AmpR crește virulența Klebsiella pneumoniae rezistentă la carbapenem prin reglarea etapei inițiale a sintezei capsulelor

Introducere

Classical K. pneumoniae (cKp) și K. pneumoniae hipervirulentă (hvKp) sunt două patotipuri globale de K. pneumoniae care circulă în prezent.1,2 În America de Nord și Europa, cele mai multe infecții cu K. pneumoniae sunt cauzate de izolate cKp, care sunt cel mai adesea agenți patogeni oportuniști care provoacă infecții în principal în mediul de îngrijire a sănătății la gazde imunocompromise. Cea mai problematică caracteristică a acestui patotip este capacitatea de a dobândi un număr tot mai mare de elemente care conferă rezistență antimicrobiană. K. pneumoniae rezistent la carbapenem (CRKP) asociat cu carbapenemazele cu plasmidă codificată reprezintă provocări clinice distincte și produce infecții invazive cu o mortalitate ridicată.3,4

Raportările din Taiwan au descris un sindrom clinic unic de infecție cu K. pneumoniae dobândită în comunitate, cu invazie tisulară, la persoane sănătoase, care se prezintă adesea în mai multe locuri sau se răspândește ulterior, inclusiv în abcese hepatice piogene.5,6 hvKp a fost desemnată pentru a distinge acest patotip de cKp, iar incidența infecțiilor cauzate de hvKp a crescut constant în ultimele 3 decenii în țările din Asia-Pacific.7-11 hvKp este, de obicei, sensibilă la antimicrobiene, dar s-a constatat că este rezistentă și chiar a fost raportat un izolat de cKp extrem de rezistent la medicamente (XDR) care a dobândit o parte dintr-o plasmidă de virulență hvKp și care a provocat un focar nosocomial fatal.12-15

O caracteristică despre care s-a crezut inițial că este sensibilă și specifică pentru izolatele hvKp a fost un fenotip hipermucoviscos, care a fost definit printr-un test de string pozitiv.16 Cu toate acestea, a creat o anumită confuzie, deoarece nu toate izolatele hvKp au fost determinate ca fiind hipermucoviscoase, iar unele izolate cKp posedau această caracteristică.17 Recent, s-a demonstrat că mai mulți biomarkeri, inclusiv peg-344, iroB, iucA, rmpA și rmpA2 codificate în plasmidă și producția cantitativă de siderofori, prezic cu exactitate izolatele hvKp; acești biomarkeri ar putea fi folosiți pentru a dezvolta un test de diagnostic care să fie utilizat de laboratoarele clinice pentru îngrijirea optimă a pacienților și pentru a fi utilizat în supravegherea epidemiologică și în cercetare.18 Cu toate acestea, în acest studiu, am identificat un nou grup de izolate CRKP non-hipermucoviscoase, lipsite de majoritatea genelor specifice hvKp. Un studiu de asociere la nivelul întregului genom (Pan-GWAS), o analiză a proteomului și un test de virulență pe un model animal au arătat că AmpR crește virulența acestor izolate prin reglarea inițierii sintezei capsulei. Mai mult decât atât, am constatat, de asemenea, că AmpR purtat de tulpinile K-locus 47 (KL47) din acest studiu nu a fost capabil să crească virulența K. pneumoniae hipermucoviscos KL1.

Materiale și metode

Izolate clinice și colectare de date

Izolatele clinice ne-repetitive de K. pneumoniae au fost colectate din probele detectate și stocate de rutină din departamentul de medicină de laborator al 5 spitale din provinciile Guangdong și Anhui între 2018 și 2019. Toate izolatele au fost depozitate la -80°C înainte de utilizare. Au fost obținute informații clinice despre pacienți. Identificarea speciilor și testarea sensibilității antimicrobiene au fost efectuate cu sistemul compact VITEK-2 (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Franța). Rezultatele au fost interpretate în conformitate cu orientările publicate de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; documentul M100-S26).19 Speciile identificate ale tuturor izolatelor au fost confirmate cu ajutorul spectrometriei de masă cu desorbție/ionizare laser asistată de matrice (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Franța). CRKP a fost definit ca fiind rezistent la imipenem sau meropenem.

