Înțelegerea bazei structurale a restricției HIV-1 de către APOBEC3G cu domeniu dublu pe toată lungimeadomain APOBEC3G

Caracteristici structurale generale ale fl rA3G

Un obstacol major în studiile structurale ale proteinelor APOBEC cu dublu domeniu fl a fost solubilitatea slabă – formele de tip „wild-type” sunt adesea purificate fie ca oligomeri neomogeni, fie ca agregate mari la concentrații mai mari. Pentru a obține A3G fl A3G cu un comportament bun pentru determinarea structurală, am analizat omologii A3G de la diferite specii de primate și am descoperit că A3G de la maimuța rhesus (rA3G) are o solubilitate îmbunătățită. Două construcții cu mutații fl rA3G (denumite FKL și E/Q) au produs proteine bine comportate și cristale în condiții diferite (tabelul suplimentar 1) care au difractat la 2,47 și, respectiv, 2,40 Å (tabelele suplimentare 1 și 2, figura suplimentară 1). Modificări suplimentare în aceste două construcții au îmbunătățit solubilitatea și randamentul rA3G, inclusiv înlocuirea unei bucle 8 a CD1 cu 8 resturi de CD1 cu bucla 8 cu 4 resturi din hA3G-CD2 (la fel ca în ambele construcții E/Q și FLK, tabelul suplimentar 1, figura suplimentară 1, figura suplimentară 1). 1), alte mutații F126Y pe bucla 7 a CD1, K180S/L184S pe CD1 h6 și eliminarea a 8 resturi din bucla 3 a CD2 (ca în construcția FKL, tabelul suplimentar 1, figura suplimentară 1B). Trebuie remarcat faptul că K128 din rA3G care acționează ca barieră pentru transmiterea între specii este mutat într-un reziduu de acid aspartic (D128) ca în A3G uman (hA3G)36. Construcțiile conțin, de asemenea, mutația catalitică E259 în Q/A pentru a evita potențiala toxicitate în timpul exprimării proteinei recombinante. Reziduurile mutate și locațiile lor pe structură sunt prezentate în figura suplimentară 1B. În ambele structuri, CD1 și CD2 sunt pliate în domenii de sine stătătoare conectate printr-un linker scurt de 5 reziduuri (reziduurile R194 până la D198) (Fig. 1a, b). Cele două structuri, în ciuda similitudinii structurale generale (Fig. 1a, b), prezintă diferențe evidente în conformațiile CD2 și în orientarea de împachetare între CD1 și CD2 (Fig. 1c, Fig. suplimentară 2A).

Atât structurile rA3G FKL, cât și E/Q au aceeași structură canonică CD1 și se suprapun bine una peste cealaltă (Fig. suplimentară 2B, rmsd de 0,445 Å). Diferențele conformaționale mult mai mari în fiecare domeniu CD2 determină o suprapunere rmsd de 0,862 Å. Atunci când se aliniază structurile FKL și E/Q prin intermediul domeniului lor CD1, domeniul CD2 al structurii E/Q prezintă o rotație de ~29° în comparație cu domeniul CD2 al structurii FKL, ceea ce face ca domeniul CD2 al structurii E/Q să se deplaseze ~15 Å în jos și ~8 Å spre CD1, ceea ce duce la o interacțiune de împachetare mult mai strânsă cu CD1 (figura suplimentară 2 A). Interfața globală de împachetare CD1-CD2 are o suprafață îngropată de ~623 Å2 pentru structura FKL și ~700 Å2 pentru structura E/Q. Împachetarea mai strânsă CD1-CD2 în structura E/Q conduce doar la o suprafață îngropată puțin mai mare decât în structura FKL, probabil din cauza replierei și a densității lipsă a elementelor structurale de localizare a interfeței (h2-loop3) a CD2 sale.

