consum de L-arabinoză de 0,61 g h-1 g-1 g-1 greutate celulară uscată și un randament promițător de etanol de 0,43 g-1 din fermentarea L-arabinozei.

1. Introducere

Pentru a reduce dependența de combustibilii fosili, producția mondială de bioetanol a crescut de la ~45 milioane de litri în 2005 la ~113 miliarde de litri în 2012 . Viitoarea producție pe scară largă de etanol combustibil se va baza, cel mai probabil, pe materiale lignocelulozice abundente în loc de zahăr și cereale, care sunt alimente pentru oameni și animale . Producția rentabilă de etanol-carburant din materiale lignocelulozice necesită utilizarea integrală a materiilor prime. Un obiectiv al producției de bioetanol este acela de a înzestra microorganismul de fermentare cu capacitatea de a transforma toate zaharurile din materialele lignocelulozice . Din materialele lignocelulozice se poate recupera aproximativ 3-15% din componenta L-arabinoză . Prin urmare, este necesar să se construiască un microorganism de fermentare a L-arabinozei pentru a crește utilizarea acestui zahăr .

Există două tipuri de căi metabolice ale L-arabinozei la ciuperci și bacterii. Aldose reductaza (AR), L-arabitol-4-dehidrogenaza (LAD), L-xiluloză reductaza (LXR) și D-xilitol dehidrogenaza (XDH) constituie calea metabolică fungică a L-arabinozei. Reacția catalizată de AR și LXR este cuplată cu oxidarea NADPH în NADP+, iar LAD și XDH utilizează NAD+ ca și cofactor . Xiluloza produsă este fosforilată și intră în calea pentoză-fosfat (PPP). Calea metabolică bacteriană a L-arabinozei este independentă de cofactor și este formată din L-arabinoză izomeraza (AraA), L-ribulokinaza (AraB) și L-ribuloză-5-fosfat 4-epimeraza (AraD). D-xiluloza-5-fosfat produs intră în PPP . Ambele căi metabolice ale L-arabinozei au fost stabilite în Saccharomyces cerevisiae, care este microorganismul tradițional producător de etanol, cu o capacitate excelentă de fermentare a zahărului și toleranță la mediul dur, dar care nu poate fermenta L-arabinoza . Nu este surprinzător faptul că apare un dezechilibru redox în tulpina S. cerevisiae recombinantă care conține calea metabolică fungică a L-arabinozei. Randamentul subprodusului L-arabitol a fost de până la 0,48 g g-1 de zahăr pentoză consumat în cofermentarea D-xilozei și L-arabinozei, deși tulpina care exprimă NADH a preferat AR și LXR pentru a diminua dezechilibrul redox .

În comparație cu calea metabolică fungică a L-arabinozei, calea bacteriană este mai simplă și independentă de cofactor. Cu toate acestea, din cauza lipsei unor teste de activitate eficiente pentru enzimele implicate în calea metabolică bacteriană a L-arabinozei, optimizarea acestei căi în S. cerevisiae nu a fost simplă. Tulpina S. cerevisiae care exprimă genele araA, araB și araD din Escherichia coli nu a putut utiliza L-arabinoza. Cu toate acestea, după ce gena izomerazei L-arabinozei din E. coli a fost înlocuită cu araA clonată din Bacillus subtilis, tulpina a putut crește și produce etanol pe L-arabinoză după mai multe cercuri de creștere adaptivă. În plus, utilizarea L-arabinozei a fost îmbunătățită și mai mult prin schimbarea codonului de utilizare a genelor bacteriene araA, araB și araD cu codonii preferați ai drojdiei. Genele metabolice ale L-arabinozei din Lactobacillus plantarum se potrivesc mai bine cu utilizarea codonilor din S. cerevisiae decât genele raportate anterior. Wisselink et al. au introdus mai multe copii ale genelor araA și araD și o singură copie a genului araB din L. plantarum în S. cerevisiae. După supraexprimarea genelor care codifică enzimele PPP neoxidative și o evoluție adaptativă extinsă, tulpina rezultată a prezentat un randament ridicat de etanol de până la 0,43 g-1 în timpul creșterii anaerobe pe L-arabinoză, cu o rată ridicată de consum de arabinoză (0,70 g h-1 g-1 g-1 greutate celulară uscată (DCW)). Metabolomul, transcriptomul și analiza fluxurilor metabolice ale unei tulpini mai evoluate au arătat că nivelurile mai ridicate de expresie ale izoenzimelor transportorului de galactoză, transcetolazei și transaldolazei sunt benefice pentru creșterea S. cerevisiae pe L-arabinoză .

