Alcaloizi de aporfină din Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Alcaloizi de aporfină din Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colombia. AA 14490
ABSTRACT
Cei patru alcaloizi aporfinici din lemnul de Ocotea macrophylla (Lauraceae) au fost izolați și caracterizați ca (S)-3-metoxi-nordomesticină (1), (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticină (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticină (3) și (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticină (4); alcaloizii 2-4 sunt raportați pentru prima dată. Structura compușilor izolați a fost determinată pe baza datelor spectrale ale acestora și prin compararea datelor spectrale cu valorile descrise în literatura de specialitate. Fracțiunea alcaloidă și compusul 1 au prezentat activitate antifungică împotriva Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici și, de asemenea, compusul 1 a prezentat activitate antimicrobiană față de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, de asemenea.
Cuvintele cheie: „A: Ocotea macrophylla; alcaloizi aporfinici; Lauraceae.
INTRODUCERE
Genul Ocotea (Lauraceae) include mai mult de 350 de specii care se găsesc pe continentul american și în sudul Africii.1,2 În Columbia, există 35 de specii de Ocotea distribuite în întreaga țară, în principal în pădurile andine.3 În medicina tradițională, unele specii de Ocotea au prezentat diferite aplicații. O. quixos este folosită ca dezinfectant, anestezic local și antidiareic.4 O. lancifolia este folosită ca antiparazitar, iar O. caparrapi este folosită pentru tratarea mușcăturilor de insecte, mușcăturilor de șarpe, bronșitei și a tumorilor canceroase.5,6
Din punct de vedere chimic, genul Ocotea este cunoscut mai ales ca sursă de metaboliți de tip furofuran7 și tetrahidrofuran lignani,8 biciclooctan9 și benzofuran neolignani,10 și benzilizochinolină11 și alcaloizi de aporfină.5 În studii anterioare, patru alcaloizi aporfinici din lemnul de Ocotea macrophylla au fost izolați și identificați ca nantenină, glaucină, izocorydină și dehidronantenină.12,13 În această lucrare, descriem izolarea și determinarea structurală a trei noi alcaloizi aporfinici 2-4 în afară de (S)- 3-metoxi-nordomesticina 1 și rapoartele activităților antibacteriene și antifungice ale compușilor.
REZULTATE ȘI DISCUȚII
Extractul etanolic din tulpina de O. macrophylla a fost supus unei extracții acido-bazice pentru a obține o fracție alcaloidală, care a fost ulterior supusă fracționării și purificării prin metode cromatografice care au condus la izolarea a patru alcaloizi: (S)-3-metoxi-nordomesticină (1), (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticină (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticină (3) și (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticină (4). Structurile alcaloizilor 1-4 sunt prezentate în figura 1, iar datele spectroscopice în tabelul 1.
Semnalul de la δH 6,30 (1H, s) nu a prezentat conectivitate în experimentul HMQC, ceea ce indică prezența unei grupări OH fenolice, susținută de IR. Analiza spectrului HMBC a permis localizarea substituenților, în funcție de corelațiile observate între semnalele de la δH 5,94 și 5,95 (pentru grupa metilendioxi) cu semnalele de la δC 145,9 (C-9) și 146.2 (C-10), și aceste ultime două semnale cu protonii de la δH 6,70 (H-8) și, respectiv, 7,90 (H-11), sugerând prezența unei grupări metilendioxi în pozițiile 9 și 10 și a doi hidrogeni pe inelul aromatic în orientare para. Prezența grupului hidroxil în poziția 1, a fost determinată folosind corelații între semnalele de la δH 6,30 și δC 116,5, atribuite la C-11b. Localizarea grupărilor metoxil în pozițiile C-2 și C-3, a fost atribuită în funcție de corelația dintre hidrogenii de la δH 3,96 și 3,86 cu carburile de la δC 138,4 (C-2) și, respectiv, δC 147,8 (C-3).
Configurația absolută a C-6a a fost atribuită ca S, deoarece are un efect Cotton negativ la 280 nm și un efect Cotton pozitiv la 240 nm în curba CD.17 În plus, acest lucru a fost confirmat de valoarea pozitivă a rotației optice 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Prin urmare, alcaloidul 1 a fost determinat ca fiind (S)-3-metoxi-nordomesticina, un alcaloid aporfinic raportat anterior de la Nectandra sinuata19 , aparținând de asemenea familiei Lauraceae. Acest raport corectează și completează datele spectroscopice pentru acest compus.
