Anakinra, un antagonist al receptorului uman recombinant al interleukinei-1, inhibă apoptoza în infarctul miocardic acut experimental

Infarctul miocardic acut (IAM) este o cauză majoră de morbiditate și mortalitate la nivel mondial. IAM este cauzat de apariția bruscă a ischemiei miocardice și a necrozei care urmează. Supraviețuitorii IAM rămân cu un risc ridicat de deces în anii de după evenimentul index. Deoarece tratamentul pentru IMA s-a îmbunătățit semnificativ în ultimii ani, tot mai mulți pacienți supraviețuiesc IMA. Cea mai frecventă complicație a IMA este apariția disfuncției ventriculare stângi și a insuficienței cardiace. Leziunile ischemice inițiale ale miocardului activează o cascadă de evenimente care, în cele din urmă, duc la remodelare cardiacă nefavorabilă și insuficiență cardiacă, cu excese ulterioare de morbiditate și mortalitate.1 Procesul de remodelare care are loc în miocardul ischemic și non-ischemic este mediat de reglarea în sus și în jos a diferitelor căi care declanșează hipertrofia și apoptoza cardiomiocitelor într-un echilibru delicat între moarte și supraviețuire.1,2 Antagonistul receptorului antagonist al interleukinei-1 (IL-1) (IL-1Ra), un membru al familiei IL-1, este o proteină antiinflamatorie naturală care se comportă ca un reactant de fază acută.3,4 Ca și alți reactanți de fază acută, nivelurile IL-1Ra cresc în timpul IMA, iar nivelurile sale sunt corelate cu prognosticul.5,6 Rolul creșterii IL-1Ra în timpul IMA este neclar și au fost făcute speculații că rolul său variază de la un simplu marker al leziunilor la un modulator al răspunsului inflamator și până la un potențial agent citoprotector.5,8 Recent, exprimarea forțată a IL-1Ra într-un model animal s-a dovedit a fi cardioprotectoare în ceea ce privește reducerea dimensiunii infarctului și a apoptozei.8

În studiul de față, am investigat efectele anakinrei, o IL-1Ra umană recombinantă exogenă, în 2 modele experimentale utilizând ligatura chirurgicală a arterei coronare stângi la rozătoare: un studiu al administrării imediate de anakinra în modelul de șoarece pentru a evalua efectele sale asupra apoptozei, dimensiunii infarctului și remodelării și un studiu al administrării întârziate (24 de ore) de anakinra pentru a evalua efectele sale asupra apoptozei, independent de potențialele efecte de economisire a infarctului și asupra remodelării cardiace în modelul de șobolan (pentru a evalua, de asemenea, potențialele diferențe interspecii). În plus, efectul antiapoptotic al anakinrei a fost testat in vitro.

Metode

Proceduri chirurgicale

Toate animalele au fost furnizate de Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind). Toate experimentele pe animale au fost efectuate sub îndrumarea liniilor directoare privind utilizarea și îngrijirea umană a animalelor de laborator pentru cercetarea biomedicală publicate de National Institutes of Health (nr. 85-23, revizuit în 1996). Șoarecilor adulți masculi din rasa outbred Institute of Cancer Research (vârstă, 10 săptămâni; greutate, 26 până la 38 g) și șobolanilor adulți Wistar (vârstă, 10 săptămâni; greutate, 350 până la 500 g) li s-a făcut o ligatură coronariană. Procedurile chirurgicale au fost efectuate în ziua 1 de către 2 operatori calificați (F.N.S. și S.S.), așa cum a fost descris anterior.9,10 Animalele sub anestezie (pentobarbital 50 până la 70 mg/kg) au fost intubate și plasate în decubit drept și apoi au fost supuse deschiderii chirurgicale a pieptului și ligaturii arterei coronare stângi proximale. Opt șoareci și 8 șobolani au fost supuși unei operații simulate care a inclus toate etapele, cu excepția ligaturii coronariene; jumătate dintre ei au fost tratați cu injecții zilnice de anakinra (1 mg/kg), iar cealaltă jumătate a fost tratată cu injecții saline. Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea Virginia Commonwealth a aprobat studiul. Zece șoareci și 4 șobolani au murit în perioada postoperatorie imediată și nu au fost incluși în niciuna dintre analize.

Tratament

Au fost efectuate două substudii: administrarea imediată de anakinra în timpul ischemiei la șoarece și administrarea întârziată de anakinra la 24 de ore după ischemie la șobolan. În modelul de șoarece, anakinra 1 mg/kg (corespunzător dozei recomandate pentru tratamentul artritei reumatoide) a fost administrată intraperitoneal în timpul intervenției chirurgicale și apoi zilnic, timp de 6 doze, la 20 de șoareci (16 cu ligatură coronariană și 4 șamd). În modelul de șobolan, anakinra a fost administrată intraperitoneal în ziua 2 și apoi zilnic, timp de 5 doze, la 8 șobolani (4 cu ligatură coronariană și 4 operați în mod simulat). Restul de 24 de șoareci (20 cu ligatură coronariană și 4 șobolani sham-operați) și 12 șobolani (8 cu ligatură coronariană și 4 șobolani sham-operați) au primit injecții cu NaCl 0,9% (soluție salină). Două specii diferite de rozătoare au fost utilizate pentru a evalua potențialele diferențe interspecii. Un număr suplimentar de 28 de șoareci au fost supuși evaluării dimensiunii infarctului la 24 de ore după operație: 6 șoareci tratați cu soluție salină și 22 de șoareci tratați cu doze crescânde de anakinra (1 mg/kg , 10 mg/kg și 100 mg/kg ) pentru a evalua potențialele efecte de economisire a infarctului dependente de doză ale anakinrei. În cele din urmă, alți 6 șoareci (3 tratați cu anakinra și 3 tratați cu soluție salină) au fost eutanasiați la 7 zile după ligatura coronariană pentru evaluarea expresiei metaloproteinazei matricei-9 (MMP-9). Un total de 78 de șoareci și 20 de șobolani au fost utilizați în acest studiu.

