Agonistii receptorilor adrenergici alfa-2 blochează reluarea căutării de cocaină indusă de stres

Experiment 1: Efectele Clonidinei, Lofexidinei și Guanabenz asupra eliberării de NE induse de șocuri de picior

Subiecți

Subiecții au fost șobolani masculi Long-Evans (Charles River, Quebec) cântărind 300-350 g la începutul experimentului. Pe tot parcursul experimentului, animalele au fost adăpostite într-o cameră de colonie cu umiditate și temperatură controlate, după un program inversat de lumină și întuneric (luminile aprinse între orele 1730-0530) și au avut acces liber la hrană standard pentru șobolani de laborator și apă. Procedurile experimentale au urmat liniile directoare ale CCAC și au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea animalelor, Universitatea Concordia.

Chirurgie

Înainte de operație, șobolanii au fost anesteziați cu pentobarbital de sodiu (65 mg/kg, i.p.) și au fost injectați cu sulfat de atropină (0,6 mg/ml; 0,2 ml/raton, SC) și antibiotic (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/raton, i.m.). Au fost implantate canule de ghidare (calibru 20; Plastics One) pentru introducerea ulterioară a sondelor de dializă; una a fost plasată în PFC și una în AMG în emisferele opuse. Animalele utilizate pentru a studia efectele guanabenzului au primit o singură canulă de ghidare îndreptată spre PFC. Emisfera în care au fost implantate canulele de ghidare respective a fost contrabalansată între tratamente. Coordonatele stereotaxice utilizate (în raport cu bregma și cu suprafața craniului) au fost următoarele: AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos și Watson 1997). La introducere, arborele sondei de dializă se întindea la 1 mm de la canulele de ghidare. Canulele de ghidare implantate au fost fixate pe craniu cu șuruburi din oțel inoxidabil și ciment dentar. Canulele de ghidare au fost închise cu obturatoare înșurubate. Toate animalele au fost readuse în camera de colonie pentru o perioadă de recuperare de cel puțin 1 săptămână înainte de testare.

Microdializă

Microdializa a fost efectuată în patru camere de testare hexagonale (42 × 39 × 33,5 cm) construite din plexiglas cu tavane din lemn și podele din tije de oțel inoxidabil. În jurul fiecărei camere au fost trase perdele întunecate, iar iluminarea a fost asigurată pe un ciclu inversat de becuri suspendate (15 W). Sonda de dializă era formată dintr-o membrană de dializă semipermeabilă de 1,8 mm (AMG) sau de 3,5 mm (PFC) (Spectra/Por; 240 μm d.o., 13000 M.W. cutoff), închisă la un capăt și atașată la celălalt la o lungime de 19 mm de tub de oțel inoxidabil de calibrul 26. O lungime de 40 până la 50 cm de tub PE-20 a conectat celălalt capăt al arborelui din oțel inoxidabil la un pivot de perfuzie amplasat deasupra camerei de testare care, la rândul său, a fost conectat prin tubulatura PE-20 la o pompă de perfuzie cu viteză variabilă. Un tub de siliciu topit cu diametru mic se întindea în interior prin sondă, cu un capăt aflat la 0,5 mm de vârful sondei și celălalt capăt ieșind din tubulatura PE la 35 cm sub pivotul de perfuzie. Lungimea exterioară a tubului PE-20 a fost protejată împotriva deteriorării de carcase de arc din oțel. Sondele au fost proiectate astfel încât întreaga lungime a membranei semipermeabile să se extindă sub vârful canulei de ghidare.

S-au folosit escadroane separate de animale pentru a examina efectele fiecăruia dintre medicamentele testate. În cadrul fiecărei echipe, fiecare animal a fost repartizat în mod aleatoriu la condiția de tratament. Animalele care au primit injecții cu vehicule au fost rulate în fiecare echipă, dar au fost combinate într-un singur grup pentru analiza statistică. Dimensiunile finale ale grupurilor (PFC/ AMG) au fost următoarele: vehicul (n = 15/17), clonidină 20 μg/kg (n = 7/6), clonidină 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidină 75 μg/kg (n = 6/6), lofexidină 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640μg/kg (n = 4, PFC). Cu excepția animalelor care au primit guanabenz, toți subiecții au fost dializați de două ori, o dată în PFC și o dată în AMG, cu un interval de 3-4 săptămâni între teste.