Două tipuri de interacțiuni ale domeniilor CD1 și CD2

În timp ce structura FKL prezintă o pliere canonică a domeniului său CD2 (Fig. suplimentară 2C), structura E/Q prezintă o alterare semnificativă a conformației CD2 (Fig. suplimentară 2D), cu modificări majore pe helixul 2 (h2), bucla 3, bucla 4 și centrul activ Zn. Lungul h2 al CD2 din structura FKL (Fig. Suplimentară 2C) a devenit un scurt 310 helix (h2′) în structura E/Q (Fig. Suplimentară 2D), rezultând o întindere dezordonată de 14 resturi care acoperă părți din bucla 3 și h2 (reziduurile A246 – E259) (Fig. Suplimentară 1A). Trecerea la o structură scurtă 310 h2 și la o structură de bobină aleatorie extinsă este necesară pentru a evita ciocnirile în această conformație de împachetare strânsă (Fig. 1e). Cu toate acestea, acest lucru perturbă, de asemenea, conformația centrului activ de Zn al CD2 în regiunile de h2 și bucla 3 care devin dezordonate, ceea ce duce la lipsa coordonării Zn (Fig. suplimentară 2D). Absența coordonării Zn este observată doar într-un singur alt APOBEC, structura CD2 APOBEC3F (A3F)46,47. Cu toate acestea, structurile A3F-CD2 care conțin Zn sau sunt absente sunt în esență identice, care, de asemenea, se aliniază bine cu alte câteva structuri APOBEC (Fig. Suplimentară 2E), în timp ce CD2 E/Q este unic prin buclele h2 refulate 3 și 4 și prin conformația Zn-centru (Fig. Suplimentară 2E). 2E, F).

În timp ce este posibil ca pierderea de Zn și replierea CD2 în structura E/Q să fie rezultatul mutațiilor din această construcție, am investigat dacă varianta E/Q are o activitate de cataliză defectuoasă. Reversia E259Q în construcția E/Q înapoi la E259 catalitic WT (construcția E/Q*) a readus varianta la o activitate completă în testul de dezaminare folosind lizate de expresie a celulelor HEK293T (figura suplimentară 3). În plus, E/Q* purtând mutațiile individuale F126Y, K180S/L184S sau CD2Δloop3 (ca în structura FKL) sunt toate active, chiar dacă activitatea construcției FKL* (cu E259A readus la E259) cu mutațiile combinate este mai mică decât cea a E/Q* și WT. Aceste rezultate sugerează că, deși structura E/Q cristalizată E/Q, lipsită de Zn în domeniul CD2, reprezintă o stare structurală A3G inactivă din punct de vedere catalitic, revenirea reziduului catalitic la E259 poate restabili pe deplin activitatea deaminazei sale comparabilă cu cea a WT. Mutațiile combinate în FKL îi afectează parțial activitatea catalitică.

Datorită diferenței de ~29° în unghiul relativ de rotație în împachetare între fiecare domeniu în structurile FKL și E/Q, interacțiunile moleculare detaliate dintre CD1 și CD2 diferă între cele două structuri. Domeniile CD1 și CD2 din structura FKL interacționează între ele în principal prin h3, h4 și bucla 7 a CD1 și h1, h2, β2 și bucla 3 a CD2 (Fig. 1a, d). În structura E/Q, cele două domenii interacționează în principal prin h3, h4 și h6 din CD1 cu h2′, β2, bucla 4 și bucla 10 din CD2 (Fig. 1b, e). Ca urmare, aproximativ 40 % din reziduurile care interacționează între CD1 și CD2 diferă în cele două structuri (a se vedea o listă completă a reziduurilor care interacționează în Fig. suplimentară 4) și, chiar și atunci când aceleași reziduuri participă la această interacțiune, acestea realizează adesea contacte de legătură diferite din cauza modificării unghiului de împachetare dintre cele două domenii. Capacitatea de împachetare a domeniilor CD1 și CD2 cu unghiuri și interacțiuni diferite ale reziduurilor indică un anumit grad de plasticitate în aranjamentul domeniilor fl A3G.

Dimerul rA3G în lungime completă și caracteristicile zonei de dimerizare

Construcția E/Q a fost cristalizată în diferite condiții de pH și sare (tabelul suplimentar 1), dar a prezentat în mod constant aceeași structură și dimerizare prin interacțiuni CD1-CD1 (Fig. 2a, b), în principal prin împachetarea directă a mai multor reziduuri de pe h6 (K180, L184, A187), bucla 1 (I26) și bucla 7 (F126, W127) din ambele subunități (Fig. suplimentară 5A, B). Este interesant faptul că aceste interacțiuni sunt identice cu cele raportate anterior pentru domeniul rA3G-CD1 singur18, în ciuda includerii mutației K128D care este esențială pentru transformarea rA3G din insensibil la Vif HIV-1 în sensibil la degradare. Este demn de remarcat faptul că o astfel de dimerizare a fl rA3G duce doar la o mică creștere a celei mai mari dimensiuni de la 85 Å a unui monomer la 95 Å a unui dimer (Fig. 2a, b).