Evaluarea dimensiunii infarctului

La 24 de ore după finalizarea protocolului de infarct, inima a fost rapid îndepărtată și montată pe un aparat Langendorff. Arterele coronare au fost perfuzate cu NaCl 0,9% care conținea 2,5 mmol/L CaCl2. După ce sângele a fost spălat, ≈2 ml de colorant albastru Evans 10% au fost injectate ca un bolus în aortă până când cea mai mare parte a inimii a devenit albastră. Inima a fost perfuzată cu soluție salină pentru a spăla excesul de albastru Evans. În cele din urmă, inima a fost îndepărtată, congelată și tăiată în 8 până la 10 felii transversale de la apex la bază de grosime egală (≈1 mm). Feliile au fost apoi incubate într-o soluție de clorură de trifenil tetrazoliu 10% într-un tampon fosfat izotonic (pH 7,4) la temperatura camerei timp de 30 de minute. Zonele de țesut infarct, zona de risc și întregul ventricul stâng au fost determinate prin morfometrie computerizată cu ajutorul software-ului de imagistică BIOQUANT (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Dimensiunea infarctului a fost exprimată ca procent din zona de risc ischemic, care a fost determinată ca procent din ventriculul stâng.

Ecocardiografie

Ecocardiografia transtoracică sub anestezie ușoară (pentobarbital 30 până la 50 mg/kg) a fost efectuată chiar înainte de operație și la 7 zile după operație, chiar înainte de deces. Ecocardiografia Doppler a fost efectuată cu sistemul de imagistică Vevo770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada) și o sondă de 30-MHz la șoarece; la șobolan s-a folosit un sistem de ecocardiografie echipat cu un transductor cu rețea de fază de 15-MHz (Hewlett-Packard, Palo Alto, California). Transductorul a fost poziționat pe partea anterioară stângă a toracelui. Inima a fost mai întâi imaginată în modul bidimensional în vederea pe axa scurtă a ventriculului stâng. Cursorul în modul M a fost poziționat perpendicular pe peretele anterior și posterior pentru a măsura diametrul diastolic final al ventriculului stâng (LV) și diametrul sistolic final (LVEDD și, respectiv, LVESD). În conformitate cu recomandările Societății Americane de Ecocardiografie,11 imaginile în mod M au fost apoi obținute la nivelul mușchilor papilari sub vârful valvei mitrale. La șoarece, s-au obținut, de asemenea, vederi apicale cu 4 și 5 camere pentru a măsura fluxul transmisral, fluxul de ieșire al ventriculului stâng și vitezele fluxului transaortic. Scurtarea fracționată (FS) a LV a fost calculată după cum urmează: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Fracția de ejecție a fost calculată cu formula Teichholz. Spectrele de flux Doppler pulsat Doppler transmiterale și ale tractului de ieșire al ventriculului stâng au fost obținute din vedere apicală. S-a efectuat măsurarea fluxului tractului de ieșire. S-au măsurat timpii de contracție izovolumetrică (ICT) și de relaxare (IRT) și timpul de ejecție (ET). S-a măsurat, de asemenea, integrala vitezei de curgere în timp (AoVTI) a tractului de ieșire al LV (LVOT). Aceste date au fost utilizate pentru a calcula indicele Tei (indicele Tei=ICT+ IRT/ET)12 și debitul cardiac (CO=AoVTI×π×(diametru LVOT/2)2×frecvență cardiacă, unde LVOT a fost măsurat ca suprafață a secțiunii transversale în vedere parasternală pe axa lungă). La om, un indice Tei mai mare este asociat atât cu disfuncția sistolică, cât și cu cea diastolică și cu rezultate mai proaste.12 Alocarea la diferite tratamente a fost aleatorie, iar investigatorul care a efectuat și a citit ecocardiograma a fost orbit în ceea ce privește tratamentul.

Patologie

În ziua 7, după ecocardiografie și sub anestezie, aorta abdominală a fost canulată cu un cateter de polietilenă, toracele a fost deschis, aorta a fost umplută cu tampon fosfat (0,2 mol/L, pH 7,4) și heparină (100 UI), iar atriul drept a fost tăiat pentru a permite drenajul. În succesiune rapidă, inima a fost oprită în diastole și s-a început perfuzia cu formol tamponat cu fosfat. Numai la șobolani, s-au obținut 1 până la 2 ml de sânge integral din inimă pentru determinarea plasmei de citokine. Camera ventriculară stângă a fost umplută cu fixator pentru o fixare de 10 minute. La sfârșitul procedurii, s-au prelevat secțiuni transversale din treimea mediană a ventriculului stâng și s-au păstrat în formol timp de cel puțin 48 de ore. Apoptoza a fost definită prin colorarea pentru marcarea terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL; fragmentare ADN, Oncor, Gaithersburg, Md). Protocolul detaliat a fost publicat în altă parte.13 Zona periinfarctului a fost definită ca fiind zona limitrofă infarctului în care predomina miocardul viabil.13 Rata apoptozei a fost exprimată ca număr de cardiomiocite apoptotice pe toate cardiomiocitele pe câmp. S-a efectuat colorarea pentru TUNEL și actina musculară (anticorp anti-actină α-sarcomerică de șoarece prediluat, Invitrogen, San Francisco, Calif) pentru a documenta tipul de celule. Am luat în considerare în primul rând apoptoza în cardiomiocite, dar am măsurat, de asemenea, apoptoza în țesutul de granulație (celule mononucleare cu actină negativă) din zonele infarctului.

Numărul de leucocite din miocard a fost măsurat ca număr de celule CD45+ pe 1 mm2 (folosind un anticorp CD45 anti-șoarece, diluție 1:100, Southern Biotech, Birmingham, Ala) și a fost comparat între șoarecii cu IAM tratați cu anakinra și cei tratați cu soluție salină. Rata apoptotică în regiunile peri-infarctale a fost calculată în 10 câmpuri aleatorii, care acoperă aproape întreaga zonă peri-infarctală. Investigatorii care au efectuat numărarea celulelor nu au fost conștienți de alocarea tratamentului.