Sondele au fost inserate cu o zi înainte de începerea testelor de microdializă. Pentru a preveni ocluzia, LCR artificial (145 mM Na+, 2,7 mM K+, 1,22 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0,2 mM ascorbat, 2 mM Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) a fost perfuzat peste noapte la o rată de 0,06 μl/min. Prelevarea probelor de dializat și monitorizarea activității au început în dimineața următoare. Debitul de dializat a fost mărit la 0,6 μl/ min, iar probele de dializat de referință (∼12 μl/ probă) au fost colectate la fiecare 20 min. Probele au fost colectate până când s-a obținut o linie de bază stabilă, definită ca un minim de trei probe consecutive în care nivelurile de NE din dializat au variat cu ±10%. După stabilirea unor niveluri de bază stabile de NE, toate animalele au primit o injecție i.p. (1 ml/kg) cu medicamentul sau vehiculul corespunzător, care a fost administrat cu 40 min înainte de o perioadă de 10 min de șocuri la nivelul picioarelor. Șocurile au fost administrate după un program de timp variabil la un interval mediu de 40 de secunde (interval de 10-70 de secunde); fiecare șoc (0,6 mA) a avut o durată de 0,5 secunde. S-au colectat probe timp de încă 120 de minute (6 probe). Probele au fost analizate imediat cu ajutorul unuia dintre cele două sisteme similare de cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detecție electrochimică (HPLC-EC). Probele (10 μl) au fost încărcate pe coloane cu fază inversă (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) prin porturi de injecție manuale (Reodyne 7125; buclă de 20 μl); curenții de reducere și oxidare pentru NE, acidul dihidroxifenilacetic (DOPAC), acidul 5-hidroxindoleacetic (5-HIAA) și acidul homovanilic (HVA) au fost măsurați cu detectoare coulometrice ESA cu două canale (Coulochem 5100, cu o celulă de condiționare model 5021 și o celulă analitică model 5011, Sci. Products & Equipment). Curenții pentru NE au fost măsurați independent de cei pentru DOPAC și HVA, utilizând canale separate ale detectoarelor Coulochem. Fazele mobile (acetat de sodiu 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitril, ajustat la pH 3,7 cu ajutorul acidului acetic glacial) au circulat prin fiecare sistem închis la un debit de 1,4 ml/min cu ajutorul pompelor Waters 510 HPLC. Picurile obținute pentru NE, DOPAC și HVA au fost integrate și cuantificate cu ajutorul EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). Probele de dializat de la șobolani individuali au fost întotdeauna analizate cu același sistem HPLC-EC, iar atribuirea animalelor la fiecare sistem a fost contrabalansată în toate grupurile de tratament. Hrana a fost îndepărtată din camere înainte de prelevare, dar a fost disponibil un tub de băut apă. La finalizarea testelor, confirmarea plasării corecte a sondei a fost determinată prin examinarea secțiunilor de 30 μm tăiate prin locurile de plasare a sondei colorate cu violet de Cresil.

Experimentul 2: Efectele clonidinei asupra reintroducerii induse de șocuri de picioare și de cocaină

Subiecți

Subiecții au fost 25 de șobolani masculi Long-Evans (Charles River, Quebec) care cântăreau 350-425 g la începutul experimentului. Animalele au fost întreținute așa cum este descris în Experimentul 1.

Operație

Animalele au fost pregătite pentru operație așa cum este descris în Experimentul 1. Un cateter intravenos (Dow Corning) a fost implantat în vena jugulară dreaptă. O lungime de 3 cm de tub de silastic a fost introdusă în venă (diametru interior 0,30 mm, diametru exterior 0,64 mm) și a fost conectată cu un tub termocontractabil la o lungime de 9 cm de tub de silastic (diametru interior 0,51 mm, diametru exterior 0,94 mm) care a fost trecută subcutanat până în partea superioară a craniului. Cateterul a fost fixat pe venă cu suturi de mătase și a ieșit într-un conector (o canulă modificată de calibru 22; Plastics One, Roanoke, VA) care a fost montat pe craniu cu șuruburi de bijutier și ciment dentar; un capac de plastic a fost plasat peste deschiderea canulei. Animalele au avut la dispoziție 1-2 săptămâni pentru a se recupera după operație.

