Analize genomice integrative ale semnăturii APOBEC-mutaționale, expresia și deleția germinală a genelor APOBEC3 și imunogenitatea în mai multe tipuri de cancer

Modele distincte ale genelor APOBEC3, asociate cu semnătura APOBEC-mutațională în mai multe tipuri de cancer

În urma analizei anterioare a semnăturii APOBEC-mutaționale, am măsurat mutațiile folosind numărul de mutații ale deaminazei C care se aflau în cadrul motivului trinucleotidic TCW de schimbare a mutațiilor în T sau G pentru fiecare eșantion în 10 tipuri de cancer (a se vedea Metode). Am efectuat analize univariate pentru a evalua asocierile semnăturii APOBEC-mutaționale cu nivelurile generale de expresie a genelor APOBEC3A și APOBEC3B. Am observat că nivelul de expresie al APOBEC3A a fost asociat pozitiv cu semnătura APOBEC-mutațională într-un total de șase tipuri de cancer – vezică urinară, sân, col uterin, adenocarcinom pulmonar, cap și gât și tiroidă. Nu au fost observate asocieri semnificative în celelalte tipuri de cancer, deși au fost observate aceleași direcții de asociere (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). În mod interesant, am observat că nivelul de expresie APOBEC3B a fost asociat pozitiv cu semnătura APOBEC-mutațională în toate tipurile de cancer, cu excepția carcinomului scuamos pulmonar (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). În comparație cu asocierile de la APOBEC3A, APOBEC3B a fost asociat în mod specific cu semnătura APOBEC-mutațională în cancerele de stomac, pancreas și rinichi, cu un P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3 și, respectiv, P = 1,1 × 10- 4 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S1). Aceste constatări au fost în concordanță cu studiile anterioare . În plus, am evaluat, de asemenea, asocierile semnăturii APOBEC-mutaționale cu expresia genetică a altor gene APOBEC3: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G și APOBEC3H. Rezultatele noastre au arătat că expresiile acestor gene au fost asociate cu semnătura APOBEC-mutațională a variat în tipuri distincte de cancer (Fișier suplimentar 1: Tabelul S2). De exemplu, expresia APOBEC3C a fost asociată cu creșterea semnăturii APOBEC-mutaționale în cancerele de col uterin și de cap și gât, în timp ce expresia sa a fost asociată cu scăderea semnăturii APOBEC-mutaționale în cancerul de stomac. Rezultatul nostru a arătat, de asemenea, că expresia APOBEC3D, APOBEC3F și APOBEC3G a fost asociată cu o semnătură APOBEC-mutațională crescută, în timp ce rezultatul asocierii APOBEC3G a fost în concordanță cu constatările anterioare. Interesant, am observat că expresia APOBEC3H a fost asociată cu o semnătură APOBEC-mutațională crescută în cancerul de col uterin, dar nu a fost observată în cancerul de sân.

Programe distincte ale izoformelor APOBEC3A și APOBEC3B, asociate cu semnătura APOBEC-mutațională în mai multe tipuri de cancer

Am evaluat în continuare asocierile dintre semnătura APOBEC-mutațională și nivelurile de expresie ale fiecăreia dintre izoformele transcrise din APOBEC3A și APOBEC3B. Au fost analizate în total șase izoforme, inclusiv uc003awn și uc011aob transcrise din APOBEC3A, uc003awo, uc003awp și uc003awq transcrise din APOBEC3B și o altă izoformă, uc011aoc, derivată dintr-un eveniment de fuziune implicat într-o regiune care acoperă ultimul intronic al APOBEC3A până la ultimul exon al APOBEC3B (Fig. 1a, b). Am confirmat că izoformele uc003awn și uc003awo au fost transcrise în principal din APOBEC3A și, respectiv, APOBEC3B (Fișier suplimentar 1: Figura S1) . După cum era de așteptat, direcția de asociere atât a nivelurilor de expresie uc003awn și uc003awo, cât și a semnăturii APOBEC-mutaționale au fost în concordanță cu observațiile privind nivelurile globale de expresie a genelor în toate tipurile de cancer (Fig. 1c, d; Fișier suplimentar 1: Tabelul S3). În mod surprinzător, nivelul de expresie al uc011aoc (APOBEC3A/B) a fost asociat în mod pozitiv cu semnătura APOBEC-mutațională numai în cazul cancerului de sân (P = 5,0 × 10- 10) (Fig. 1e; Fișier suplimentar 1: Tabelul S3). Cu toate acestea, nu au fost observate asocieri pentru restul izoformelor în niciun tip de cancer, cu excepția unei asocieri slabe observate pentru uc011aob (APOBEC3A) cu cancerul capului și gâtului (P = 0,02; Fișier suplimentar 1: Tabelul S3).