Caracterizare fenotipică hipermucoviscoasă

Pentru a identifica fenotipul hipermucoviscoasă cu ajutorul testului cu șnur, izolatele au fost inoculate pe plăci de agar conținând 5% sânge de oaie și incubate la 37°C peste noapte. Testul șirului a fost considerat pozitiv atunci când un șir vâscos mai lung de 5 mm a putut fi generat prin atingerea unei singure colonii cu o ansa de inoculare standard și tragerea coloniei în sus.2

Secvențierea întregului genom (WGS)

Un volum de cultură de 1 ml (densitate optică la 600 nm de 0,6) a fost utilizat pentru extragerea ADN genomic (gDNA) (Sangon, Shanghai, China). gDNA a fost secvențiat pe un secvențiator Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, SUA) utilizând lecturi de 150-bp de tip paired-end. Asamblarea genomului a fost realizată cu ajutorul de novo SPAdes Genome Assembler (versiunea 3.12.0).20 Am efectuat tipărirea capsulelor pe secvențele asamblate cu Kaptive (versiunea 0.5.1).21 Genele de rezistență antimicrobiană și factorii de virulență au fost identificați în izolate prin scanarea contigurilor genomului cu bazele de date ResFinder și VFDB folosind ABRicate (versiunea 0.8.7). Analizele de tipare a secvențelor multilocus (MLST) și de genotipare a genotipurilor core genome MLST (cgMLST) au fost efectuate cu Ridom SeqSphere+ (versiunea 5.1.0).22 Tipul complex (CT) a fost definit conform schemei cgMLST pentru K. pneumoniae (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Construirea arborelui filogenetic pe baza variantelor de nucleotide unice (SNV) din genomul central a fost realizată cu ajutorul suitei Harvest (versiunea 1.2) cu un test 1000-bootstrap.23 Instrumentul online iTOL a fost utilizat pentru a afișa, manipula și adnota arborele filogenetic.24 Am adnotat secvențele genomului cu Prokka (versiunea 1.13.3).25

Analiză Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Am folosit pipeline-ul Pan Genome Roary (versiunea 3.12.0) pentru a pune ansamblurile adnotate în format GFF3 (produs de Prokka) și am calculat pan genomul.26 Am folosit Scoary (versiunea 1.6.16) pentru a lua fișierul din „https://sanger-pathogens.github.io/Roary/”, am creat un fișier de trăsături și am calculat asocierile dintre toate genele din genomul accesoriu și trăsăturile. Am raportat o listă de gene ordonate în funcție de puterea asocierii cu valoarea P < 0,01 ajustată cu metoda Benjamini-Hochberg pentru corecția comparațiilor multiple.27