Alcaloidul 2 a fost obținut ca un ulei galben care dă o reacție pozitivă la reactivul Dragendorff, iar valoarea rotației sale optice a fost 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). Spectrele UV și IR ale lui 2 au fost similare cu cele ale lui 1, cu excepția apariției, în ambele spectre, a absorbțiilor datorate unei grupări carbamat la 282 nm și, respectiv, la 1688 cm-1.20 Spectrele RMN 1H și 13C au prezentat un profil similar cu cel al lui 1. În RMN 1H au apărut două noi semnale la δH 4,29 (2H, m) și 1,29 (3H, m), precum și deplasarea semnalului H-5, datorită prezenței în proximitate a unei grupări deprotectoare. Experimentul COSY a evidențiat corelația semnalelor δH 4,29 și 1,29, ceea ce indică prezența unei grupări etil care, datorită deplasării sale, a sugerat că este atașată unui heteroatom. Spectrele 13C RMN și DEPT au arătat apariția a trei noi semnale la δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) și 14,8 (CH3), semnale tipice ale unei grupări etoxicarbonil atașate unui atom de azot. Configurația absolută a C-6a a fost determinată ca fiind S, deoarece a prezentat aceleași efecte de bumbac ca și 1. Prin urmare, compusul alcaloid 2 a fost identificat ca fiind (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticină. Spectrul său ESIMS a dat un vârf de ioni pseudomoleculari la m/z 414 + care corespunde formulei moleculare C22H22NO7, iar fragmentările s-au datorat pierderii de CH3OH și CH3CH2OH la m/z 382 + și, respectiv, m/z 368 +. Spectrul ESI în modul de ioni negativi a evidențiat vârfuri la m/z 412 – și m/z 383 ., ultimul fiind pierderea unei grupări etil. Acest tip de alcaloizi cu substituenți N-etoxicarbonil au fost izolați din Lindera angustifolia (Lauraceae).21
Alcaloidul 3, a fost obținut sub formă de ulei galben, cu o valoare a rotației optice de 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). Spectrul IR a fost similar cu cel al alcaloizilor 1 și 2. În plus, a fost observată prezența absorbțiilor la 2830, 2700, 1739 cm-1, caracteristice pentru grupa formil. În modul negativ HRESIMS a fost observat ionul pseudomolecular – la m/z 369,1133, corespunzând formulei moleculare C20H20NO6. În modul ion negativ al spectrelor ESI-MS s-a evidențiat pierderea unei grupări formil la m/z 339 … Profilul RMN a fost similar cu cel al alcaloizilor 1 și 2. În 1H RMN au apărut semnale diferite aparținând unui amestec de doi izomeri în raport 3:1. Comparația izomerului majoritar cu alcaloidul 1 în RMN, a arătat același model de substituție a inelului aromatic, pe lângă apariția a două noi semnale la δH 8,25 (1H, s) în 1H și la δC 161,9 în 13C ale grupării formil la 3. Această funcționalitate pe azot a dus la formarea de izomeri rotaționali, care au fost descriși anterior pentru alcaloizi cu o grupare N-formil și N-acetil.22 Configurația absolută a fost determinată ca fiind S, în același mod ca și pentru 1 și 2. Prin urmare, acest alcaloid 3 a fost identificat ca fiind (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticină.
Alcaloidul 4 a fost obținut ca un solid alb cu un punct de topire de 222-223 ºC (MeOH) și cu o rotație optică de 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). Analiza datelor RMN ale lui 4 a arătat că acesta are același schelet de bază ca și 2, dar are un ester metilic conform semnalelor la δH 3,76 (3H, s) și δC 52,6 pentru 4 în locul semnalelor pentru gruparea etil din 2. HRESIMS a arătat un ion pseudomolecular – la m/z 398,1233 corespunzător formulei moleculare C22H22NO7. Prin urmare, alcaloidul 4 a fost identificat ca fiind (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticină.
Activitatea antifungică a fost evaluată prin metoda difuziei pe disc împotriva Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 o ciupercă fitopatogenă care afectează culturile de tomate, provocând pierderi uriașe pentru agricultori. Fracțiunea alcaloidă a fost activă împotriva F. oxysporum la 250 μg/μL. Activitatea inhibitorie împotriva creșterii ciupercilor a fost moderată la 5 μg/μL pentru (S)-3-metoxi-nordomesticina 1, în timp ce ceilalți alcaloizi au fost ineficienți, sugerând că prezența substituenților retractori de electroni pe atomul de azot diminuează activitatea antifungică.