O examinare detaliată a reziduurilor aliniate de o parte și de alta a zonei de interfață dimerică relevă două caracteristici importante. În primul rând, un total de 18 reziduuri pozitive/polare și hidrofobe sunt aliniate în jurul joncțiunii dimerului rA3G într-un mod adecvat pentru interacțiunea cu acizii nucleici monocatenari, cum ar fi ARN-ul (Inset B din Fig. 2). Aceste 18 reziduuri sunt organizate în două seturi, cu primul set în sensul acelor de ceasornic pornind de la monomerul superior (în verde), R24, H181, N177, N176, K180, și continuând cu monomerul inferior (în albastru deschis) W127, Y125, Y124 și S28, și apoi cu setul în oglindă al acelorași reziduuri. În al doilea rând, prin dimerizare, R24 și reziduurile pozitive apropiate K180 și H181 din fiecare monomer sunt poziționate strâns în spațiu, cu o distanță de aproximativ 7 Å între cele două reziduuri R24. Această dispunere spațială sporește semnificativ potențialele electrostatice locale (EP) de la aproximativ +1,9 kT/e ca monomer la +8,3 kT/e ca dimer (Fig. 2c și Inset C, Fig. 2d și Inset D). Prezența reziduurilor bine aliniate adecvate pentru legarea acizilor nucleici monocatenari, precum și PEP pozitiv îmbunătățit (PEP) în jurul joncțiunii dimerice observate implică puternic faptul că această zonă poate lega ARN ca dimer și sugerează că întreruperea acestei interfețe de dimerizare A3G poate avea un impact asupra legării ARN prin întreruperea PEP îmbunătățit (Fig. 2c) la PEP scăzut ca într-o formă monomerică (Fig. 2d).

Efectul mutației dimerului asupra asocierii cu ARN și multimerizării

Studiul nostru anterior privind doar domeniul CD1 a sugerat că reziduurile FWKL (F126, W127, K180, L184) ale interfeței dimerului pot fi implicate atât în dimerizare, cât și în legarea ARN, fie prin interacțiune directă cu ARN, fie indirect prin generarea unei suprafețe de legare a ARN prin dimerizare18. Inspectarea structurii dimerului fl rA3G arată că, în timp ce reziduurile FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) participă în mod direct la interacțiunile de dimerizare (Fig. suplimentară 5A), numai W127 este accesibil pentru pi-stacking sau pentru legătura de hidrogen cu o bază de acid nucleic, sugerând că W127 este cel care are un dublu rol critic în dimerizare sau/și în legarea ARN, ceea ce a fost sugerat și de studiile anterioare de mutație15,18,40,48.

Bucla 7 a rA3G este situată în apropierea interfeței de dimerizare și conține un set de reziduuri hidrofobe (Y124, Y125 și F126) care se împachetează cu W127 și probabil îl stabilizează (Fig. Suplimentară 5B). Pentru a analiza dacă dimerizarea este necesară pentru asocierea ARN și pentru a lua în considerare, de asemenea, posibilul rol dublu al lui W127, am proiectat un set de mutanți ai interfeței de dimerizare a rA3G care au lăsat buclă 7 neschimbată (Tabelul suplimentar 3, Fig. suplimentară 5A, B). Ca atare, doar reziduurile de interfață îngropate în afara buclei 7 au fost mutate, generând mutanții rM10, rM11 și rM15 (tabelul suplimentar 3). Ca un control, am inclus, de asemenea, un mutant rM9 cu modificări atât pe bucla 7, cât și pe h6 a CD1 (F126A-W127A-A187Y), care era de așteptat să aibă ca rezultat un fenotip similar cu cel al mutantului FWKL al CD1 singur18 raportat anterior; adică întreruperea atât a dimerizării, cât și a asocierii ARN. A fost inclusă, de asemenea, o rA3G aproape de tip sălbatic (WT) cu o comutare de buclă de creștere a solubilității pe bucla 8 a CD1 și mutantul său corespunzător inactiv din punct de vedere catalitic (construcția E/Q) (tabelul suplimentar 3). Au fost examinate asocierea ARN și starea de oligomerizare a acestor mutanți după exprimarea recombinantă în E. coli.