Am măsurat fibroza miocardică la 7 zile după IAM la șoarece pentru a aborda dacă utilizarea imediată a anakinra a fost asociată cu afectarea vindecării infarctului. Secțiunile inimii au fost colorate cu coloranți tricromi Masson (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo). Pe scurt, secțiunile au fost mordansate în soluție Bouin’s peste noapte și spălate în apă curentă de la robinet pentru a elimina galbenul. Secțiunile au fost colorate cu hematoxilină Mayer, fuchsină cu acid scarlatină Biebrich, soluție de lucru de acid fosfotungstic/fosfomolibdic și albastru de anilină timp de 5 minute fiecare și apoi au fost plasate în acid acetic 1% timp de 2 minute. Secțiunile au fost clătite, deshidratate cu alcool, curățate în xilen și montate. Citoplasma și fibrele musculare apar în roșu; colagenul și nucleele apar în albastru. Zonele de fibroză și întregul ventricul stâng au fost determinate prin morfometrie computerizată cu ajutorul unui software de imagistică BIOQUANT, iar raportul a fost utilizat pentru a calcula suprafața cicatricilor exprimată ca procent din ventriculul stâng. Raportul dintre fibroză și miocardul viabil în zona periinfarctului (fibroză interstițială) a fost determinat prin morfometrie computerizată utilizând o mărire ×20 și exprimat ca procent din suprafața acestuia. Colorația Von Kossa (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Calif) a fost utilizată pentru a detecta depozitele de calciu miocardice (pre)necrotice.

Nivelurile de citokine

Sângele integral a fost prelevat în tuburi de citrat de sodiu la 9 șobolani (4 tratați cu anakinra și 5 tratați cu soluție salină normală) în momentul morții și centrifugat imediat la 1000g la 4°C timp de 10 minute. Supernatantul a fost colectat și filtrat printr-un filtru de 0,22-μm. Probele au fost apoi depozitate la -20°C și analizate ulterior. S-a utilizat un sistem de matrice de bile de citokine multiplex (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, California) în conformitate cu instrucțiunile producătorului pentru a determina nivelurile circulante de IL-1β, factor de necroză tumorală-α, IL-6 și interferon-γ. Amestecul de reacție a fost citit cu cititorul de matrice proteică Bio-Plex, iar datele au fost analizate cu programul software Bio-Plex Manager.

MMP Synthesis

MMP-9, sau gelatinaza B, a fost aleasă ca prototip de metaloproteinază crescută după IAM și asociată cu remodelarea adversă.14,15 Proteinele solubile totale au fost extrase din miocardul infarctului și peri-infarctului la 7 zile după ligatura coronariană la 6 șoareci (3 tratați cu anakinra și 3 cu soluție salină) cu un tampon de 20 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA și 1 mmol/L EGTA. Omogenatul a fost centrifugat la 14 000g timp de 10 minute la 4°C, iar supernatantul a fost recuperat. Apoi, 50 μg de proteine din fiecare probă au fost separate prin geluri de acrilamidă 7,5%, transferate pe o membrană de nitroceluloză și apoi blocate cu 5% lapte degresat uscat în soluție salină tamponată cu Tris Tween-20 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L NaCl și 0,1% Tween 20) timp de 1 oră. Membrana a fost apoi incubată cu un anticorp primar policlonal de capră la o diluție de 1:1000 pentru MMP-9 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) timp de 16 ore la 4°C înainte de a fi spălată și incubată cu un anticorp secundar anti-rabie conjugat cu peroxidază de hrean (1:2000; Amersham Biosciences, Inc, Piscataway, NJ) timp de 1 oră. Blocurile au fost dezvoltate cu un sistem chemiluminescent. S-au evidențiat două benzi, care corespund pro-MMP-9 și MMP-9 activă. Pentru măsurare a fost selectată doar banda activă (105 kDa) a MMP-9. Densitatea optică pentru fiecare bandă a fost scanată și cuantificată prin densitometrie și exprimată ca raport dintre MMP-9 activă și β-actina.

Efectele antiapoptotice ale Anakinra In Vitro

Cardiocitele ventriculare au fost izolate de la șobolan cu o tehnică enzimatică modificată conform descrierii anterioare.16 Pe scurt, șobolanul a fost anesteziat cu pentobarbital sodic (100 mg/kg IP), iar inima a fost scoasă rapid din piept. În 3 minute, deschiderea aortică a fost canulată pe un sistem de perfuzie Langendorff, iar inima a fost perfuzată retrograd. Digestia enzimatică a început prin adăugarea colagenazei de tip II (0,5 mg/mL fiecare; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) și a proteazei de tip XIV (0,02 mg/mL) în tamponul de perfuzie și s-a continuat timp de ≈15 minute. Apoi, 50 μmol/L Ca2+ a fost adăugat 50 μmol/L la soluția enzimatică pentru a perfuza inima timp de încă 10 până la 15 minute. Țesutul ventricular digerat a fost tăiat în bucăți și aspirat ușor cu o pipetă de transfer pentru a facilita disocierea celulelor. Peletul celular a fost resuspendat pentru o procedură de restabilire a Ca2+ în 3 etape (adică 125, 250 și 500 μmol/L Ca2+). Cardiomiocitele proaspăt izolate au fost apoi suspendate în mediu esențial minim (număr de catalog M1018, pH 7,35 până la 7,45, Sigma). Celulele au fost apoi plasate pe plăci de cultură celulară de 35 mm care au fost preacoperite cu 20 μg/mL de laminină de șoarece în soluție salină tamponată cu fosfat cu 1% penicilină-streptomicină timp de 1 oră. Cardiomiocitele au fost cultivate în prezența a 5% CO2 timp de 1 oră într-un incubator umidificat la 37°C, ceea ce a permis cardiomiocitelor să se atașeze la suprafața vasului înainte de protocolul experimental. Cardiomiocitele au fost apoi supuse la ischemie simulată timp de 40 de minute prin înlocuirea mediului celular cu un „tampon de ischemie” care conținea 118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3, 1,0 mmol/L NaH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L lactat de sodiu, 16 mmol/L KCl și 10 mmol/L 2-deoxiglucoză (pH ajustat la 6,2). În plus, celulele au fost incubate în condiții hipoxice la 37°C în timpul întregii perioade de ischemie simulată prin ajustarea incubatorului tri-gaz la 1% până la 2% O2 și 5% CO2. După 40 de minute, reperfuzia a fost simulată prin înlocuirea tamponului ischemic cu mediu normal în condiții normoxice. În același timp, anakinra a fost adăugată pe placă la concentrații crescânde (×100) începând cu o concentrație de 25×10-16g/mL până la o concentrație de 25×10-6g/mL (n=3 per grup). Un volum echivalent de mediu normal a fost adăugat la 3 plăci pentru a servi drept controale. Plăcile au fost incubate timp de 18 ore. Apoptoza cardiomiocitelor a fost analizată prin colorarea TUNEL cu un kit achiziționat de la BD Biosciences (San Jose, California) care detectează fragmentarea ADN-ului nuclear prin intermediul unui test de fluorescență. Pe scurt, după 40 de minute de ischemie simulată și 18 ore de reperfuzie, celulele din lamelele cu 2 camere au fost fixate cu formaldehidă 4%/salină tamponată cu fosfat la 4°C timp de 25 de minute și supuse testului TUNEL în conformitate cu protocolul producătorului. Lamele au fost apoi contracolorate cu mediul de montaj Vectashield cu 4,6-diamidino-2-fenilindol (un colorant de intercalare a ADN-ului pentru vizualizarea nucleelor în celulele fixate; număr de catalog H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, California). Celulele colorate au fost examinate la un microscop cu fluorescență Olympus IX70 (Olympus Inc, Center Valley, Pa).