Deși puține rapoarte de evaluare a activității antifungice a aporfinelor, s-a constatat că acestea sunt active împotriva unor specii precum Candida albicans,24,25 dar inactive împotriva unor agenți patogeni fungici precum Cladosporium herbarium.26 Aceste rezultate reprezintă un nou raport de evaluare a activității antifungice a acestor alcaloizi, în care se evidențiază faptul că tipul de substituenți de pe azotul aporfinelor are un efect asupra activității antifungice pe care acestea o prezintă.
Activitatea antibacteriană a fost evaluată prin metoda de difuzie radială raportată de Lerhrer27 împotriva a două tulpini standard Gram (+): Staphylococcus aureus 6538 și Enterococcus faecalis 29212 și trei tulpini Gram (-): Escherichia coli 25922 și Salmonella tiphymurium, tulpinile MS7953 și 14028s. Alcaloidul 1 (2,5 μg) a prezentat activitate antimicrobiană împotriva ambelor bacterii Gram pozitive evaluate cu valori de 30 UA, așa cum se arată în tabelul 2.
A fost raportată pentru amestecul racemic al compusului 3-metoxi-nordomesticină, activitatea acestuia împotriva E. coli (MIC= 256 μg/mL) și S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 însă în acest caz compusul 1 nu este activ împotriva E. coli.
În mod similar ca și în cazul activității antifungice, rezultatele arată că natura substituentului pe azot influențează activitatea antibacteriană (tabelul 2).
EXPERIMENTAL
Proceduri generale
Punctul de topire a fost determinat cu ajutorul dispozitivului de laborator Mel-temp Fisher Johns. Spectrele UV au fost înregistrate pe un aparat Perkin Elmer Lambda 2S, iar spectrele CD pe un spectrometru JASCO J-720. Spectrele IR au fost obținute pe Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 seria 1000 sub formă de film subțire. Rotațiile optice au fost înregistrate pe polarimetrul Schmidt-Haensch. Spectrele RMN 1H (400 MHz) și 13C (100 MHz), precum și spectrele 2D (COSY, HMQC și HMBC) au fost realizate pe un spectrometru Bruker Avance 400 MHz, utilizând CDCl3 ca referință internă. HRMS au fost determinate pe un sistem de spectrometru de masă Shimadzu LCMS-IT-TOF cu ESI în modul de ioni pozitivi și în modul de ioni negativi. Cromatografia pe coloană (CC) a fost efectuată cu silicagel (70-230 și 230-400 mesh, Merck), iar cromatografia analitică a fost realizată cu silicagel 60 PF254 (0,25 mm).
Material vegetal
Tigerele de O. macrophylla au fost colectate în iulie 2006 din Nocaima, Columbia, de către W. Delgado. Specimenul botanic a fost identificat de A. Jara, iar un exemplar voucher (COL-517191) și a fost depus în Herbariul Național Columbian al Universității Naționale din Columbia, Bogota, Columbia.
Extracție și izolare
Tașelele uscate și pudrate (2,0 kg) de Ocotea macrophylla au fost extrase cu EtOH prin macerare la temperatura camerei și concentrate în vid pentru a obține un extract (102,6 g). O probă (48,9 g) din acest extract a fost solubilizată în apă cu ajutorul ultrasunetelor și acidificată cu HCl 5% până la pH 2,0. Suspensia acidă a fost apoi filtrată și badijonată cu NaOH 20% până la pH 8,0 și extrasă succesiv cu cloroform. Fracția de cloroform (3,01 g) a fost supusă unei cromatografii pe coloană cu gel de silice și eluată cu un gradient de eter de petrol:AcOiPr (4:6 până la 0:10) și AcOiPr:MeOH (10:0 până la 0:10), obținându-se patru fracții (I-IV). Fracțiunea I (347 mg) a fost cromatografiată repetitiv pe coloană (CC) pe gel de silice și eluată cu n-hexan:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3 și Tol:AcOiPr 7:3. S-au obținut alcaloizii 1 (7 mg) și 2 (4 mg). Fracțiunea II (250 mg) a fost supusă unei cromatografii pe coloană pe silicagel și eluată cu CHCl3:AcOEt (85:15), apoi a fost supusă CC pe Sephadex LH-20 (CH3OH) pentru a obține alcaloidul 3 (8 mg). Fracțiunea IV (1433 mg) a fost purificată prin cromatografie pe coloană repetitivă pe gel de silice folosind CH2Cl2:MeOH 97:3 și CH2Cl2 ca sisteme de eluție. În cele din urmă, prin spălări succesive cu MeOH s-a obținut alcaloidul 4 (98 mg).