Utilizând analize de regresie multiplă care au inclus toate izoformele atât ale APOBEC3A, cât și ale APOBEC3B, am constatat că nivelurile de expresie ale uc003awn (APOBEC3A) și uc003awo (APOBEC3B) au fost asociate în mod independent și frecvent cu semnătura APOBEC-mutațională evaluată în mai multe tipuri de cancer: vezică urinară (o asociere marginală pentru uc003awn), sân, col uterin, adenocarcinom pulmonar și cap și gât (tabelul 1). De asemenea, o asociere suplimentară pentru uc011awn (APOBEC3A) a fost observată în tiroidă, în timp ce asocieri pentru uc003awo (APOBEC3B) au fost observate în cancerele de stomac, pancreas și rinichi. În concordanță cu analiza univariată, o asociere izbitoare pentru uc011aoc (APOBEC3A/B) cu semnătura APOBEC-mutațională a fost observată în cancerul de sân (P = 5,3 × 10- 11), iar o asociere suplimentară a fost observată, de asemenea, în adenocarcinomul pulmonar (P = 0,01) (Tabelul 1). Aceste constatări sugerează că uc011aoc joacă un rol specific țesutului în afectarea semnăturii mutaționale APOBEC în primul rând în cancerul de sân, în timp ce uc003awn și uc003awo joacă un rol omniprezent, dar distinct în întregul spectru de cancer uman. În mod notabil, analiza noastră suplimentară a arătat corelația de expresie pozitivă între izoforma uc011aoc și APOBEC3A într-o mare parte a tipurilor de cancer, în special în cazul cancerului de sân (Fișier suplimentar 1: Tabelul S4).

În plus, am efectuat o analiză de asociere stratificată pe subtipuri clinice în cancerul de sân. Am observat că asocierile izoformelor uc003awn (APOBEC3A) și uc011aoc (APOBEC3A/B) cu semnătura APOBEC-mutațională au variat în diferite subtipuri clinice, cea mai semnificativă asociere fiind observată în subtipul LumA (Fișier suplimentar 1: Tabelul S5).

Deleția APOBEC3A/B germinală care afectează nivelurile de expresie ale izoformelor genelor APOBEC3A și APOBEC3B

Pentru a investiga modul în care deleția APOBEC3A/B germinală afectează expresia izoformelor genelor APOBEC3A și APOBEC3B, am identificat mai întâi 30 de eșantioane prezise ca fiind purtătoare de deleție homozigotă, 239 de eșantioane prezise ca fiind purtătoare de deleție heterozigotă și 2287 de eșantioane prezise ca neavând deleție (Fișier suplimentar 1: Tabelul S6, a se vedea Metode). În continuare, am evaluat asocierile dintre deleția APOBEC3A/B din linia germinală și nivelurile de expresie ale fiecărei izoforme utilizând analiza univariată (a se vedea Metode). Așa cum era de așteptat, am observat că deleția APOBEC3A/B din linia germinală a fost asociată în mod semnificativ cu scăderea nivelurilor de expresie a izoformei uc003awo (APOBEC3B) în toate tipurile de cancer la P < 0,05, cu excepția cancerului de pancreas cu un P = 0,14. Asocieri semnificative cu scăderea nivelurilor de expresie a uc003awn (APOBEC3A) au fost, de asemenea, observate în trei tipuri de cancer – vezică urinară, sân și tiroidă (Fig. 2; Tabelul 2). În schimb, rezultatele noastre au arătat că deleția APOBEC3A/B germinală a fost asociată în mod semnificativ cu un nivel crescut de expresie a uc011aoc (APOBEC3A/B) în toate tipurile de cancer, cu excepția cancerelor de stomac, pancreas și rinichi. Pentru acestea, nu a existat o semnificație statistică, dar au avut aceleași direcții de asociere (Fig. 2; Tabelul 2). În special, cancerul capului și gâtului a prezentat cea mai semnificativă asociere cu P = 3,8 × 10- 65, iar cancerele de sân și de vezică urinară au prezentat asocierea semnificativă cu P = 3,0 × 10- 8 și, respectiv, P = 2,9 × 10- 7. În plus, am efectuat aceeași analiză, stratificată în funcție de populație, și o tendință similară a fost observată în aceste tipuri de cancer (datele nu sunt prezentate). Constatările noastre sugerează că, în aproape toate tipurile de cancer investigate, deleția APOBEC3A/B din linia germinală a fost asociată în mod semnificativ cu scăderea nivelului de expresie a uc003awn și uc003awo, dar a existat un nivel crescut de expresie a uc011aoc.