În lucrarea de față, genele unice araA, araB și araD optimizate pentru codon din L. plantarum au fost exprimate în tulpina S. cerevisiae CEN.PK102-3A la diferite niveluri. Apoi, genele TAL1, TKL1, RPE1 și RKI1 implicate în PPP au fost supraexprimate în această tulpină recombinantă. Tulpina rezultată a fost selectată secvențial pe L-arabinoză în condiții aerobe și în condiții de limitare a oxigenului. S-a obținut o tulpină cu o capacitate de utilizare a L-arabinozei semnificativ îmbunătățită. A fost investigată capacitatea metabolică de L-arabinoză a tulpinilor evoluate și a tulpinii care a supraexprimat, de asemenea, gena transportoare GAL2. Sunt discutați factorii care afectează eficiența metabolismului L-arabinozei.

2. Materiale și metode

2.1. Mediile și condițiile de cultură

Mediul complet sintetic de drojdie (SC) care conține 1,7 g L-1 bază de azot de drojdie (YNB, Sangon, China) și 5 g L-1 sulfat de amoniu (Sangon, China), cu surse suplimentare de carbon de glucoză (Sangon, China) sau L-arabinoză (Sinopharm, China), a fost utilizat pentru cultivarea drojdiei. Amestecul complet de suplimente, 0,77 g L-1 CSM-URA sau 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), a fost adăugat pentru a menține plasmidele necesare cu selecție auxotrofă atunci când a fost necesar. Pentru tulpinile cu markerul KanMX4, mediul a fost alimentat cu 200 g mL-1 de sulfat de antibiotic G418 (Promega, Madison, WI, SUA). Toate drojdiile au fost cultivate la 30°C.

2.2. Analiza indicelui de adaptare a codonilor

Indicele de adaptare a codonilor (CAI) este utilizat pentru a ilustra preferința de utilizare a codonilor la anumite specii . Pentru analiza CAI, a fost utilizat CODONW (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw).

2.3. Construcția plasmidului și a tulpinii

Pentru subclonare s-a folosit E. coli DH5. Tulpinile S. cerevisiae și plasmidele utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelul 1. Amorsele utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelul 2.