După purificarea pe coloană de afinitate din lizații celulelor E.coli, asocierea ARN a proteinei de fuziune sumo-rA3G a fost analizată prin denaturare uree-PAGE (Fig. 3a-c). În timp ce WT și mutantul E/Q (benzile 7, 8 din Fig. 3b, c) au avut o asociere similară a ARN-ului, toți mutanții cu interfață dimeră (rM10, rM11, rM15 în benzile 2, 3, respectiv 5, în Fig. 3b, c) au avut o asociere de ARN foarte redusă (banda 7) înainte sau după tratamentul cu RNază A, iar rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) și mutantul de control rM9 au prezentat un ARN puțin detectabil după ce au trecut prin același proces de purificare (benzile 1, 2, 5). Cromatografia de excludere a dimensiunii (SEC) a arătat că rM10 și rM15, precum și mutantul de control rM9, au eluat predominant ca monomer înainte și după tratamentul cu RNază A (Fig. 3d, e; Fig. suplimentară 6A, B), confirmând întreruperea dimerizării/multimerizării. Astfel, aceste rezultate sugerează că, în condițiile experimentale, mutarea reziduurilor îngropate în interiorul interfeței nu numai că întrerupe dimerizarea, dar afectează și asocierea ARN chiar și atunci când bucla 7 este neschimbată, probabil din cauza pierderii PEP-ului îmbunătățit ca urmare a întreruperii dimerizării (Fig. 2c, d).

Pentru că nu am putut efectua același tip de test biochimic pentru a evalua mutanți similari în A3G uman (hA3G) din cauza solubilității sale slabe, am generat un mutant chimera rA3G-hA3G (chimera h6) în care rA3G CD1 h6 este înlocuit cu hA3G CD1 h6 (a se vedea tabelul suplimentar 3). Această himeră h6 s-a comportat în mod similar cu rA3G WT în timpul purificării în ceea ce privește dimerizarea/multimerizarea înainte sau după tratamentul cu RNază A (Fig. Suplimentară 7A, B), precum și asocierea ARN, în special după tratamentul cu RNază A (Fig. Suplimentară 7C, D). Este demn de remarcat faptul că, așa cum se arată în Fig. Suplimentară 7A, B, în timp ce proteina H6 chimera s-a deplasat, de asemenea, către fracțiile dimer (D) și monomer (M) după tratamentul cu RNază A (gel SDS-PAGE în Fig. Suplimentară 7A, B). 7D), profilul său SEC prezintă vârfuri mai eterogene decât cel al rA3G WT, posibil din cauză că proteina chimeră are trei reziduuri (Y181, I183, I187) din hA3G care sunt mai hidrofobe decât cele din rA3G (H181, T183, A187) și, prin urmare, mai puțin stabile/solubile. Aceste rezultate sugerează posibilitatea ca CD1 h6 să poată fi interschimbabil între rA3G și hA3G, ceea ce duce la prezența aceleiași zone PEP care are, în esență, același set de reziduuri de suprafață pe ambele proteine.

Efectul mutației PEP asupra asocierii și multimerizării ARN

Apoi am investigat dacă suprafața PEP îmbunătățită formată în jurul joncțiunii dimerice (Fig. 2. Inset b) este importantă pentru asocierea ARN. Patru reziduuri pozitive/polare centrate în jurul lui R24 au fost mutate pentru a genera rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, Tabelul suplimentar 3). A fost inclus, de asemenea, un mutant care conține doar R24T. Asocierea ARN a rM12 a fost redusă în comparație cu R24T și WT (benzile 4, 6, 7 din Fig. 3b, c), ceea ce indică un rol al acestor reziduuri din zona PEP în creșterea legăturii cu ARN. Cu toate acestea, în comparație cu rM9 (F126A/W127A/A187Y), rM12 a avut încă o cantitate substanțială de asociere cu ARN înainte și după tratamentul cu RNază A (benzile 1, 4 din Fig. 3b, c), posibil datorită întreruperii parțiale a legării ARN la zona PEP, dar nu și la alte zone din rA3G. În mod neașteptat, analiza SEC a arătat că rM12 a avut un vârf monomeric major chiar înainte de tratamentul cu RNază A (Fig. 3d, e, Fig. Suplimentară 6A, B), indicând întreruperea dimerizării/multimerizării fără a muta direct interfața de dimerizare. Acest efect negativ al mutației PEP asupra asocierii ARN și a dimerizării/multimerizării a fost confirmat în continuare de alți doi mutanți rA3G care conțin mutații PEP, rM13 și rM14 (tabelul suplimentar 3, figura suplimentară 7). Acești doi mutanți au prezentat niveluri diferite de întrerupere a asocierii ARN (Fig. Suplimentară 7A) și a dimerizării/multimerizării chiar înainte de tratamentul cu RNază A în condițiile testate (profile SEC și geluri în Fig. Suplimentară 7C).