Anakinra Uptake In Vitro

Celele LH-1, o linie celulară de mușchi cardiac de șoarece care păstrează caracteristicile fenotipice ale cardiomiocitelor adulte, au fost cultivate până la confluență în mediu Claycomb (Sigma Chemical Co) suplimentat cu 10% FCS (JHR Bioscience, Ltd, Andover, Hampshire, Marea Britanie) și norepinefrină 0.1 mmol/L (Sigma Chemical Co.) pe coverlii de sticlă de 22 mm acoperite cu gelatină/fibronectină, plasate pe fundul unor vase Petri de 35 mm.17 Anakinra conjugată cu FITC (10 μg/mL) a fost apoi adăugată la celule, iar celulele au fost incubate la 37°C fie în condiții normoxice, fie în condiții hipoxice (2% oxigen) într-un incubator Micro galaxy, RS Biotech, timp de 5 ore. Celulele au fost apoi spălate de două ori cu soluție salină Hanks conținând 10% FCS. Nuclee au fost contracolorate cu Hoechst, iar observațiile au fost efectuate cu un microscop cu fluorescență Leica DM 2000 (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex).

Sesizări ale activității caspazei-1 și -9

Inhibarea de către anakinra a activităților caspazei-1 și -9 a fost testată cu ajutorul kiturilor de testare comerciale (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) folosind caspaza-1 umană recombinantă și YVAD-AMC, o variație a secvenței YVHD care se găsește la locul de clivaj al pro-Il-1β, ca substrat fluorogenic pentru caspaza-1 și Ac-LEHD-AMC pentru caspaza-9. Experimentul a fost realizat la 22°C cu un cititor de plăci fluorometrice (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) în modul cinetic cu lungimi de undă de excitație și emisie de 390 și, respectiv, 460 nm. Pentru substrat s-a utilizat o concentrație inițială de 11,5 μmol/L (echivalentă cu Km al caspazei-1), care a fost apoi crescută la 37,5 μmol/L pentru a testa inhibiția competitivă și necompetitivă.18 Pentru anakinra, a fost aleasă o doză inițială de 100 nmol/L în prezența sau absența a 10 μg/mL de anticorp de blocare policlonal anti-IL-1Ra (R&D Systems, Minneapolis, Minn) și apoi a fost crescută la 300 și 900 nmol/L pentru a evalua o curbă doză-răspuns. Se efectuează corecții de la blanc, iar curbele sunt ajustate la o interceptare 0,0, deoarece se presupune că activitatea este 0 la momentul 0. Pantele de regresie (r>0,95) sunt obținute pentru fiecare experiment la fiecare doză, iar coeficienții sunt comparați între cele 3 grupuri (anakinra, control, anakinra plus anticorp de blocare). Experimentele au fost efectuate în triplicat pentru fiecare grup, iar curbele au fost rulate de cel puțin 5 ori pentru fiecare probă. Valoarea probabilității reflectă ANOVA cu 1 cale între grupuri cu testul post-hoc Dunnett cu 2 fețe, comparând fiecare grup cu anakinra.

Interacțiunea fizică și legarea dintre anakinra și caspaza-1 și -9 au fost testate prin intermediul coimunoprecipitării. Anakinra (1 μg) a fost incubată cu caspaza-1 și -9 umană recombinantă disponibilă în comerț (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) timp de 1 oră la 4°C. Amestecul a fost apoi precipitat prin adăugarea la 2 seturi diferite de perle de Sefarose cuplate cu anticorpi anti-IL-1Ra (Santa Cruz) sau anti-caspază-1 (Santa Cruz). Fracțiunile legate de Sefarose au fost fierte în tampon SDS și separate în SDS-PAGE. Proteinele coprecipitate în fiecare cadru au fost apoi imunoblocate și analizate prin Western blot. Anticorpii anti-IL-1Ra și anti-caspază-1 sau -9 au fost utilizați pentru a detecta imunoreactivitatea anakinrei și, respectiv, a caspazei-1, în coprecipitat. În cazul în care nu a avut loc niciun coprecipitat, atunci se aștepta o singură bandă în timpul Western blot care să corespundă anticorpului solubil de același tip cu anticorpul legat de bilele de sepharoză (adică o imunomarcație pentru IL-1Ra în testul de precipitare a bilelor de sepharoză legate de IL-1Ra). Dacă ar fi avut loc coprecipitarea, atunci ne-am aștepta la prezența unei benzi duble pentru ambii anticorpi solubili în ambele teste de precipitare (4 benzi în total). Anakinra și caspaza-1 sau -9 au fost rulate în Western blot în linii suplimentare și utilizate ca și controale pozitive.