Genele unice araA, araB și araD optimizate pentru codon care codifică L-arabinoza izomeraza (GenBank: CCC80517.1), L-ribulokinaza (GenBank: CCC80519.1) și L-ribuloza-5-fosfat 4-epimeraza (GenBank: CCC80518.1) de la L. Plantarum au fost sintetizate artificial și ligaturate între promotorul HXT7 și secvențele de terminare PGK1 din plasmidul pHX, care a fost construit prin înlocuirea PGK1p din plasmidul YEp24-PGKp cu HXT7p, conținând situsuri pentru enzimele de restricție Kpn I și Sma I. Fragmentul HXT7p-araD-PGK1t a fost amplificat prin PCR cu situsuri terminale pentru enzimele de restricție Hind III și Bln I și apoi inserat în situsurile Hind III și Nhe I din YIp5, rezultând plasmidul YIp5-araD. Fragmentul HXT7p-araA-PGK1t care conține situsurile terminale Bgl II și Sal I a fost inserat în situsurile BamH I și Sal I din YIp5-araD, rezultând plasmidul YIp5-araAD. Fragmentul HXT7p-araB-PGK1t cu situsurile Eag I și Stu I a fost inserat în situsurile Eag I și Stu I din YIp5-araAD, rezultând plasmidul YIp5-ara [figura 1(a)]. Fragmentul promotor TEF1 (cu situsuri terminale pentru Hind III și Sal I) și fragmentul terminator PGK1 (cu situsuri terminale pentru BamH I și Hind III) au fost clonate din plasmidele pJFE3 și, respectiv, pYMIKP . Aceste două fragmente au fost ligaturate și inserate în plasmidul pYX242 pentru a construi un vector, pYX242-WS, cu două situsuri care pot fi utilizate pentru a exprima gene. Apoi, gena araA a fost inserată între situsurile Sal I și Sac I ale acestui vector sub controlul promotorului TEF1 și al terminatorului PloyA pentru exprimarea sa, iar plasmidul rezultat a fost denumit pYX2422-TEF1araA (figura 1(b)). Plasmidul pYX2422-HXT7araA (figura 1(b)) a fost construit folosind fragmentul de HXT7p pentru a deplasa fragmentul TEF1p din plasmidul pYX2422-TEF1araA; îmbinările au fost secvențele de recunoaștere BamH I și Sal I. Gena GAL2 a fost clonată din ADN-ul cromozomal al CEN.PK102-3A și apoi inserată în situsurile Xba I și Sal I ale plasmidului pJFE3, rezultând plasmidul pJFE3-GAL2. Fragmentul URA3 din plasmidă pJFE3-GAL2 între situsurile Nde I și Apa I a fost înlocuit cu gena KanMX4 clonată din pUG6 , rezultând plasmidă pJFE318-GAL2 [figura 1(c)].

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figura 1

Hărțile fizice ale plasmidelor (a) YIp5-ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA, și (c) pJFE318-GAL2.

Transformarea drojdiei a fost realizată prin metoda de transformare cu acetat de litiu . Plasmidul YIp5-ara a fost liniarizat la situsul Stu I și apoi transformat în CEN.PK102-3A. Transformanții cu genele araA, araB și araD integrate în gena cromozomială URA3 au fost selectați în mediu SC conținând CSM-URA și, după ce a fost confirmat prin secvențiere, transformantul dorit a fost numit BSW1A1. Plasmidele pYX242, pYX2422-HXT7araA și pYX2422-TEF1araA au fost transformate în BSW1A1, rezultând BSW1AY, BSW1A7 și, respectiv, BSW1AT. PJPPP3 liniarizat, care conține cadrele de expresie ale genelor TAL1, TKL1, RPE1 și RKI1 , a fost integrat în cromozomul BSW1AT la nivelul locusului genei GRE3, rezultând tulpina BSW2AP. Tulpina BSW2AP a fost adaptată la 20 g L-1 L-arabinoză în condiții aerobe și apoi în condiții de oxigen limitat. Odată ce a fost atinsă faza staționară, a fost inițiat un nou lot prin transferarea culturii în mediu proaspăt cu o biomasă inițială de 0,15 g DCW L-1. Când timpul de dublare al tulpinii s-a stabilizat, mutantul BSW3AP a fost selectat dintre mutanții adaptați pe baza creșterii sale excelente pe L-arabinoză. Plasmidul pJFE318-GAL2 a fost apoi transformat în tulpina BSW3AP, rezultând tulpina BSW3AG.

2.4. PCR cantitativă în timp real

Celele au fost cultivate în mediu SC care conținea 20 g L-1 de glucoză și au fost colectate atunci când OD600 a culturilor a ajuns la 1. ARN-ul total a fost extras cu ajutorul reactivului TRIzol (Sangon, China). Primul șir de ADNc a fost transcris invers din 1 g de ARN total folosind kiturile de reactivi PrimeScript RT cu gDNA Eraser (Takara, Japonia). Produsele de ADNc diluate au fost utilizate pentru PCR cantitativă în timp real folosind SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japonia) și LightCycle PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Germania). Gena care codifică actina ACT1 a fost utilizată ca genă de referință pentru normalizare. Datele PCR în timp real au fost calculate în conformitate cu metoda . Amorsele pentru aceste PCR au fost enumerate în tabelul 2.