Analiza proteomului

Pentru extragerea proteinelor s-a folosit un volum de cultură de 1 ml (densitate optică la 600 nm de 0,6). Proba a fost sonicată de trei ori la gheață cu ajutorul unui procesor cu ultrasunete de înaltă intensitate (Scientz) în tampon de liză (8 M uree, 1% cocktail de inhibitori de protează). Resturile rămase au fost îndepărtate prin centrifugare la 12.000 g la 4°C timp de 10 minute. În cele din urmă, supernatantul a fost colectat, iar concentrația de proteine a fost determinată cu un kit BCA în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Pentru digestie, soluția de proteine a fost redusă cu ditiotreitol 5 mM timp de 30 de minute la 56°C și alchilată cu iodoacetamidă 11 mM timp de 15 minute la temperatura camerei, la întuneric. Proba de proteine a fost apoi diluată prin adăugarea de 100 mM TEAB cu uree la o concentrație mai mică de 2M. În cele din urmă, s-a adăugat tripsină la un raport de 1:50 trypsină/masă proteică pentru prima digestie peste noapte și la un raport de 1:100 trypsină/masă proteică pentru o a doua digestie de 4 ore. Peptidele triptice au fost dizolvate în acid formic 0,1% (solvent A) și încărcate direct pe o coloană analitică cu fază inversă de casă (15 cm lungime, 75 μm d.i.). Gradientul a fost realizat după cum urmează: o creștere de la 6 % la 23 % solvent B (0,1 % acid formic în 98 % acetonitril) în 26 min, o creștere de la 23 % la 35 % solvent B în 8 min, o creștere la 80 % solvent B în 3 min și menținerea la 80 % solvent B pentru ultimele 3 min la un debit constant de 400 nL/min pe un sistem EASY-nLC 1000 UPLC. Peptidele au fost supuse sursei NSI, urmată de spectrometrie de masă în tandem (MS/MS) în Q ExactiveTM Plus (Thermo) cuplat online la UPLC. Tensiunea de electrospray aplicată a fost de 2,0 kV. Intervalul de scanare m/z a fost de la 350 la 1800 pentru scanare completă, iar peptidele intacte au fost detectate în Orbitrap la o rezoluție de 70.000. Peptidele au fost apoi selectate pentru MS/MS utilizând setarea NCE de 28, iar fragmentele au fost detectate în Orbitrap la o rezoluție de 17.500. Procedura în funcție de date a alternat între o scanare MS urmată de 20 de scanări MS/MS cu o excludere dinamică de 15,0 s. Controlul automat al câștigului (AGC) a fost setat la 5E4. Prima masă fixă a fost setată la 100 m/z. Datele MS/MS rezultate au fost procesate cu ajutorul motorului de căutare MaxQuant (v.1.5.2.8). Am utilizat InterProScan (versiunea 5.37-76.0) pentru a adnota domeniile proteice. O valoare p corectată < 0,05 și o schimbare fold > 1,2 au fost considerate semnificative.

Construcția mutantului de complement ampR

K. pneumonia ampR (Materiale suplimentare) a fost sintetizat și flancat cu situri de restricție 5ʹXbaI și 3ʹHindIII. Acest fragment a fost digerat prin restricție și clonat în pUC57. ADN recombinant a fost recuperat în Escherichia coli DH5α cu selecție cu ampicilină. După digestia de restricție, fragmentul ampR a fost ligat la vectorul de expresie pBAD33 (Invitrogen) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. pBAD33-ampR a fost utilizat pentru transformare folosind electroporarea ca standard pentru E. coli izolat în laborator. Tulpinile de complement ampR au fost confirmate prin reacția în lanț a polimerazei (PCR) (tabelul S1). Expresia ampR a fost indusă prin adăugarea a 100 μg/mL arabinoză.

Modeluri de infecție pulmonară la șoareci

Un model de pneumonie de K. pneumoniae la șoareci a fost utilizat pentru a testa virulența izolatelor. Șoareci BALB/c de sex feminin în vârstă de șase până la opt săptămâni, în condiții specifice fără agenți patogeni, au fost achiziționați de la Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. Șoarecii au fost anesteziați intraperitoneal cu pentobarbital sodic (75 mg/kg) și au fost inoculați cu 1,0 × 107 unități formatoare de colonii (CFU) de K. pneumoniae prin instilație intratraheală neinvazivă sub vizibilitate directă. Supraviețuirea șoarecilor a fost observată timp de 7 zile după infectare. Pentru a evalua încărcătura bacteriană în plămâni, organele de la șoarecii infectați au fost omogenizate și dizolvate în 1 ml de soluție tampon de fosfat (PBS); 50 μL au fost inoculate pe plăci de agar bulion lichid (LB) și s-a efectuat numărarea CFU. Pentru analiza histopatologică, segmente de plămâni au fost fixate cu 10% formalină neutră, încorporate în parafină și colorate cu hematoxilină și eozină pentru vizualizare prin microscopie optică. Încărcătura bacteriană și analiza histopatologică au fost efectuate după 24 de ore de infecție.

Extragerea și cuantificarea polizaharidelor capsulare

Polizaharidele capsulare au fost extrase cu detergent Zwittergent 3-14. Cantitatea de acid uronic a fost apoi măsurată în conformitate cu metoda descrisă anterior.28 În paralel, diluții în serie ale culturii bacteriene au fost placate pentru a determina numărul de UFC, iar concentrația de polizaharide capsulare a fost exprimată în funcție de cantitatea de acid glucuronic (μg) pentru 109 UFC/mL de probă. Fiecare experiment a fost realizat în triplu exemplar.