Analiză antifungică
F. oxysporum a fost obținut din colecția de culturi a Universității din Cundinamarca (Departamentul de Agronomie, Laboratorul de Fitopatologie). PDA a fost utilizat ca mediu pentru testele de activitate antifungică. Mediul de cultură a fost inoculat cu 100 μL dintr-o soluție de 105 spori. Probele au fost preparate în soluții de diferite concentrații, corespunzând la 50, 25 și 10 μg/μL de fracțiune alcaloidă și 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 și 0,1 μg/μL de alcaloizi puri. Zece microlitri de probe au fost aplicați pe discurile de hârtie de filtru și plasați pe mediul inoculat. Plăcile au fost sigilate și lăsate într-un incubator timp de 3 zile la 25 °C. Zonele clare apărute împotriva unei ciuperci în creștere au indicat cantitatea minimă de fracție sau alcaloid necesară pentru a inhiba creșterea ciupercii. Pentru fiecare tratament s-au efectuat trei repetiții. Benomilul (benzimidazol – 5 μg) a fost utilizat ca martor pozitiv, iar acetona a servit ca martor negativ.23
Sesizări antibacteriene
Activitatea antibacteriană a fost evaluată prin metoda de difuzie radială adaptată după metodologia publicată anterior de Lehrer.27 Compușii au fost evaluați împotriva a două tulpini Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538 și Streptococcus fecalis ATCC 29212 și trei tulpini Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 și Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s și Salmonella tiphymurium MS7953. O colonie izolată de la fiecare tulpină a fost depozitată în 3 ml de tripticază de soia (TSB) pentru tulpinile Gram (+) și în bulion Luria (LB) pentru tulpinile Gram (-) și a fost incubată la 37 °C, sub agitare, până când microorganismele au ajuns în faza logaritmică. Supernatantul a fost îndepărtat, iar sedimentul obținut a fost resuspendat în tampon fosfat (PBS), urmat de spălări cu PBS și centrifugare. În final, sedimentul a fost resuspendat în PBS, iar densitatea optică a fost determinată la 620 nm pentru a calcula numărul de UFC (unități formatoare de colonii) pe mililitru. Se dispersează un anumit volum care conține 4 x 107 CFU în fiecare farfurie. Volumul măsurat a fost amestecat și omogenizat în 15 ml de agaroză topită la mai mult sau mai puțin 45 °C. Această suspensie bacteriană a fost servită în plăci Petri și lăsată să se solidifice la temperatura camerei, după care s-au făcut găuri cu diametrul de 2 mm cu un perforator steril.
Eșantioanele de test au fost preparate dizolvând 1 mg de compus pur în 500 μL de DMSO, în care se introduc 8 μL de eșantion în dublu exemplar și se incubează la 37 °C timp de 30 min. După acest timp s-a adăugat mediul nutritiv, care conține agar agar topit și TSB, s-a incubat timp de 18 h la 37 ºC și apoi s-a măsurat diametrul zonelor de inhibiție în funcție de activitatea compusului. Controalele pozitive utilizate au fost diferite antibiotice, Ampicilină (50 mg/mL), Kanamicină (10 mg/mL) și Tetraciclină (4,12 mg/mL) la o diluție de 1:100 în PBS și au fost utilizate ca și controale negative DMSO și PBS, fiecare control 8 μL pentru fiecare puț. Diametrele zonelor de inhibiție au fost măsurate în milimetri, iar rezultatele au fost raportate ca unități de activitate în conformitate cu raportul care stipulează că 1 unitate de acțiune (UA) este egală cu 0,1 mm de zonă de inhibiție.
MATERIALE SUPLIMENTARE
MATERIALE SUPLIMENTARE
REGALMENTE DE RECUNOAȘTERE
Autorii doresc să mulțumească Universității Naționale din Columbia pentru sprijinul financiar acordat pentru acest proiect. De asemenea, se mulțumește laboratorului de rezonanță magnetică nucleară și laboratorului de spectrometrie de masă pentru sprijinul acordat în înregistrarea spectrelor RMN și, respectiv, a HR-ESI-MS. În plus, autorii ar dori să mulțumească Universității Javeriana pentru rotațiile optice, FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) pentru înregistrarea spectrelor CD și, în special, profesorului J. M. Lozano prin testele de activitate antibacteriană.