2.5. Fermentare

O singură colonie a fost cultivată peste noapte în mediu SC care conținea 20 g L-1 glucoză. O probă din cultura de peste noapte a fost diluată până la o OD600 inițială de 0,5 în mediu SC care conține 10 g L-1 glucoză și 10 g L-1 L-arabinoză. După 10 ore de cultivare, celulele au fost colectate și utilizate pentru fermentare. Toate fermentările au fost efectuate la 30°C, la 200 r min-1 , în flacoane cu agitator de 200 ml care conțineau 40 ml de mediu. Condiția limitată de oxigen a fost menținută cu ajutorul unui dop de cauciuc. Fermentațiile discontinue în condiții anaerobe au fost efectuate în fermentatoare de 1,4 L (Infors AG, Elveția) cu un volum de lucru de 900 ml. Condițiile anaerobe au fost menținute prin pulverizare cu azot (0,1 L min-1); viteza de agitare a fost de 500 r min-1. pH-ul a fost menținut la 5,0 prin pomparea automată a 1 mol L-1 NaOH și 1 mol L-1 H3PO4 . Biomasa inițială a fost de 0,2 g DCW L-1. Sursa de carbon în mediul SC plus CSM-LEU-URA a fost 20 g L-1 L-arabinoză; 200 g mL-1 G418 a fost furnizat în fermentația tulpinii BSW3AG. Greutatea celulară uscată a tulpinilor evoluate și a tulpinilor neevoluate a fost calculată conform formulei greutate uscată (mg mL-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 și, respectiv, greutate uscată (mg mL-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149.

2.6. Analiza produselor de fermentare

Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japonia) echipată cu detectorul de indice de refracție RID-10A (Shimadzu, Japonia) a fost utilizată pentru a determina concentrațiile de zaharuri și metaboliți. Coloana schimbătoare de ioni Aminex HPX-87P (Bio-Rad, SUA) a fost utilizată pentru a analiza L-arabinoza, arabitolul și etanolul la 80°C cu o fază mobilă de apă la un debit de 0,6 ml min-1. Coloana schimbătoare de ioni Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, SUA) a fost utilizată pentru a analiza glicerolul și acetatul la 45°C, folosind ca fază mobilă H2SO4 de 5 mmol L-1 .

3. Rezultate

3.1. Expresia genelor cu codon optimizat implicate în calea L-arabinozei în S. cerevisiae

Pe baza secvenței de aminoacizi a L-arabinozei izomerazei (nr. de acces GenBank CCC80517.1), L-ribulokinazei (nr. de acces GenBank CCC80519.1) și L-ribuloză-5-fosfat 4-epimerază (nr. de acces GenBank CCC80518.1) înregistrate în National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), genele araA, araB și araD din L. plantarum au fost sintetizate artificial folosind codonii preferați din S. cerevisiae. CAI ale araA, araB și araD optimizate prin codon au fost de 0,599, 0,580 și, respectiv, 0,646, care au fost mai mari decât cele ale secvențelor native (0,324, 0,223 și 0,243, respectiv).

Casetele de expresie ale araA, araB și araD optimizate din punct de vedere al codonului au fost integrate în cromozomul tulpinii CEN.PK102-3A, rezultând tulpina BSW1A1. Cu toate acestea, BSW1A1 nu a putut crește pe L-arabinoză, deși ARNm transcris al acestor gene a fost detectabil. Apoi, mai multe copii ale araA au fost introduse în BSW1A1, transportate de plasmidă episomală pYX242 și exprimate sub controlul promotorilor HXT7 și TEF1. Nivelurile de transcripție ale araA în tulpinile rezultate, BSW1A7 și BSW1AT, au fost de – ori și de – ori mai mari decât în tulpina de referință BSW1AY care poartă doar araA integrată și exprimată. Tulpinile BSW1A7 și BSW1AT au fost incubate aerob pe L-arabinoză, iar creșterea tulpinii BSW1AT a fost observată după aproximativ 150 de ore, în timp ce BSW1A7 nu a putut crește chiar dacă a fost cultivată mai mult timp.