Analiză statistică

Analiza statistică a fost efectuată cu pachetul SPSS 11.0 pentru Windows (SPSS Inc, Chicago, Ill). Variabilele continue sunt exprimate ca medie și SE. ANOVA cu o singură cale a fost utilizată pentru a compara mediile între mai multe (>2) grupuri, cu testul post-hoc Dunnett cu 2 fețe pentru a compara în mod specific efectele între subiecți cu controalele din fiecare grup. Testul t pentru date nepereche a fost utilizat pentru a compara mediile doar între 2 grupuri. ANOVA cu efecte aleatorii pentru măsuri repetate a fost utilizată pentru a compara parametrii ecocardiografici preintervenție și postintervenție între cele 4 grupuri diferite, cu testul post hoc Dunnett cu două fețe pentru a compara în mod specific efectele între subiecți (grupurile de IAM cu anakinra și cu soluție salină). Corelațiile dintre 2 variabile continue au fost evaluate cu testul lui Pearson. Au fost construite curbe de supraviețuire Kaplan-Meier, iar testul log-rank a fost utilizat pentru a evalua diferențele semnificative între grupuri. Ratele de supraviețuire au fost, de asemenea, comparate prin utilizarea testului Fisher’s Exact. Valorile de probabilitate neajustate cu 2 cozi sunt raportate pe tot parcursul, cu semnificația statistică stabilită la nivelul 0,05.

Autorii au avut acces deplin și își asumă întreaga responsabilitate pentru integritatea datelor. Toți autorii au citit și sunt de acord cu manuscrisul așa cum a fost redactat.

Rezultate

Studiul a inclus evaluarea efectelor anakinrei in vivo (în modelul de ligaturare a arterei coronare la șoarece și șobolan) și in vitro (în cultura primară de cardiomiocite de șobolan, în cultura de cardiomiocite HL-1 și în caspase-1 izolată).

Administrarea in vivo a anakinrei

Supraviețuire

Vreo 28 de șoareci au fost eutanasiați la 24 de ore pentru a evalua dimensiunea infarctului. Șase șoareci au fost eutanasiați la 7 zile pentru analiza expresiei MMP-9; acești șoareci nu au fost incluși în analiza supraviețuirii. La 7 zile după ligatura arterei coronare, 15 din cei 16 șoareci (94%) tratați cu anakinra erau în viață față de 11 din cei 20 de șoareci (55%) tratați cu soluție salină (P = 0,013, testul log-rank Kaplan-Meier; P = 0,021, testul exact Fisher). În mod similar, 4 din cei 4 șobolani (100%) tratați cu anakinra au fost în viață, în timp ce doar 5 din cei 8 șobolani (62%) tratați cu soluție salină au fost în viață. Toți șoarecii (n=8) și șobolanii (n=8) operați sham erau în viață la 7 zile.

Dimensiunea infarctului

Nu s-au constatat diferențe semnificative în ceea ce privește suprafața de risc și suprafața infarctului (exprimată ca suprafață de infarct per suprafață de risc) între șoarecii tratați cu soluție salină și șoarecii tratați cu doze de anakinra de 1 și 10 mg/kg; totuși, anakinra 100 mg/kg a fost asociată cu o reducere modestă, dar semnificativă (13%) a dimensiunii infarctului (P=0,015 față de soluție salină; Figura 1).

Apoptoza

Utilizarea anakinrei a fost asociată cu o reducere semnificativă a apoptozei cardiomiocitelor în miocardul peri-infarct atât în grupul de tratament imediat, cât și în cel de tratament întârziat (3,1±0,2% față de 0,5±0,3%, P<0,001; și 4,2±0,4% față de 1,1±0,2%, P<0,001, respectiv; Figura 2). Rata apoptotică în miocardul peri-infarct a fost direct corelată cu semnele de remodelare adversă, cum ar fi LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), grosimea diastolică a peretelui anterior (r=-0,50, P=0,012) și grosimea sistolică a peretelui anterior (r=-0,50, P=0,012). Rata de apoptoză în miocardul îndepărtat a fost fie nedetectabilă, fie foarte scăzută, fără diferențe semnificative între animalele cu IAM (0,03±0,03%) și animalele operate în șamd (0,01±0,01%) și între animalele tratate cu anakinra (0,02±0,02%) și cele tratate cu soluție salină (0,03±0,03%) (P>0,05 pentru toate analizele).

Fibroză miocardică și depozite de calciu

Nu s-au constatat diferențe în ceea ce privește fibroza miocardică (formarea cicatricilor, exprimată ca procent din ventriculul stâng) între șoarecii tratați cu anakinra și cei tratați cu soluție salină (31±2% față de 33±2%; P=0,81; Figura 1). Fibroza interstițială în zona peri-infarctului a fost minimă la șoarecii operați sham (<0,1%), dar mai răspândită la șoarecii tratați cu anakinra și la cei tratați cu soluție salină, fără diferențe semnificative între grupuri (13±2% versus 15±3%; P=0,58; Figura 1). Am găsit cantități minime de depozite de calciu miocardic folosind colorarea von Kossa la 1 săptămână după IAM (<0,1%) fără diferențe între șoarecii tratați cu anakinra și cei tratați cu soluție salină.