1. Takaku, S.; Haber. W.; Setzer, W.; Biochem. Syst. Ecol. 2007, 35, 525.
2. Guerrini, A.; Sacchetti, G.; Muzzolli, M.; Moreno, G.; Medici, A.; Besco, E.; Bruni R.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54 , 7778.
4. Ballabeni, V.; Tognoli, M.; Bertoni, S.; Bruni, R.; Guerrini, A.; Moreno, G.; Barocelli, E.; Pharmacol. Res. 2007, 55, 23.
5. Fournet, A.; Ferreira, M.; Rojas, A.; Guy, I.; Guinaudeau, H.; Heinzen, H.; Fitoterapia. 2007, 78, 382.
6. Palomino, E.; Maldonado, C.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 77.
7. Marques, R.; Batistuzzo, S.; Silva, C.; Barbosa, J.; Fassarella, L.; Mutat. Res. 2003, 536, 117.
8. López, H.; Valera, A.; J. Nat. Prod. 1995, 58, 782.
9. Zschocke, S.; Staden, J.; Paulus, K.; Bauer, R.; Horn, M.; Munro. O.; Brown N.; Drewes, S.; Phytochemistry 2000, 54, 591.
10. Lordello, A.; Yoshida, M.; Phytochemistry 1997, 46, 741.
11. Silva, I.; Barbosa, J.; Silva, M.; Silva, M.; Lacerda C. da-Cunha, E.; Biochem. Syst. Ecol. 2002, 30, 881.
12. Franca, N.; Giesbrecht, A.; Gottlieb, O.; Malgalhaes, A.; Malgalhaes, E.; Maia, J.; Phytochemistry 1975, 14, 1671.
13. Warrumby, S.; Lordello, A.; Quim. Nova 2007, 30, 92.
14. Wu, Y.; Chao, Y.; Chang, F.; Chen, Y.; Phytochemistry 1996, 46, 181.
15. Mathouet, H.; Elomri, A.; Lameiras, P.; Daich, A.; Vérité, P.; Phytochemistry 2007, 68, 1813.
16. Tantisewie, B.; Pharadai, T.; Pandhuganont, M.; Guinaudeau, H.; Freyer, A.; Shamma, M.; J. Nat. Prod. 1989, 52, 652.
17. Ringdahl, B.; Chan, R.; Craig, J.; J. Nat. Prod. 1981, 44, 80.
18. Nishiyama, Y.; Moriyasu, M.; Ichimaru, M.; Iwasa, K.; Kato, A.; Mathenge, S.; Chalo, P.; Juma, F.; Phytochemistry 2006, 67, 2671.
19. Castro, O.; Hasbun, C.; Calderon, M.; Fitoterapia 1991, 62, 72.
20. Chen, Y.; Chang, F.; Wu, Y.; J. Nat. Prod. 1996, 59, 904.
21. Zhao, O.; Zhao, Y.; Wang, K.; J. Ethnopharm. 2006, 106, 408.
22. Chang, F.; Wei, J.; Teng, C.; Wu. Y.; J. Nat. Prod. 1998, 61, 1457.
23. Gomez, Y.; Gil, K.; González, E.; Farías, L.; Rev. Biol. Biol. Trop. 2007, 55, 767.
24. Kuo, R.; Chang, F.; Chen, C.; Teng, C.; Yen, H.; Wu. Y.; Phytochemistry 2001, 57, 421.
25. Agnihotri, V.; ElSohly, H.; Khan, S.; Jacob, M.; Joshi, V.; Smillie, T.; Khan, I.; Walker, L.; Phytochem. Lett. 2008, 1, 89.
26. Ma, W.; Fukuski, Y.; Tahara, S.; Osawa, T.; Phytotherapy 2000, 71, 527.
27. Lerhrer R.; Rosenman, M.; Harwig. S.; Jackson, R.; Eisenhaver, P.; J. Inmunol. Metode. 1991, 137, 167.
28. Nimgirawath, S.; Udomputtimekakul, P.; Taechowisan, T.; Wanbanjob, A.; Shen Y.; Chem. Pharm. Bula. 2009, 57,
Recepționat 26/6/09; acceptat 6/11/09; publicat pe web 10/3/10
* email: [email protected]
MATERIE COMPLEMENTARĂ
.