Analiză statistică

Analiza statistică a fost realizată cu ajutorul software-ului GraphPad Prism versiunea 8 (La Jolla, California).

Rezultate

Caracteristicile izolatelor

În acest studiu au fost utilizate izolate CRKP nerepetitive (n = 135). Toate izolatele au fost de tipul de secvență 11 (ST11) și au exprimat carbapenemază K. pneumoniae (KPC-2), iar 1 izolat a fost purtător atât de OXA-23, cât și de KPC-2 (figura S1). Izolații au fost atribuiți la 16 CT utilizând schema cgMLST. Cele mai frecvente CT-uri au fost CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) și CT2410 (n = 11), urmate de alte 11 CT-uri identificate în mai puțin de 10 izolate fiecare (figura 1). Toate izolatele au fost atribuite la două tipuri de KL, KL64 (n = 86) și KL47 (n = 49) (figura S2). Nu s-au găsit izolate hipermucoviscoase. Analiza genelor de virulență a arătat că niciun izolat purtător al tuturor biomarkerilor pentru diferențierea izolatelor hvKp și cKp nu a fost raportat anterior (Figura 1, Figura S2).18

Figura 1 Analiza filogenetică a celor 135 de izolate din acest studiu. Ramurile diferitelor izolate de tip CT sunt reprezentate în culori. Izolatele corespunzătoare fiecărui tip CT sunt CT1291 (de la P1291-1 la P1291-20), CT1313 (de la P1313-1 la P1313-33, de la AH1313-1 la AH1313-2), CT1689 (de la AH1689-1 la AH1689-8), CT1772 (de la AH1772-1 la AH1772-4), CT1814 (de la AH1814-1 la AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (de la P2405-1 la P2405-9), CT2410 (de la P2410-1 la P2410-11), CT2418 (de la P2418-1 la P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (de la P2445-1 la P2445-6), CT3175 (de la AH3175-1 la AH3175-2), CT3176 (de la AH3176-1 la AH3176-14), CT3178 (de la AH3178-1 la AH3178-4), CT3179 (de la AH3179-1 la AH3179-2) și CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 și iucA au fost identificate pentru diferențierea K. pneumoniae hipervirulent de K. pneumoniae clasic într-un studiu anterior.18

Analiza datelor clinice

Nu au existat diferențe semnificative între CT-uri în ceea ce privește datele demografice, tipurile de infecții, principalele comorbidități, operațiile invazive, indicele de comorbiditate Charlson și scorul de bacteriemie Pitt, cu excepția cateterului venos central, și mortalitatea intraspitalicească din toate cauzele (P = 0,035 și P = 0,001, testul exact Fisher). Pacienții infectați cu CT3176 au avut rate de mortalitate semnificativ mai mari (78,6 % față de 37,1 %, P = 0,012; 78,6 % față de 20,0 %, P = 0,001; 78,6 % față de 7,7 %, P = 0,0003; 78,6 % față de 31,0 %, P = 0,004; testul exact Fisher) în comparație cu grupurile CT1313, CT1291, CT1814 și, respectiv, cu celelalte grupuri CT. Utilizarea cateterelor venoase centrale în CT1814 a fost semnificativ mai mare decât cea din CT1313 și CT1291 (84,6% vs 51,4%, P = 0,049; 84,6% vs 35,0%, P = 0,011, testul exact Fisher) (tabelul 1).

Tabel 1 Date demografice, comorbidități, proceduri invazive și mortalitatea pacienților cu infecții cu Klebsiella pneumoniae rezistentă la carbapenem

Analiză Pan-GWAS

Pentru a identifica baza genetică a CT3176, am efectuat o analiză Pan-GWAS între grupurile CT3176 și non-CT3176. Am identificat 39 de gene cu funcții cunoscute asociate cu CT3176 (P < 0,01 ajustat cu metoda Benjamini-Hochberg) (figura 2), inclusiv factori de virulență, gene de sinteză a capsulelor, gene de rezistență antimicrobiană și transportatori de eflux multidrog. Dintre acestea, ampR a avut cea mai mare asociere cu CT3176. Cu toate acestea, am observat că alte CT, cum ar fi CT3178 și unele izolate CT1689 (AH1689-2 și AH1689-6), purtau, de asemenea, gena ampR (figura 1). Toate izolatele purtătoare ale genei ampR aparțin KL47.