În mod interesant, chiar dacă mutantul unic R24T și WT au prezentat cantități similare de ARN asociat detectat prin geluri de ARN în Fig. 3b, c, analiza detaliată SDS-PAGE a fracțiilor lor de vârf SEC înainte de tratamentul cu RNază A a arătat că cea mai mare parte a proteinei R24T s-a distribuit în fracțiile răspândite în jurul locației vârfului monomeric (M) (Fig. Suplimentară 6A), ceea ce este în contradicție cu WT care este distribuită în cea mai mare parte în fracțiile de volum gol (V). Aceste rezultate indică schimbarea comportamentului de asociere și multimerizare a ARN-ului cu o singură mutație R24T în zona PEP, ceea ce este în concordanță cu studiile anterioare privind mutațiile R24A14,30,38,40. Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că, în aceste condiții de testare, reziduurile din zona PEP îmbunătățită a joncțiunii dimerice (R24/S28/N176/N177) joacă un rol important în medierea asocierii ARN, iar asocierea ARN prin intermediul acestor reziduuri este în schimb necesară pentru stabilizarea dimerizării și multimerizarea ulterioară de ordin superior.

Efectul mutațiilor PEP/dimer asupra legării in vitro a ARN/ADN

Structurile fl rA3G dezvăluie zone suplimentare cu reziduuri încărcate pozitiv în afara zonei PEP îmbunătățite, așa cum se arată în Fig. 2c. Deși este posibil ca aceste reziduuri încărcate pozitiv din afara zonei PEP să nu joace un rol major în formarea complexelor stabile A3G-ARN, așa cum s-a observat din lizații de celule E. coli, ele pot contribui totuși la legarea substraturilor definite de ARNs și ADNssss. Pentru a testa acest lucru, fiecare probă de proteină purificată a fost supusă unui tratament extensiv cu RNază pentru a elimina cât mai mult ARN legat posibil, iar afinitatea de legare față de oligomeri de 50 nt de ARNSS sau ADNSS a fost testată cu ajutorul unui test de deplasare pe gel. Toți mutanții au prezentat legare la 50 nt ssRNA sau ssDNA, iar constantele de disociere estimate (Kd, tabelul suplimentar 3) au indicat că majoritatea mutanților au avut o legare redusă în comparație cu WT și E/Q. Aceste rezultate indică faptul că, în acest sistem reconstituit în care au fost prezente concentrații ridicate de proteine și acizi nucleici, acești diverși mutanți ai interfeței dimerului rA3G și ai zonei PEP sunt încă capabili să se lege la ARN și ssADN prin intermediul altor reziduuri din afara zonei PEP de la joncțiunea dimerului.

În general, reducerea legăturii acestor mutanți este mai severă pentru legarea ssADN decât pentru legarea ARN. În mod interesant, testul de deaminază folosind proteinele purificate ale acestor mutanți rA3G (rM9-rM12 și rM15) a arătat că acești mutanți de interfață cu dimerii și mutanți de legare la ARN au prezentat toți o activitate de deaminază redusă în comparație cu WT (figura suplimentară 8). Legarea redusă a ssADN a acestor mutanți ar putea explica, cel puțin parțial, diferitele niveluri de reducere a activității deaminazei. Cu toate acestea, gradul de legare scăzută a ssDNA nu pare să aibă o corelație strictă cu nivelul de întrerupere a activității deaminazei. De exemplu, rM12 a prezentat cea mai mică legare de ssADN (tabelul suplimentar 3), dar nu este cel cu cea mai mică activitate de deaminază (figura suplimentară 8).