3.2. Îmbunătățirea utilizării L-arabinozei la S. cerevisiae prin inginerie și evoluție

Genele TAL1, TKL1, RPE1 și RKI1 implicate în calea neoxidativă a pentozei fosfat au fost supraexprimate într-o singură colonie izolată din cultura BSW1AT de 150 h prin integrarea plasmidului liniarizat pJPPP3 în cromozom. Tulpina rezultată, BSW2AP, a evoluat pe L-arabinoză. După 9 transferuri în condiții aerobe și 12 transferuri în condiții de oxigen limitat, timpul de dublare a culturii a scăzut de la 22 h la 4,5 h. Mutanții au fost analizați pe plăci cu L-arabinoză, iar o colonie mare a fost selectată și numită BSW3AP.

Nivelurile de transcripție ale genelor din tulpinile recombinate BSW1AT, BSW2AP și BSW3AP au fost determinate prin PCR cantitativă în timp real (figura 2). Nivelul de expresie al araA în BSW2AP a fost de 2 ori mai mare decât în BSW1AT, în timp ce nivelurile de expresie ale araB și araD în BSW2AP au fost mai scăzute. Aceste modificări s-ar putea datora mutațiilor care au apărut în timpul cultivării BSW1AT pe L-arabinoză. În tulpina evoluată BSW3AP, toate cele trei gene au fost exprimate la niveluri ridicate. Nivelurile de expresie araA, araB și araD în BSW3AP au fost de 4,1 ori, 1,6 ori și, respectiv, de 2,5 ori mai mari decât cele din tulpina BSW1AT.

Figura 2

Expresia araA (bare negre), araB (bare gri) și araD (bare goale) din tulpinile BSW2AP și BSW3AP în comparație cu tulpina BSW1AT. Modificările fold-changes ale nivelurilor ARNm ale acestor gene sunt normalizate la expresia ACT1. Tulpinile testate au fost cultivate pe 20 g L-1 de glucoză. Valorile indicate sunt obținute din trei măsurători independente.

Utilizarea L-arabinozei de către tulpinile BSW1AT, BSW2AP și BSW3AP a fost comparată în flacoane cu agitator în condiții de limitare a oxigenului (figura 3); OD600 inițială a fost de 0,5. Nu s-a observat nicio creștere a tulpinii BSW1AT în 120 de ore. Tulpina BSW2AP a crescut pe L-arabinoză cu o rată de creștere specifică maximă () de 0,011 h-1; s-a consumat 4,4 g L-1 L-arabinoză și s-a produs 1,2 g L-1 etanol în 120 de ore de fermentare. În schimb, cea a tulpinii BSW3AP, care a evoluat, a crescut la 0,23 h-1. După 120 de ore de fermentare, au fost consumate 18,6 g L-1 L-arabinoză cu o rată maximă de consum specific de 0,7 g h-1 g-1 DCW; au fost produse 6,9 g L-1 etanol, iar randamentul etanolului a fost de 0,43 g g-1; s-au acumulat doar 0,13 g L-1 L-arabitol.

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 3

Cealaltă L-fermentația arabinozei a tulpinilor în flacoane shaker. Capacitatea de creștere (a), consumul de L-arabinoză (b), formarea de arabitol (c) și formarea de etanol (d) de către BSW1AT (▲), BSW2AP (■) și BSW3AP (). Tulpinile au fost cultivate în 40 ml de mediu SC cu 20 g L-1 L-arabinoză la 30°C, la 200 r min-1 , cu o DO600 inițială de 0,5. Datele reprezintă mediile a trei experimente independente.