Aparatură

Camerele de autoadministrare utilizate în experimente au fost echipate cu o pârghie retractabilă (Med Associates, St Albans, VT) și o pârghie „falsă” neretractabilă. Ambele pârghii au fost amplasate la 9 cm deasupra podelei. O pompă de perfuzie (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) a fost activată prin răspunsuri pe maneta retractabilă sau „activă”. Răspunsurile la maneta falsă au fost înregistrate, dar nu au dus la activarea pompei. Soluția de medicament a fost administrată pe o perioadă de 10 s într-un volum de 65 μl. Pe parcursul perioadei de perfuzie, s-a aprins o lumină albă de stimulare chiar deasupra pârghiei active, iar răspunsurile suplimentare din acest timp au fost înregistrate, dar nu au dus la reactivarea pompei. Fiecare cameră de autoadministrare a fost echipată pentru a furniza șocuri electrice cu curent constant, intermitente, ineluctabile, prin intermediul unui dispozitiv de bruiaj la podeaua rețelei (Grason-Stadler Generator #E1064GS sau Med Associates). Șocul la nivelul picioarelor a fost administrat timp de 15 minute conform unui program de timp variabil la un interval mediu de 40 de secunde (interval de 10-70 de secunde). Fiecare șoc (0,6 mA) a avut o durată de 0,5 secunde. Cu ajutorul aparatului nostru, s-a constatat că această intensitate a șocurilor de picior este cea minimă necesară pentru a induce o restabilire fiabilă.

Droguri

Cocaina HCl a fost obținută de la BDH Chemicals (Toronto, Canada) și a fost dizolvată în soluție salină fiziologică. Clonidina HCl a fost achiziționată de la Sigma (St Louis, MO) și a fost dizolvată în soluție salină fiziologică și injectată i.p. (0, 20 și 40 μg/kg).

Procedură

>Faza 1: Instruire. Șobolanii au fost instruiți să se autoadministreze cocaină HCl (0,5 mg / kg / perfuzie, i.v.) pe un program de întărire cu raport fix-1 în timpul unei sesiuni zilnice de autoadministrare de 3 ore. În fiecare zi, jumătate dintre animale au fost aduse în camerele operante pentru sesiunea de autoadministrare dimineața, la aproximativ trei ore după stingerea luminilor, iar jumătate dintre animale au fost aduse în camere după-amiaza, la aproximativ șapte ore după stingerea luminilor. Grupul de animale repartizate la sesiunile de dimineață și de după-amiază a alternat zilnic, astfel încât, până la sfârșitul antrenamentului, toate animalele au beneficiat de un număr egal de sesiuni de autoadministrare în ambele momente. A fost important ca toate animalele să aibă o experiență similară de autoadministrare la începutul și la sfârșitul zilei, deoarece în timpul fazei 2 toate animalele au primit sesiuni de extincție dimineața, urmate de o sesiune de testare care a avut loc de obicei după-amiaza. La începutul fiecărei sesiuni, o lumină roșie din casă a fost aprinsă timp de 10 secunde înainte de introducerea pârghiei retractabile în cușcă. Lumina aflată chiar deasupra pârghiei active a fost aprinsă pentru primele 30 de secunde după prezentarea pârghiei. Lumina din casă a rămas aprinsă pe toată durata sesiunii. După cum s-a indicat anterior, răspunsurile la pârghia activă au dus la activarea pompei de perfuzie și la iluminarea luminii de deasupra pârghiei pentru cele 10 secunde de administrare a medicamentului. Apăsările suplimentare pe pârghie în timpul perioadei de administrare a medicamentului au fost înregistrate, dar nu au dus la reactivarea pompei. Condițiile de antrenament au fost puse în aplicare timp de 10-12 zile. La sfârșitul antrenamentului, animalele au fost lăsate netulburate în camera coloniei timp de 7 până la 13 zile. Ulterior, au avut loc extincția și testarea. În acest experiment și în experimentul 3B, grupurile de animale au fost repartizate la diferite doze de medicamente de testare. Toate animalele din fiecare grup au fost apoi supuse la trei condiții de testare; soluție salină, cocaină și șocuri la nivelul picioarelor.

Faza 2: Extincție și testare. În timpul extincției și testării, care au avut loc pe parcursul a patru zile consecutive, animalele au fost adăpostite 24 ore pe zi în camerele de autoadministrare. Hrana și apa au fost disponibile în mod liber pentru animale, cu excepția sesiunilor zilnice de extincție și testare. Animalele au fost aduse în camere în seara care a precedat prima zi de extincție și testare. Deoarece două grupuri separate de șobolani au fost rulate în fiecare zi în timpul fazei de instruire, un grup de animale a fost testat în primele patru zile ale fazei 2, iar celălalt grup de animale a fost testat în următoarele patru zile. În timpul extincției și al testării, au fost menținute toate condițiile prezente în timpul antrenamentului, cu excepția faptului că apăsarea pârghiei nu a dus la perfuzii de cocaină.