Efectele mutațiilor PEP/interfață cu polimerii asupra restricției HIV

Mutația W127A de pe A3G uman (hA3G) este cunoscută pentru a perturba împachetarea virionilor și, prin urmare, restricția HIV, probabil prin abolirea legării ARN mediate de acest reziduu. Cu toate acestea, studiile care au indus împachetarea mutanților hA3G W127 prin intermediul unei fuziuni peptidice Vpr au identificat deficiențe în restricția HIV15. Pentru a înțelege mai bine mecanismul de restricție a HIV-1 de către hA3G, am proiectat mutanți hA3G suplimentari ghidați de structura rA3G și de datele privind mutațiile. Intenția acestor mutații hA3G (Tabelul suplimentar 4) a fost de a perturba interacțiunile intramoleculare CD1-CD2 (M2, M3, M4) (Fig. suplimentară 9A, B), de a perturba legarea ARN în jurul joncțiunii dimerului prin mutarea unui număr tot mai mare de reziduuri polare/încărcate (M12, M13, M14) sau de a perturba interacțiunile dimer proteic-proteic prin mutarea unui număr tot mai mare de reziduuri îngropate (M6, M10, M11) (Fig. suplimentară 9A, B). 9C).

Cum era de așteptat, hA3G WT nu a avut activitate de restricție HIV-1 în prezența Vif, dar a restricționat complet HIV-1 în absența Vif, iar construcția M1 (D128K) rezistentă la Vif a restricționat complet infecția cu HIV cu sau fără Vif (Fig. 4a-c). Pe de altă parte, mutantul M9 care conține W127A (cu mutațiile F126A/W127A/I187Y, Fig. suplimentară 9C), despre care se știe că întrerupe atât legarea la ARN, cât și dimerizarea, nu a avut activitate de restricție indiferent de prezența Vif (Fig. 4a-c). Acest lucru este în concordanță cu literatura de specialitate anterioară care afirmă că W127 este important pentru activitatea de restricție a HIV din cauza capacității sale de legare a ARN, care este necesară pentru împachetarea virionului hA3G și pentru restricția independentă de dezaminare a transcripției inverse14,15. Într-adevăr, chiar dacă sensibilitatea sa la degradarea Vif pare să fie redusă (Fig. suplimentară 10A), o cantitate de aproximativ 5 până la 10 ori mai mică de proteină mutantă M9 a fost împachetată în virion în prezența sau absența Vif în comparație cu hA3G WT (Fig. 4a, b). Aceste rezultate ale WT și ale mutanților de control M1 și M9 de hA3G au demonstrat o activitate completă sau o lipsă de activitate în studiul nostru.

Pentru mutanții concepuți pentru a afecta interacțiunile intramoleculare CD1-CD2, mai multe reziduuri în apropierea sau în interiorul interfeței interdomeniu de pe partea CD2 au fost mutate pentru M2 și M3 și pe partea CD1 pentru M4 (Fig. Suplimentară 9A, B). Atât M2, cât și M3 au avut o activitate de restricție HIV-1 semnificativ mai mică în absența Vif (Fig. 4c). M2 purtând mutații pe buclele 1 și 3 ale CD2 în jurul interfeței cu CD1 a prezentat o pierdere completă a activității catalitice (Fig. 4e), probabil pentru că unele dintre aceste reziduuri mutate, cum ar fi H216, sunt importante pentru interacțiunea cu substratul ssDNA49. M3 purtând mutații pe interfața CD2 cu CD1, pornind de la reziduurile de legătură R194/H195 (Fig. suplimentară 9A, B), a avut doar ~10% WT activitate de deaminază (Fig. 4e), posibil din cauza pierderii interacțiunii adecvate a CD2 cu CD1 pentru a afecta legarea coordonată a substratului ssDNA pentru o activitate catalitică eficientă. M4 care poartă mai multe mutații în jurul interfeței interdomeniu pe CD1 a prezentat caracteristici similare cu WT, ceea ce indică faptul că aceste mutații nu au un efect evident asupra capacității de restricție. În mod interesant, această mutație a avut o activitate catalitică completă (Fig. 4e), sugerând o anumită plasticitate între interacțiunile interfeței CD1-CD2 pentru funcții.

