ADAR
C Recunoașterea enzimei-substrat
Se cunosc puține lucruri despre modul în care ADAR interacționează cu substraturile lor specifice și despre modul în care domeniile de legare a ARN-ului și domeniul catalitic lucrează împreună în timpul reacției de editare. Spre deosebire de mașinăria de editare a ARN-ului C-to-U, care utilizează un motiv de secvență primară în apropierea situsului de editare ca determinant critic pentru recunoașterea substratului (Niswender, 1998), enzimele ADAR nu au nicio specificitate intrinsecă aparentă a secvenței. De fapt, atunci când li se prezintă molecule de ARN complet bicatenar, ADAR1, precum și ADAR2 vor dezamina aproape în mod promiscuu până la 50-60% din toate adenozinele din secvență (Nishikura, 2010). Cu toate acestea, prezența buclelor, a nepotrivirilor și a umflăturilor în structura unui substrat ARN crește selectivitatea situsului și, așa cum s-a observat în cazul unor ținte ADAR fiziologice, pliul complicat al ARN-ului unui astfel de substrat pare să restricționeze accesul pentru legarea pe ARN și cataliza productivă adesea la o singură adenozină (Nishikura, 2010). Prin urmare, cea mai mare parte a specificității țintei de editare de la A la I poate să se regăsească în cadrul pliului tridimensional al substratului. Cu toate acestea, studii structurale recente bazate pe RMN ale domeniilor de legare a ARN ale proteinei ADAR în complex cu substraturi minime de ARN indică faptul că domeniile individuale de legare a ARNdS pot fi, de asemenea, implicate în contacte specifice secvenței care ar putea contribui la selectivitatea pentru anumite ținte de ARN în detrimentul altora (Stefl et al., 2006, 2011).
O altă proprietate a ADAR-urilor care poate avea implicații pentru recunoașterea și interacțiunea substratului este realizarea faptului că, pentru o dezaminare productivă și cu activitate ridicată, proteinele ADAR formează un dimer pe substrat (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potențial, se pot forma atât homo- cât și heterodimeri între proteinele ADAR (Chilibeck et al., 2006) și, prin urmare, reprezintă un alt nivel de reglementare care influențează recunoașterea specifică a substratului, precum și activitatea de editare a ARN-ului. Deoarece până în prezent nu se cunoaște nicio țintă de editare pentru ADAR3 și această proteină nu prezintă nicio activitate enzimatică în testele standard de dezaminare (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), s-a sugerat că rolul său este de natură reglatoare prin heterodimerizare cu celelalte ADAR.
În legătură cu formarea dimerilor ADAR pentru activitatea generală de editare este observația că anumite evenimente de editare a ARN care au loc în cadrul aceluiași substrat prezintă un cuplaj pozitiv sau negativ. De exemplu, adenozinele care se învecinează direct una cu cealaltă sau cele care sunt situate de aceeași parte a structurii duplex a ARN-ului (la o distanță de aproximativ 11 nt în cadrul ARN-ului de formă A) prezintă adesea cuplaj în editarea de către ADAR-uri, probabil datorită proximității lor față de situsul catalitic al enzimei în spațiu (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).
În ciuda acestor cunoștințe, în prezent nu este încă posibilă prezicerea unui situs de editare a ARN-ului pe baza secvenței primare a ARN-ului. Acest lucru se datorează în principal naturii complexe a structurilor terțiare ale ARN-ului și comportamentului lor dinamic. Chiar și atunci când se ia în considerare faptul că domeniile de legare a dsARN pot fi capabile să discrimineze anumite motive de secvență primară în detrimentul altora, mici modificări ale secvenței primare înconjurătoare sau ale structurii secundare și terțiare pot modula sau chiar anula contactele specifice secvenței. Prin urmare, încercările de a concepe algoritmi de căutare care să combine mai multe caracteristici moleculare (inclusiv probabilitatea de împerechere a bazelor, mediul secvenței, conservarea secvenței) despre care se știe că influențează probabilitatea de editare sau activitatea de editare pentru a prezice potențialele situsuri de editare au avut ca rezultat liste lungi de poziții candidate în ARNm, dar puține situsuri de modificare noi, selective și de nivel înalt au fost validate ca ținte bona fide in vivo (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie și Maas, 2009). Dihotomia dintre detectarea a mii de situsuri probabile de editare pe baza caracteristicilor moleculare din ARN premergător și sărăcia situsurilor de recodificare de nivel înalt sugerează fie că algoritmii de predicție suferă de o rată ridicată de falsuri pozitive și majoritatea acestor poziții candidate nu sunt editate de ADAR, fie că problema este detectarea experimentală a editării ARN și că pentru multe situsuri de editare reale sunt testate țesuturile greșite (editare specifică tipului de celulă) sau că acestea sunt testate la un moment greșit (editare reglementată). Alternativ, nivelurile de editare in vivo ale majorității site-urilor sunt atât de mici încât metodele actuale de detectare nu sunt suficient de sensibile pentru a dovedi sau infirma editarea.
.