În acest experiment și în toate experimentele ulterioare de reinstaurare, animalele au beneficiat de mai multe sesiuni zilnice de extincție de 1 oră, separate de perioade intermediare în care pârghia a fost retrasă. În ziua 1, animalele au primit patru sesiuni de extincție; în zilele 2-4, animalele au primit două sau trei sesiuni de extincție, suficiente pentru a stabili un nivel de bază de răspuns de 15 sau mai puține răspunsuri într-o oră, urmate de o sesiune de testare de 180 min. Durata perioadelor intermediare a fost menținută constantă pentru fiecare experiment și a corespuns întârzierii necesare pentru absorbția medicamentului între injecțiile de pretratament și începerea testului. În experimentul de față, durata perioadelor de intervenție a fost de 40 min.

La test, grupuri separate de animale au fost pretratate cu 0, 20 sau 40 μg/kg, i.p., clonidină înainte de fiecare dintre cele trei teste de restabilire (soluție salină, cocaină și șocul picioarelor), administrate în zile consecutive și într-o ordine contrabalansată. Clonidina a fost injectată cu 40 min înainte de introducerea pârghiei. Pentru testele de amorsare cu soluție salină și cocaină, animalelor li s-a administrat o injecție i.p. necontingentă de soluție salină sau cocaină (20 mg/kg) cu 5 minute înainte de introducerea pârghiei. Pentru testele de șocuri la nivelul picioarelor, animalele au fost expuse la un stres intermitent scurt de 15 minute de șocuri intermitente la nivelul picioarelor imediat înainte de introducerea pârghiei. Sesiunile de testare au avut o durată de 3 ore. Doza de cocaină și parametrii șocului la nivelul picioarelor au fost aleși pe baza lucrărilor anterioare din acest laborator (Erb et al. 1996; Erb et al. 1998; Shaham et al. 1998). Dozele de clonidină au fost alese pe baza experimentelor de reinserție pe care le-am efectuat cu șobolani antrenați cu heroină (Shaham et al. 2000).

Experimentul 3A: Effects of Lofexidine on High Rates of Responding for Sucrose

Pentru că profilul farmacologic al lofexidinei nu a fost la fel de bine caracterizat ca și cel al clonidinei, s-a efectuat un experiment pentru a stabili dacă și la ce doze lofexidina induce deficite de performanță. Dozele din testele de reintegrare au fost alese pe baza rezultatelor obținute în acest experiment.

Subiecți

Subiecții au fost 8 șobolani masculi Long-Evans (Charles River, Quebec) care cântăreau 400-550 g la începutul experimentului. Șobolanii au fost folosiți anterior într-un experiment care a avut ca scop studierea reinstaurării induse de șocuri de picioare a căutării de zaharoză (Buczek et al. 1999). Animalele au fost întreținute în condiții similare cu cele descrise în experimentul 1.

Aparatură

Care cameră de autoadministrare a fost echipată cu două pârghii staționare, centrate simetric pe un panou lateral, la 5 cm deasupra podelei. Răspunsurile la una dintre pârghii, pârghia „activă”, au activat o pompă (Razel Sci. Stamford, CT). Răspunsurile la cealaltă pârghie, pârghia „falsă”, au fost înregistrate, dar nu au avut consecințe. Activarea pompei a dus la livrarea timp de 20 de secunde a 0,18 ml de soluție de zaharoză către un recipient pentru picături de lichid situat între cele două pârghii. De-a lungul perioadei de administrare a zaharozei, a fost aprinsă o lumină albă de stimulare chiar deasupra pârghiei active și au fost înregistrate răspunsuri suplimentare în acest timp, dar care nu au dus la reactivarea pompei.

Droguri

Lofexidina HCl a fost furnizată cu generozitate de Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Marea Britanie. Medicamentul a fost dizolvat în soluție salină fiziologică și injectat i.p. (0, 80, 120, 160 sau 200 μg/kg).

Procedură

Animalelor care învățaseră anterior să se autoadministreze zaharoză într-un alt studiu (Buczek et al. 1999) li s-au administrat ulterior cinci sesiuni pe parcursul a cinci zile consecutive în care și-au autoadministrat o soluție de zaharoză de 30% după un program FR-1. În sesiunile zilnice ulterioare, animalele au fost injectate fie cu vehicul (0 μg/kg), fie cu lofexidină (80, 120, 160 sau 200 μg/kg, i.p.) cu 60 min înainte de începerea sesiunii de autoadministrare. Toate animalele au primit toate dozele de lofexidină într-o ordine contrabalansată; cea mai mare doză de lofexidină a fost testată de două ori. Fiecare sesiune în care animalele au fost tratate cu lofexidină a fost urmată de o sesiune de pretratament cu soluție salină pentru a minimiza posibilitatea efectelor de transfer ale medicamentului.