3.3. Supraexprimarea GAL2 a îmbunătățit fermentarea anaerobă a L-arabinozei la tulpina evoluată

Gena galactoză permează GAL2 a fost supraexprimată în BSW3AP, rezultând tulpina BSW3AG. Au fost studiate proprietățile de fermentare anaerobă a L-arabinozei de către tulpina BSW3AP și BSW3AG (figura 4 și tabelul 3) în bioreactoare. Tulpina BSW3AP a crescut pe L-arabinoză cu o rată de creștere specifică maximă de 0,067 h-1. Rata maximă de consum specific de L-arabinoză a fost de 0,49 g h-1 g-1 DCW. Etanolul a fost produs la o rată specifică maximă de 0,20 g h-1 g-1 g-1 DCW cu un randament de 0,42 g-1. Supraexprimarea GAL2 a îmbunătățit semnificativ capacitatea de fermentare a L-arabinozei. Rata maximă de creștere specifică a BSW3AG a fost de 0,075 h-1, cu 12% mai rapidă decât cea a BSW3AP. Rata specifică de consum de L-arabinoză a BSW3AG a fost de 0,61 g h-1 g-1 DCW, cu 24% mai rapidă decât cea a BSW3AP. Rata de producție a etanolului a fost de 0,27 g h-1 g-1 DCW, iar randamentul etanolului a fost de 0,43 g g-1. În plus, atât BSW3AP, cât și BSW3AG au produs cantități mici de glicerol (1,4 g L-1 pentru ambele tulpini) și cantități aproape nedetectabile de arabitol și acetat.

Strain μ max (h-1) Straina maximă specifică L-arabinoză consumată (g h-1 g-1 DCW) Taxa de producție a etanolului (g h-1 g-1 DCW) Câștigul de etanol (g-1 L-arabinoză consumată) BSW3AP 0.067 0,49 0,20 0,42 BSW3AG 0,075 0,61 0,27 0,27 0.43

Tabelul 3

Ratele specifice maxime de creștere (), rata specifică maximă de consum de L-arabinoză, rata de producere a etanolului și randamentul de etanol pentru BSW3AP și BSW3AG cu 20 g L-1 L-arabinoză.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figura 4

Fermentația anaerobă discontinuă a BSW3AP (a) și BSW3AG (b) pe 20 g L-1 arabinoză. Nivelurile de (■), arabinoză (◆), etanol (▲), glicerol () și acetat (×). Fermentația a fost efectuată în fermentoare de 1,4 L cu un volum de lucru de 900 ml. Condițiile anaerobe au fost menținute prin pulverizare de azot (0,1 L min-1); viteza de agitare a fost de 500 r min-1. pH-ul a fost menținut la 5,0 prin pomparea automată a 1 mol L-1 NaOH și 1 mol L-1 H3PO4. Biomasa inițială a fost de 0,2 g DCW L-1. 20 g L-1 L-arabinoză a fost utilizată ca sursă de carbon în mediul SC plus CSM-LEU-URA, iar în fermentația tulpinii BSW3AG s-a furnizat 200 g mL-1 G418. Datele reprezintă media determinărilor în dublu exemplar.

4. Discuții

Conversia completă a zaharurilor este importantă pentru producerea eficientă și rentabilă a etanolului combustibil din materiale lignocelulozice. Chiar și mici îmbunătățiri în utilizarea substratului pot scădea semnificativ costurile întregului proces . L-arabinoza este o componentă importantă a materialelor lignocelulozice. Expresia căii L-arabinozei din L. plantarum s-a dovedit a fi eficientă în construcția de L-arabinoză care utilizează S. cerevisiae . Având în vedere că genele optimizate din punct de vedere al codonului ar putea duce la o expresie crescută a proteinelor, în lucrarea de față, genele originale araA, araB și araD din L. plantarum au fost modificate pentru a corespunde codonului utilizat de S. cerevisiae și apoi integrate în cromozomul tulpinii CEN.PK102-3A. Cu toate acestea, această tulpină recombinantă nu a putut crește pe L-arabinoză. Mai multe copii ale genei araA au fost apoi introduse în tulpina recombinantă sub controlul promotorilor HXT7 și TEF1. Atunci când cele două tulpini rezultate au fost cultivate pe L-arabinoză, creșterea a fost observată numai în culturile tulpinii care exprimă araA sub controlul promotorului TEF1, în care nivelul transcripțional al araA a fost de 1,4 ori mai mare decât în tulpina care exprimă araA controlată de promotorul HXT7. Sugerăm că numai atunci când nivelul de transcripție al araA este mai mare decât un anumit nivel poate avea loc creșterea pe L-arabinoză. În schimb, doar o singură copie a araB și araD a fost introdusă în această tulpină recombinantă, iar nivelurile de transcripție ale acestor gene au fost mai mici decât în tulpina parentală. Aceste fenomene indică faptul că araB și araD sunt mai puțin importante pentru creșterea pe L-arabinoză, deoarece doar o singură copie a acestor gene a permis tulpinii recombinate să crească pe L-arabinoză.