Remodelarea și funcția LV

Valorile LVEDD și LVESD înainte de intervenție au fost similare în toate grupurile de șoareci și șobolani. În ziua 7 au fost observate creșteri semnificative ale LVEDD și LVESD și scăderi ale grosimii diastolice a peretelui anterior, grosimea sistolică a peretelui anterior și FS la șoarecii tratați cu soluție salină (față de linia de bază și sham ) (Figura 3). În comparație cu șoarecii tratați cu soluție salină, șoarecii AMI tratați cu anakinra au avut creșteri semnificativ mai mici ale LVEDD și LVESD și o scădere a FS în ziua 7 față de linia de bază. Scăderea grosimii sistolice a peretelui anterior a avut, de asemenea, tendința de a fi mai mică la șoarecii tratați cu anakinra (față de animalele tratate cu soluție salină), demonstrând un efect protector în regiunea peri-infarct, în timp ce nu am găsit diferențe semnificative în grosimea diastolică a peretelui posterior (0,96±0,08 față de 0,78±0,11, respectiv; P=0,86) și grosimea sistolică a peretelui posterior (1,32±0,08 față de 1,14±0,12, respectiv; P=0,44). Șoarecii tratați cu Anakinra au avut, de asemenea, valori mai scurte ale timpului de contracție izovolumetrică (6±4 față de 16±5 ms; P=0,022) și ale timpului de relaxare izovolumetrică (12±5 față de 29±8 ms; P=0,042) și, în consecință, un indice Tei mai mic (reflectând performanța miocardică) (0,28±0,03 față de 0,66±0,07; P=0,044; Figura 3). Indicele FS/Tei, care se corelează și mai îndeaproape cu măsurătorile invazive ale dP/dt,19 a fost, de asemenea, semnificativ mai mare la șoarecii cu AMI tratați cu anakinra (0,74±0,06 față de 0,17±0,02 tratați cu soluție salină; P=0,008). Nu au fost constatate diferențe între șoarecii tratați cu soluție salină și șoarecii tratați cu anakinra și șoarecii sham-operați (Figura 3).

Un efect similar asupra LVEDD și LVESD a fost observat în modelul de șobolan (Figura 4). Creșterea procentuală medie a LVEDD și LVESD a fost semnificativ mai mare la șoareci decât la șobolani, independent de brațul de tratament (P<0,001). Reducerea absolută a modificărilor LVEDD și LVESD cu anakinra a fost semnificativ mai mare la șoareci decât la șobolani (P<0,001); cu toate acestea, reducerile procentuale ale modificărilor LVEDD și LVESD au fost similare la șoareci (56±6% și, respectiv, 53±5%) și la șobolani (68±7% și 47±4%; P=0,66 și, respectiv, P=0,32), arătând astfel efecte similare ale administrării imediate și întârziate de anakinra.

Infiltrarea leucocitelor

Nu s-au constatat diferențe în ceea ce privește numărul de leucocite la 1 mm2 de miocard în zona infarctului la animalele AMI tratate cu anakinra și la cele tratate cu soluție salină (Figura 4). Rata de apoptoză în țesutul de granulație la 1 săptămână după IAM a fost similară la șoarecii tratați cu anakinra și la cei tratați cu soluție salină (figura 4). Leucocitele au fost practic absente în regiunile miocardice îndepărtate și la animalele operate sham.

Nivelurile de citokine

Nu s-au constatat diferențe semnificative în ceea ce privește nivelurile plasmatice ale IL-1β, IL-6, factorului de necroză tumorală-α și interferon-γ (Figura 4).

Activitatea MMP

MMP-9 activă a fost practic nedetectabilă la animalele operate sham-operate, în timp ce a fost detectată în mod constant la șoarecii cu IMA la 7 zile după operație. Nu s-a constatat nicio diferență în ceea ce privește nivelurile de MMP-9 activă între șoarecii cu IMA tratați cu soluție salină și cei tratați cu anakinra (figura 4).

Administrarea in vitro a anakinrei

Apoptosis

Incubarea cardiomiocitelor cu anakinra (2.5×10-12 g/mL) în momentul „reperfuziei simulate” (după 40 de minute de „ischemie simulată”) a fost asociată cu o reducere semnificativă cu 36% a apoptozei (11,2±0,5% față de 17,5±0,1% la control). Creșterea (×100) concentrațiilor de anakinra până la 25×10-6 g/mL nu a arătat nicio reducere suplimentară a apoptozei, în timp ce concentrațiile sub 25×10-12 g/mL nu au avut niciun efect asupra apoptozei (figura 5).

Creșterea absorbției celulare de anakinra în timpul hipoxiei

În comparație cu normoxia, absorbția de anakinra în timpul hipoxiei a fost semnificativ crescută, fiind evidentă în ≈95% din celule în timpul hipoxiei (față de 35% în timpul normoxiei; P=0,048; Figura 6).

Inhibarea activităților caspazei-1 și -9

In vitro, anakinra (100 până la 900 nmol/L) a inhibat semnificativ activitățile caspazei-1 și -9 cu ≈50% (P<0,001 pentru toate valorile concentrației față de control), fără diferențe între diferitele concentrații. Anakinra s-a comportat ca un inhibitor enzimatic mixt competitiv și necompetitiv pentru caspaza-1 (Ki, 0,201 μmol/L; Kic, 0,239 μmol/L; Kuc, 0,231 μmol/L) și pentru caspaza-9 (Ki, 0,31 μmol/L; Kic, 0,34 μmol/L; și Kuc, 0,28 μmol/L). Adăugarea de anticorpi de blocare a IL-1Ra a inversat inhibarea caspazei-1 și -9 de către anakinra (figura 7). Testul de coprecipitare a confirmat o interacțiune fizică și o legătură între anakinra și caspaza-1 și -9 (figura 7).

Discuție

Acest studiu arată pentru prima dată că anakinra IL-1Ra umană recombinantă exogenă administrată în primele 24 de ore de la IAM ameliorează semnificativ remodelarea cardiacă prin reducerea apoptozei cardiomiocitelor în 2 modele animale diferite de ocluzie permanentă a arterelor legate de infarct și că anakinra are un efect antiapoptotic direct asupra cardiomiocitelor in vitro.

Biologia IL-1Ra

IL-1Ra este considerată un reactant al fazei acute.3,4 În prezent, rolul IL-1Ra endogenă în inflamație este neclar. IL-1Ra se leagă de receptorul IL-1 și, prin urmare, este un inhibitor competitiv al activității IL-1, comportându-se potențial ca un agent antiinflamator.3 Cu toate acestea, deoarece IL-1 se leagă de receptorul său cu o afinitate mai mare și există un exces de receptori (efect de receptor de rezervă), rolul agonistului endogen pare să fie limitat.3 Gena IL-1Ra este bine conservată în biologie și nu au fost raportate diferențe interspecii. În acest studiu, am testat cele mai comune 2 specii de rozătoare și am raportat efecte similare.