Experimentul 3B: Efectele lofexidinei asupra reintroducerii induse de șocuri cu piciorul și de cocaină

Subiecți

Subiecții au fost 49 de șobolani masculi Long-Evans (34 de la Charles River, Quebec; 15 de la Harlan Sprague Dawley, SUA) cântărind 350-400 g la începutul experimentului. Animalele au fost întreținute așa cum este descris în Experimentul 1. Nu au existat diferențe evidente de răspuns între animalele provenite de la cei doi furnizori în niciuna dintre fazele experimentului.

Procedura

Faza 1: Instruire. Animalele au fost antrenate să se autoadministreze cocaină în condițiile descrise în experimentul 2.

Faza 2: Extincție și testare. În acest experiment, perioadele de intervenție, așa cum s-a descris mai sus, au avut o durată de 60 min. La testare, grupuri separate de animale au fost pretratate fie cu 0, 50, 100, 150 sau 200 μg/kg, i.p., lofexidină înainte de fiecare dintre cele trei teste de restabilire (soluție salină, cocaină și stres prin șocuri la nivelul picioarelor), administrate în zile consecutive și într-o ordine contrabalansată (a se vedea Experimentul 2). Lofexidina a fost injectată cu 60 min înainte de introducerea pârghiei. Sesiunile de testare au avut o durată de 3 h. Dozele de lofexidină au fost alese pe baza rezultatelor obținute în Experimentul 3A.

Experimentul 4: Efectele Guanabenzului asupra reintroducerii induse de șocul picioarelor și de cocaină

Subiecți

Subiecții au fost 18 șobolani masculi Long-Evans (Charles River, Quebec) care cântăreau 350-400 g la începutul experimentului. Animalele au fost întreținute așa cum este descris în Experimentul 1.

Medicament

Guanabenz a fost achiziționat de la Sigma (St Louis, MO) și a fost dizolvat în soluție salină fiziologică și injectat i.p. (0, și 640 μg/kg).

Procedură

Faza 1: Instruire. Animalele au fost antrenate să se autoadministreze cocaină în condițiile descrise în Experimentul 2.

Faza 2: Extincție și testare. În acest experiment, perioadele de intervenție, așa cum s-a descris mai sus, au avut o durată de 60 min. La testare, animalele au fost pretratate cu 0 sau 640 μg/kg guanabenz, i.p., înainte de fiecare dintre cele două teste de reinserție (fără șocuri la picior, șocuri la picior sau soluție salină, cocaină), administrate în zile consecutive (a se vedea Experimentul 2). Guanabenzul a fost injectat cu 60 min înainte de introducerea pârghiei. Sesiunile de testare au avut o durată de 3-h. Doza de guanabenz a fost aleasă pe baza substituibilității sale pentru 40 μg/kg de clonidină într-o procedură de discriminare a drogurilor (Bennett și Lal 1982).

Analize statistice

Datele de microdializă au fost analizate utilizând o ANOVA cu factori amestecați pentru concentrația de NE extracelulară în probele de dializat de 20 min; factorul între subiecți a fost doza de clonidină (0, 20, 40 μg/kg), lofexidină (0, 75 sau 150 μg/kg) sau guanabenz (0 sau 640 μg/kg), iar măsura repetată a fost timpul. Interacțiunile semnificative între timp și doză au fost supuse unor ANOVA cu o singură cale pentru factorul doză la anumite momente de timp. Atunci când a fost cazul, au fost efectuate teste post-hoc (Fisher’s LSD, p < 0,05) pentru a compara vehiculul (0 μg/kg) cu condițiile medicamentoase.

Cele două măsuri dependente în testele de restabilire au fost numărul de răspunsuri pe pârghia activă (perfuzii + răspunsuri de pauză) și numărul de răspunsuri pe pârghia inactivă în trei ore. Toate datele comportamentale sunt prezentate ca medii ± SEM. Din cauza variabilității considerabile a numărului de răspunsuri date în cadrul diferitelor teste de restabilire, au fost utilizate, după caz, statisticile neparametrice pentru eșantioane înrudite (Friedman și Wilcoxon) și neînrudite (Kruskal-Wallis și Mann-Whiney).

Pentru studiul cu zaharoză (experimentul 3A), măsurile dependente au fost numărul de răspunsuri pe pârghiile active (răspunsurile întărite + răspunsurile de pauză) și inactive și numărul de întăriri obținute. Au fost efectuate ANOVA-uri cu măsuri repetate cu doza ca factor în cadrul subiectului. Atunci când a fost cazul, s-au efectuat teste post-hoc (LSD al lui Fisher, p < .05) pentru a compara vehiculul (0 μg/kg) cu condițiile de medicament.