Evoluția adaptivă s-a dovedit a fi o metodă puternică pentru a spori eficiența metabolică a tulpinilor . În studiul de față, tulpina evoluată BSW3AP prezintă o capacitate de metabolizare a L-arabinozei semnificativ îmbunătățită. Nivelurile crescute de transcripție ale tuturor celor trei gene (araA, araB și araD) ar putea contribui la această îmbunătățire. În comparație cu araA și araD, nivelul de expresie al araB a fost mai scăzut. Becker și Boles au raportat că un mutant pe L-arabinoză a diminuat activitatea L-ribulokinazei exprimată de araB. Expresia relativ mai scăzută a araB evită supraconsumul de ATP, ceea ce ar fi benefic pentru creșterea tulpinii pe L-arabinoză.

L-arabinoza este o nouă sursă de carbon pentru S. cerevisiae. Absorbția L-arabinozei în S. cerevisiae depinde în principal de transportul nespecific de către transportorul de hexoză Gal2p. Hxt9p și Hxt10p pot, de asemenea, transporta L-arabinoză, dar eficiența este foarte scăzută. S-a raportat că supraexprimarea GAL2 îmbunătățește utilizarea L-arabinozei. În acest studiu, supraexprimarea GAL2 a crescut considerabil rata de creștere și rata de consum de L-arabinoză a tulpinii noastre evoluate BSW3AP. Acest rezultat a sugerat că fluxul metabolic teoretic al L-arabinozei a fost mai mare decât cel pe care l-am detectat la BSW3AP. Utilizarea L-arabinozei de către BSW3AP a fost limitată de rata sa de absorbție. Atunci când GAL2 a fost supraexprimat, o cantitate mai mare de Gal2p în membrana plasmatică a dus la o absorbție crescută a L-arabinozei și apoi a promovat utilizarea L-arabinozei. Rezultatul nostru a confirmat în continuare importanța transportatorilor pentru utilizarea L-arabinozei; cu toate acestea, afinitatea Gal2p pentru L-arabinoză este scăzută, iar glucoza a inhibat în mod competitiv legarea sa la L-arabinoză . Îmbunătățirea eficienței transportatorului specific L-arabinozei rămâne să fie realizată.

5. Concluzii

Cu mai multe etape de inginerie genetică și evoluție adaptativă, am obținut tulpina BSW3AG, care crește pe L-arabinoză cu o a de 0,075 h-1. Rata maximă specifică de consum de L-arabinoză este de 0,27 g h-1 g-1 DCW, iar randamentul maxim de etanol este de 0,43 g-1 L-arabinoză consumată, ceea ce reprezintă 84,3% din cantitatea teoretică. Un nivel ridicat de expresie araA este deosebit de important pentru stabilirea unei căi eficiente de L-arabinoză în S. cerevisiae, iar pentru îmbunătățirea capacității de absorbție a L-arabinozei de către tulpinile evoluate sunt necesari transportatori mai eficienți.

Conflict de interese

Autorii declară că nu au niciun conflict de interese.

Recunoștințe

Această lucrare a fost susținută de Programul Național de Cercetare Fundamentală Cheie (2011CB707405), de Programul Național de Cercetare și Dezvoltare de Înaltă Tehnologie al Chinei sub Grant (2012AA022106), de Fundația Națională de Științe Naturale a Chinei (30970091, 31070096 și 31270151) și de Programul de Cooperare Internațională S&T al Chinei (2010DFA32560). Autorii îi mulțumesc Dr. Peter Kötter de la Universitatea Johann Wolfgang Goethe din Frankfurt pentru tulpina CEN.PK102-3A.

.