Figura 2 Analiza Pan-GWAS între grupurile CT3176 și non-CT3176. Pangenomul și asociațiile au fost calculate cu Roary și Scoary. O hartă grafică a fost generată cu ggplot2.

Analiza proteomului

Trei izolate ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 și AH1689-2) și trei izolate ampR- (AH1689-3, AH1689-4 și AH1689-5) au fost selectate pentru analiza proteomului. Un total de 3093 de proteine au fost identificate în ambele grupuri pe baza a 36.727 de peptide unice. În cele din urmă, am identificat 24 de proteine exprimate diferențiat (DEPs). Dintre acestea, 15 au fost suprareglementate, iar 9 au fost reduse în izolatele ampR+ în comparație cu izolatele ampR- (figura 3A-C, tabelul S2). WcaJ a avut cea mai mare modificare fold și, prin urmare, a fost evidențiată.

Figura 3 Analiza proteomului și colorarea capsulei. (A) Graficul Volcano care arată comparația expresiei cantitative a proteinelor între izolatele de Klebsiella pneumoniae ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 și AH3178-1) și ampR- (AH1689-3, AH1689-4 și AH1689-5). (B, C) Proteinele exprimate diferențiat cu o schimbare de peste 1,2 ori sunt marcate în culori.

Virulența în modele animale și cuantificarea capsulei

Cu scopul de a identifica rolul ampR în virulența izolatelor CRKP non-hipermucoviscoase, am selectat trei izolate (AH3176-1, AH1689-2 și AH1689-3), și am testat virulența într-un model de șoarece. AH3176-1 și AH1689-2 au fost două izolate ampR+, în timp ce AH1689-3 a fost izolatul ampR- (figura 1). În plus, am selectat, de asemenea, două tulpini hipermucoviscoase GM2 și GM6 din colecția noastră pentru a testa virulența. Atât GM2, cât și GM6 fac parte din KL1, dintre care GM6 poartă gena ampR, în timp ce GM2 nu. Cu toate acestea, secvența ampR a tulpinii nehipermucoviscoase KL47 a fost diferită de cea a tulpinii hipermucoviscoase KL1, astfel încât în acest studiu au fost denumite ampRKL1 și, respectiv, ampRKL47.

După cum se arată în figura 4A, AH3176-1 și AH1689-3:ampRKL47 plus arabinoză au avut o supraviețuire de 0% cu un inocul de 1 × 107 unități formatoare de colonii (CFU) la 4 d postinfecție, în timp ce la 7 d postinfecție s-a observat o supraviețuire de 20% cu AH1689-2, 40% cu AH1689-3:ampRKL47 fără arabinoză, 60% cu AH1689-3:pBAD33 și ATCC70721 și 80% cu AH1698-3. Rata de supraviețuire a scăzut semnificativ după complementarea cu gena ampRKL47 la AH1689-3 (n = 10; P = 0,033, test log-rank Mantel-Cox), sugerând rolul important al ampR în virulență. Infecția șoarecilor cu AH3176-1 a dus la o UFC de aproximativ 10-100 de ori mai mare în plămâni în comparație cu alte izolate (figura 4B). Patologia plămânilor a arătat grade diferite de îngroșare a peretelui alveolar, infiltrare limfocitară și sângerare intravasculară în grupul de infecție. Dintre acestea, modificările patologice pulmonare cauzate de AH3176-1 au fost cele mai grave, prezentându-se sub forma unei consolidări pulmonare extinse și a unei hemoragii intraalveolare (figura 4D-F).