IL-1Ra în IMA

Nivelurile de IL-1Ra cresc semnificativ după ischemia-reperfuzie miocardică.7 Nivelurile sale sunt crescute precoce la pacienții care prezintă IMA cu supradenivelare a segmentului ST,5 și cu cât este mai mare zona de miocard expusă riscului, cu atât este mai mare creșterea nivelurilor de IL-1Ra.6 Mai mult, în studiile observaționale, nivelurile mai ridicate de IL-1Ra la pacienții cu sindroame coronariene acute au fost asociate cu un rezultat nefavorabil.20,21 A rămas neclar dacă IL-1Ra a reprezentat un marker al leziunilor, o încercare de cardioprotecție prin intermediul activității antiinflamatorii sau un mediator al leziunilor. Supraexprimarea IL-1Ra într-un model de ischemie-reperfuzie globală la șobolani a arătat pentru prima dată un efect cardioprotector al IL-1Ra, care a dus la o reducere de aproximativ 50% a apoptozei cardiomiocitelor.8

IL-1Ra exogenă

O IL-1Ra umană recombinantă (anakinra) este disponibilă în comerț (produsă de Amgen), aprobată de Food and Drug Administration și utilizată la un număr mare de pacienți pentru tratamentul poliartritei reumatoide.22-24 Rolul IL-1 în patogeneza poliartritei reumatoide este central. Administrarea sistemică de anakinra s-a dovedit a fi sigură și eficientă la pacienții cu poliartrită reumatoidă, conducând la modificarea activității bolii. Un studiu clinic cu anakinra la pacienții cu sindroame coronariene acute este în curs de desfășurare, dar rezultatele nu sunt încă disponibile.25 Într-un studiu de fază II publicat recent, 17 pacienți cu accident vascular cerebral ischemic au fost tratați cu anakinra administrat sub formă de bolus de 100 mg urmat de o perfuzie de 72 de ore; ceilalți 17 pacienți au primit un placebo corespunzător.26 S-a constatat că anakinra nu a avut efecte adverse legate de medicament și, într-o analiză secundară, s-a constatat că a fost asociat cu un număr mai mare de pacienți cu dizabilități minime sau inexistente legate de accidentul vascular cerebral. În modelele animale experimentale de AVC, anakinra a fost asociată cu reducerea apoptozei, reducerea inflamației și îmbunătățirea rezultatelor comportamentale.27,28

Mecanism de acțiune

Mecanismul exact prin care anakinra își exercită efectele benefice nu este complet clar. Opinia acceptată este că anakinra administrată în doze mari concurează cu IL-1 și reduce activitatea IL-1. Anakinra se leagă de receptorul IL-1 de tip I, dar previne transducția semnalului intracelular prin împiedicarea interacțiunii dintre receptorul IL-1 și proteina accesorie IL-1. S-a demonstrat că IL-1Ra reduce secreția de prostaglandină-E2 dependentă de IL-1, care poate fi direct responsabilă de toxicitatea și apoptoza celulară.3,29 Nu este clar dacă anakinra interferează cu IL-1 derivată în principal din celulele inflamatorii sau cu IL-1 eliberată local într-un mod paracrin sau autocrin și dacă are un efect direct asupra celulei, independent de interacțiunea sa cu receptorul IL-1. Acțiunea intracelulară a IL-1Ra este independentă de calea de semnalizare intracelulară a IL-1,30 și a fost descris transportul activ transmembranar al IL-1Ra prin intermediul receptorului canalului purinergic P2X7.31 Efectele observate in vitro, unde sunt cultivate numai cardiomiocite, sugerează că efectele anakinrei asupra miocardului sunt, cel puțin parțial, independente de prezența unui infiltrat inflamator. În consecință, nu am constatat niciun efect al anakinrei asupra nivelurilor de citokine circulante, a infiltratului de leucocite miocardice sau a activității MMP-9 în acest model experimental. Efectele antiapoptotice ale IL-1Ra au fost deja raportate la neuroni și celule epiteliale.32,33 Aceste efecte sunt evidente in vivo și in vitro, sugerând un efect paracrin sau autocrin al IL-1Ra.32,33 Aici, raportăm absorbția celulară de către anakinra în timpul ischemiei, legarea între anakinra și caspaza-1 și -9 și inhibarea semnificativă a activităților caspazei-1 și -9 de către anakinra. Datele obținute in vitro, deși doar generatoare de ipoteze cu privire la evenimentele in vivo din cauza limitărilor inerente ale modelelor, sugerează o creștere a pragului la apoptoza indusă de hipoxie cu anakinra.

Demonstrăm că administrarea precoce (imediată) sau întârziată (24 de ore mai târziu) de anakinra reduce apoptoza și previne dilatarea cardiacă după IMA. La doza care s-a demonstrat că inhibă apoptoza și previne dilatarea (1 mg/kg), anakinra nu a avut niciun efect asupra dimensiunii infarctului atunci când a fost administrată precoce, iar beneficii similare în remodelare sunt observate cu anakinra administrată la 24 de ore după AMI, în concordanță cu un efect asupra remodelării cardiace care este independent de economisirea infarctului. În mod notabil, efectele benefice ale IL-1Ra în modelele animale de accident vascular cerebral sunt, de asemenea, cel puțin în parte, independente de timp.34 Cu toate acestea, după cum s-a observat deja în literatura de specialitate privind accidentul vascular cerebral, s-a observat un efect de economisire a infarctului cu o doză de 100 de ori mai mare de anakinra. Nu se știe dacă reducerea mică, dar semnificativă a dimensiunii infarctului cu doze mai mari s-ar traduce printr-un beneficiu relevant din punct de vedere clinic în ceea ce privește insuficiența cardiacă sau supraviețuirea și necesită teste suplimentare.