M12 și M13 au fost proiectate pentru a întrerupe numai legarea ARN-ului la zona PEP de la joncțiunea dimerului, iar M14 conține majoritatea mutațiilor din M12 și M13 plus patru reziduuri R/K suplimentare (K52/K63/R69/K76) pentru a elimina singura suprafață cu sarcină pozitivă rămasă pe A3G-CD1 (Fig. suplimentară 9C). În mod surprinzător, toți acești mutanți au prezentat o activitate de restricție HIV-1 de ~70% în absența Vif (Fig. 4c). Chiar dacă a fost dificil de cuantificat sensibilitatea la Vif din cauza nivelului scăzut persistent de expresie a M12, M13 și M14 în testul de sensibilitate la Vif (Fig. Suplimentară 10A), toți cei trei mutanți, la fel ca WT, nu au prezentat nicio activitate de restricție HIV în prezența Vif (Fig. 4c), sugerând că, de fapt, erau încă suficient de sensibili la degradarea mediată de Vif. Motivul pentru care M12-14 au avut o activitate de restricție HIV-1 de numai 70 % nu se datorează nivelurilor proteice mai scăzute ale acestora la starea de echilibru detectate în lizații de celule HEK293T (Fig. 4a, b), deoarece transfecția unei plasmide de expresie mai puțin WT pentru a obține niveluri de expresie celulară similare cu M12-M14 a dus totuși la o restricție HIV-1 de ~4 ori mai mare decât WT (Fig. suplimentară 10B). Acest lucru este în concordanță cu activitatea de restricție independentă de dezaminare, deoarece acești trei mutanți au avut o activitate de dezaminare întreruptă (Fig. 4d, e). În special M14 a avut o pierdere completă a activității de dezaminare (Fig. 4e). În concordanță cu aceasta a fost rata de mutație de fond a M14 pe baza rezultatelor secvențierii ADN proviral (tabelul suplimentar 5). Și totuși, a prezentat o activitate de restricție HIV-1 de ~70%. Aceste rezultate demonstrează în mod clar că reziduurile mutate în M12-14 pentru a întrerupe legarea ARN în PEP și în zonele învecinate de pe CD1 au prezentat doar un defect parțial în restricționarea HIV, ceea ce indică faptul că au păstrat un anumit nivel de încapsidare a virionului și de restricționare a HIV-1, ceea ce este în contrast cu rolul legării ARN mediate prin mutații care conțin W127 în mutantul M9, care este esențial pentru încapsidarea virionului și restricționarea HIV (Fig. 4a-c).

Aceste mutante destinate să întrerupă doar interacțiunile dimer proteic-proteic cu un număr tot mai mare de mutații sunt de la M6 la M11 (Tabelul suplimentar 4, Fig. suplimentară 9C). M6 și M7 au prezentat doar o pierdere parțială a activității de restricție în absența lui Vif, în ciuda pierderii a 95% din activitatea catalitică pentru M7 din cauza celor trei mutații suplimentare pe CD2 (Fig. 4e). Prin urmare, mutațiile din M6 și M7 nu sunt esențiale pentru restricția HIV. M10 a prezentat un fenotip mai sever în ceea ce privește restricția HIV-1 în absența lui Vif, chiar dacă a păstrat o anumită activitate catalitică (Fig. 4e), sugerând că mutațiile de pe M10 sunt importante pentru împachetarea virionilor și pentru restricția HIV. M11 este similar cu M10 în ceea ce privește activitatea deaminazei, dar cu un fenotip mai puțin sever în ceea ce privește activitatea de restricție și integrarea (Fig. 4c, d). Este posibil ca M11 să fi păstrat mai multă capacitate de legare a ARN decât M10 (din analiza mutanților rM10-11 din rA3G, Fig. 3a-e), ceea ce a dus la un fenotip mai puțin sever. Luate împreună, aceste rezultate au arătat că numai mutarea reziduurilor din interfața îngropată a dimerului proteic-proteic a păstrat în continuare activitatea de restricție a HIV la niveluri reduse (Fig. 4c), iar întreruperea activității deaminazei acestor mutanți (Fig. 4e) poate explica parțial reducerea activității de restricție a HIV. Acest lucru este din nou în contrast cu mutantul M9 care nu a prezentat nicio activitate de restricție HIV (Fig. 4a-c).

.