Figura 4 Potențialul de virulență al izolatelor de Klebsiella pneumoniae nehipermucoviscoase într-un model de infecție pulmonară la șoarece. (A) A fost evaluat efectul asupra supraviețuirii a 1 × 107 unități formatoare de colonii (UFC) de AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 și AH1689-3 mutant de complement ampRKL47. (B) La 24 de ore post-infecție (hpi), plămânii șoarecilor infectați au fost recoltați, iar încărcătura bacteriană a fost determinată prin numărarea CFU (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, ANOVA cu o singură cale). Datele sunt reprezentative pentru 3 experimente independente. (C) Producția de acid uronic a diferitelor tulpini. S-a efectuat un test t al lui Student nepereche cu două fețe. Fiecare punct de date a fost repetat de trei ori (n = 3). Datele sunt prezentate ca medie ± s.e.m. *P < 0,05, ns = fără semnificație. Plămânii șoarecilor fără infecție (D) sau infectați cu ATCC700721 (E) și AH3176-1 (F) au fost colectați și colorați cu hematoxilină și eozină. Toate imaginile sunt la mărire ×40. Barele de scară: 250 μM.

După cum se arată în figura 5A, rata de supraviețuire a șoarecilor infectați cu GM6 a fost semnificativ mai mică decât cea a GM2 și ATCC700721. O scădere a ratei de supraviețuire a fost observată după complementarea ampRKL1 în GM2. În plus, încărcătura bacteriană din plămânii șoarecilor infectați cu GM6 a fost semnificativ mai mare decât cea a șoarecilor infectați cu GM2 și ATCC700721 (figura 5B); colorația HE a arătat că infecția cu GM6 a provocat o consolidare extinsă a plămânilor și hemoragii intraalveolare (figura 5E-G). Cu toate acestea, rata de supraviețuire nu a fost afectată dacă ampRKL47 a fost introdus în GM2 (figura 5C).

Figura 5 Potențialul de virulență al izolatelor Klebsiella pneumoniae hipermucoviscoase într-un model de infecție pulmonară la șoarece. (A) A fost evaluat efectul a 1 × 106 unități formatoare de colonii (UFC) de GM2, GM6 și GM2 ampRKL1 complement mutant asupra supraviețuirii (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, test log-rank Mantel-Cox),). (B) La 24 ore post-infecție (hpi), plămânii șoarecilor infectați au fost recoltați, iar încărcătura bacteriană a fost determinată prin numărarea CFU (n = 10; **P < 0,01, ANOVA cu o singură cale). Datele sunt reprezentative pentru 3 experimente independente. (C) A fost evaluat efectul a 1 × 106 CFU de GM2 și GM2 ampRKL47 mutant de complement GM2 asupra supraviețuirii. (D) Producția de acid uronic a diferitelor tulpini. S-a efectuat un test t al lui Student nepereche cu două fețe. Fiecare punct de date a fost repetat de trei ori (n = 3). Datele sunt prezentate ca medie ± s.e.m. *P < 0,05, ns = fără semnificație. Plămânii șoarecilor fără infecție (E) sau infectați cu GM2 (F) și GM6 (G) au fost colectați și colorați cu hematoxilină și eozină. Toate imaginile sunt la mărire ×40. Barele de scară: 250 μM.

Din moment ce capsula este principalul factor de virulență al K. pneumonia și WcaJ care a fost evidențiat conform rezultatului analizei proteomului reglează etapa inițială a sintezei capsulei, am investigat cantitățile de producție de polizaharide capsulare. Rezultatul a arătat că tulpinile complementare ampR AH1689-3:ampRKL47 și GM2:ampRKL1 plus arabinoză au produs semnificativ mai mult polizaharid capsular (acid uronic) decât AH1689-3 și, respectiv, GM2 (Figura 4C, Figura 5D).

Discuție

MLST a fost cea mai frecvent utilizată tehnică pentru definirea populațiilor de K. pneumoniae. Cu WGS rapid și accesibil, este posibil să se compare genomuri întregi pentru tipizarea izolatelor, mai degrabă decât doar câțiva loci, ca în MLST tradițional. Genotiparea cu cgMLST utilizează mii de alele din întregul genom, ceea ce duce la un nivel mai ridicat de discriminare a izolatelor. În acest studiu, am utilizat cgMLST pentru a clasifica 135 de izolate CRKP clinice și am constatat diferențe între tipurile de CT pe baza informațiilor clinice. Din cauza numărului limitat de cazuri, nu am reușit să obținem o asociere între tipurile de CT și rezultatul clinic. Cu toate acestea, diferențele în ceea ce privește ratele de mortalitate ne-au permis să investigăm în continuare izolatele aparținând CT3176. Analiza GWAS a arătat că gena ampR a fost asociată în mod semnificativ cu izolatele CT3176.