Durata optimă a tratamentului cu IL-1Ra după IMA este necunoscută. Într-un model de răspuns al peretelui vasului la leziuni, IL-1Ra administrată timp de 28 de zile a fost asociată cu un efect mai mare în comparație cu IL-1Ra administrată timp de 14 zile.35 De remarcat că nu s-au constatat efecte de revenire după întreruperea tratamentului cu IL-1Ra.35

Rolul caspazelor în ischemie și insuficiență cardiacă

Caspazele sunt proteaze implicate în cascada apoptotică și inflamatorie.36-40 Caspaza-3 este un mediator central al cascadei apoptotice, conducând la activarea în aval a efectorilor secundari responsabili de fragmentarea ADN-ului și de clivarea proteinelor structurale ale citoscheletului. Caspaza-1, cunoscută și sub numele de enzima de conversie a interleukinei-1, este considerată o caspază proinflamatorie deoarece, printre acțiunile sale, convertește pro-IL-1β în IL-1β. Cu toate acestea, caspaza-1 este, de asemenea, una dintre enzimele care clivează pro-caspaza-3, ceea ce duce la activarea acesteia.36-40 Într-adevăr, caspaza-3 este, în general, activată în urma clivajului de către alte caspaze, cum ar fi caspaza-9, care joacă un rol central în calea mitocondrială; caspaza-8, care este implicată mai ales în apoptoza mediată de receptori; și caspaza-1. Studiile experimentale au arătat că inhibarea activității caspazei-1 este asociată cu o apoptoză redusă și o remodelare mai favorabilă după IMA, independent de nivelurile de IL-1.38,39 Având în vedere că IL-1 este substratul pentru caspaza-1, am testat dacă IL-1Ra și-ar putea exercita efectele benefice prin inhibarea intracelulară directă a caspazei-1.40 În consecință, descriem, pentru prima dată, că anakinra se leagă de caspaza-1 in vitro și îi inhibă semnificativ activitatea. Inhibarea directă a caspazei-1 de către anakinra poate fi responsabilă, cel puțin în parte, de efectele sale antiinflamatorii și antiapoptotice. Cu toate acestea, anakinra poate avea efecte antiapoptotice care rezultă dintr-un efect indirect asupra activității caspazei-1 prin împiedicarea translocării caspazei-1 în nucleu și, prin urmare, prin inhibarea apoptozei41 sau prin inhibarea caspazei-9. Caspaza-9 este mediatorul-cheie al căii mitocondriale, conducând la activarea apoptozei în timpul hipoxiei/ischemiei.37 Rămâne de elucidat dacă inhibarea caspazei-1 sau -9 joacă un rol mai important în beneficiul observat cu anakinra. La doza testată în acest studiu, anakinra a avut probabil efecte inhibitoare similare asupra ambelor caspaze, și a fost raportată o interacțiune încrucișată între diferite caspaze din cascada apoptotică.36-41

Farmacocinetica anakinrei și răspunsul doză-efect

Într-un studiu de fază I la 25 de voluntari sănătoși, o doză unică de anakinra la o doză similară cu cea utilizată în acest studiu (1 mg/kg) administrată intravenos a fost asociată cu un nivel plasmatic de 3,1 μg/mL și un timp de înjumătățire de 2,64 ore.42 In vivo, nu am constatat efecte semnificative asupra dimensiunii infarctului utilizând anakinra la o doză de până la 10 ori mai mare decât doza recomandată, dar am constatat o reducere mică, dar semnificativă, a dimensiunii infarctului utilizând o doză de 100 de ori mai mare. Nu se știe dacă acest efect de economisire a infarctului asociat cu o doză atât de mare s-ar traduce printr-un rezultat favorabil pe termen lung și necesită studii suplimentare. In vivo, o concentrație >106 mai mică decât nivelul plasmatic maxim observat la om a fost asociată cu o reducere semnificativă a apoptozei. Dozele mai mici nu au fost eficiente, în timp ce dozele mai mari nu au prezentat efecte adiționale. Aceste date sunt în concordanță cu profilul clinic al anakinrei, în care se utilizează în general o doză standard de 1 mg/kg, iar dozele mai mari sunt asociate cu reacții adverse mai locale, fără beneficii clinice suplimentare semnificative.22-24 Într-un studiu recent,43 anakinra administrată în doză de 100 mg (echivalentul brut a 1 mg/kg) a fost utilizată pentru a inhiba apoptoza celulelor β pancreatice și s-a dovedit a fi bine tolerată și a fi asociată cu indici de îmbunătățire a funcției celulelor β comparativ cu placebo, fără a afecta sensibilitatea la insulină.

Ischemia, apoptoza și insuficiența cardiacă după IMA

Constatarea unei asocieri între apoptoză și remodelare susține conceptul de apoptoză ca mediator central al remodelării cardiace indiferent de mărimea infarctului.1,37,44 Lipsa diferențelor în ceea ce privește efectele sale asupra apoptozei sau remodelării între strategia de tratament imediată și cea întârziată și lipsa efectelor asupra dimensiunii infarctului cu doza de 1 mg/kg sugerează că anakinra afectează în mod specific remodelarea postinfarct subacută, în care se știe că apoptoza joacă un rol major,1,36,43 fără a afecta vindecarea infarctului, degradarea matricei și fibroza sau fără a promova ruptura peretelui.

Concluzii

Administrarea de anakinra în termen de 24 de ore de la IAM ameliorează remodelarea postinfarct, inhibând în același timp apoptoza. În ciuda limitărilor studiului de față (cum ar fi dimensiunea relativ mică a eșantionului, limitată la sexul masculin, determinarea într-un singur moment a rezultatelor de interes și utilizarea ecocardiografiei, care rămâne o metodă suboptimală și dependentă de operator pentru evaluarea remodelării și funcției LV), constatările unui efect benefic al IL-1Ra exogenă (anakinra) administrată în decurs de 24 de ore de la IMA pot deschide o nouă fereastră terapeutică pentru tratamentul leziunilor ischemice și al remodelării pentru prevenirea și tratamentul insuficienței cardiace ischemice.

Notele de subsol

.