Studii anterioare au arătat că regulatorul AmpR al β-lactamazei AmpC, un membru al familiei LysR de factori de transcripție, controlează, de asemenea, mai multe mecanisme de virulență la Pseudomonas aeruginosa.29,30 Până în prezent, doar un singur articol a raportat rolul AmpR în reglarea virulenței lui K. pneumoniae. Un izolat clonal de K. pneumoniae a arătat că puține gene de virulență cunoscute erau responsabile de infecții severe. AmpR în aceste izolate a fost implicată în creșterea sintezei capsulelor, a modulat formarea biofilmului și expresia genei fimbriale de tip 3, precum și colonizarea tractului gastrointestinal murin.31 Cu toate acestea, nivelul de virulență al acestor izolate rămâne neclar din cauza lipsei de date privind modelele de infecție letală. În acest studiu, am folosit un model de pneumonie pentru a confirma virulența sporită a acestor izolate purtătoare de ampR. Acest lucru ar explica de ce pacienții infectați cu aceste izolate au avut o rată ridicată a mortalității.

Anterior, era obișnuit ca K. pneumoniae de tip ST11 să fie rezistent la carbapeneme, dar nu hipervirulent. Cu toate acestea, în 2017, a fost raportat un focar de infecții spitalicești cauzate de izolate K. pneumoniae hipervirulente ST11 rezistente la carbapeneme. Fenotipul de hipervirulență al acestor izolate s-a datorat achiziționării unei plasmide de virulență asemănătoare pLVPK de aproximativ 170 kbp de către izolatele CRKP clasice aparținând ST11 și serotipului K47.15 Spre deosebire de raportul de mai sus, în acest studiu nu s-au găsit plasmide de virulență în izolatele ST11 CRKP cu virulență sporită, ceea ce sugerează că sporirea virulenței nu s-a datorat mecanismului clasic.32 Spre deosebire de plasmidă de virulență, care conține mai mulți factori de virulență, AmpR poate crește virulența în mod independent. Acest lucru a fost confirmat prin testarea virulenței tulpinii de complement AmpR.

WcaJ este enzima care inițiază sinteza acidului colanic și încarcă primul zahăr (glucoză-1-P) pe suportul lipidic undecaprenil fosfat. Rolul potențial al WcaJ în virulența lui K. pneumoniae a fost definit recent.33 Rezultatele analizei proteomului sugerează că AmpR sporește virulența lui K. pneumoniae prin reglarea etapei inițiale a sintezei capsulei. În calitate de regulator, AmpR trebuie să se lege de promotorul genei pentru a-și exercita rolul de regulator. Până în prezent, au fost identificate multe tipuri de capsule în K. pneumoniae,34 iar absența situsurilor de legare a AmpR în unele tipuri de capsule poate explica de ce virulența izolatelor KL1 nu poate fi potențată de AmpR care se găsește în izolatele KL47.

Noi dovezi au sugerat că hipermucoviscozitatea și hipervirulența sunt fenotipuri diferite care nu ar trebui utilizate ca sinonime. În plus, este important să se stabilească faptul că un test de string negativ este insuficient pentru a determina dacă un izolat este hipervirulent.35 O constatare cheie a lucrării noastre a fost că am identificat subclona CRKP ST11 nehipermucoviscoasă cu virulență sporită.

Principala limitare a acestui studiu este că există doar un număr mic de cazuri; prin urmare, nu putem studia relația dintre rezultatele clinice și infecția CRKP nehipermucoviscoasă hipervirulentă. De asemenea, nu am reușit să construim tulpina ampR knockout, iar acest lucru poate fi explicat prin faptul că analiza genomică a arătat că ampR a fost localizat putativ pe plasmidă (Figura S3). Deoarece tulpinile cu fenotip non-hipermucoviscos se disting cu greu în clinică, este nevoie urgentă de supravegherea și investigarea continuă a acestor noi tulpini.

.