Deleția APOBEC3A/B din linia germinală influențează APOBEC-semnătura mutațională, încărcăturile de neoantigeni și compoziția relativă a celulelor imune, în special în cancerul de sân

Un studiu anterior a arătat că deleția APOBEC3A/B din linia germinală este asociată cu o semnătură APOBEC-mutațională crescută în cancerul de sân, în timp ce un model similar, dar fără semnificație statistică, a fost observat în multe alte tipuri de cancer, cum ar fi cel de vezică urinară . Utilizând analiza univariată pentru a evalua efectele globale ale deleției APOBEC3A/B din linia germinală asupra semnăturii APOBEC-mutaționale, am constatat că deleția a fost asociată în mod semnificativ cu o semnătură APOBEC-mutațională crescută numai în cancerul de sân (P = 5,6 × 10- 3; Tabelul 3; Fig. 3a). Cu toate acestea, o tendință opusă a fost observată în majoritatea celorlalte tipuri de cancer, deși majoritatea asocierilor nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (Tabelul 3). În mod specific, în cazul cancerului de vezică urinară, am observat că deleția APOBEC3A/B din linia germinală a fost asociată în mod semnificativ cu scăderea semnăturii APOBEC-mutaționale (P = 1,7 × 10- 3; Tabelul 3). Pentru a elucida în continuare dacă influența deleției APOBEC3A/B din linia germinală asupra semnăturii APOBEC-mutaționale se datorează efectului său asupra expresiei genice, am evaluat în continuare asocierile dintre semnătura APOBEC-mutațională și deleție cu o ajustare pentru expresia izoformelor (a se vedea Metode). În mod similar, rezultatele noastre au arătat că deleția APOBEC3A/B din linia germinală a fost asociată în mod semnificativ cu creșterea semnăturii APOBEC-mutaționale numai în cazul cancerului de sân (P = 2,8 × 10- 6; Tabelul 3; Fig. 3b). S-a observat o dimensiune a efectului mai mare (Beta = – 0,620) a deleției cu o expresie ajustată a izoformei, în comparație cu observația inițială a efectului global (Beta = – 0,281; Tabelul 3). Pentru a evalua dacă deleția din linia germinală poate contribui la proporția semnăturii APOBEC-mutaționale, am analizat, de asemenea, o proporție a semnăturii APOBEC-mutaționale în raport cu totalul mutațiilor pentru fiecare eșantion (a se vedea Metode). În concordanță cu observația inițială a semnăturii APOBEC-mutaționale, am observat că deleția din linia germinală a fost asociată în mod semnificativ cu o proporție crescută a semnăturii APOBEC-mutaționale numai în cazul cancerului de sân (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 și Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 pentru efectul global și efectele cu expresia genică ajustată; a se vedea tabelul 3). Aceste rezultate indică faptul că deleția APOBEC3A/B din linia germinală, care duce la creșterea semnăturii APOBEC-mutaționale, se datorează probabil funcției distincte a uc011aoc transcrise din deleție, în afară de efectul său asupra expresiilor crescute ale uc011aoc. S-a raportat că haplotipul APOBEC3H I (APOBEC3H-I) poate contribui în mare măsură la semnătura mutațională APOBEC pentru eșantioanele purtătoare de deleții germinale APOBEC3A/B în cancerul de sân . Am analizat în continuare haplotipul APOBEC3H-I pentru un total de 76 de eșantioane care au fost prezise ca fiind purtătoare de deleții APOBEC3A/B germinale (a se vedea Metode). Rezultatele noastre au arătat că semnătura APOBEC-mutațională nu a fost corelată în mod semnificativ cu haplotipul APOBEC3H-I, indiferent de eșantioanele prezise ca fiind purtătoare de deleții germinale homozigote sau heterozigote APOBEC3A/B în linie germinală (Datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, constatările noastre sunt în concordanță cu constatarea anterioară conform căreia proteina APOBEC3A/B, generată de deleție, are un nivel de expresie mai mare decât proteina APOBEC3A pe baza investigației din testele funcționale in vitro .

Pentru a explora în continuare funcția distinctă și căile potențiale în care poate fi implicată expresia izoformei uc011aoc (transcrisă din deleția APOBEC3A/B), am analizat genele care au fost co-exprimate cu izoforma uc011aoc în eșantioanele despre care s-a prezis că sunt purtătoare de deleții APOBEC3A/B la nivel germinal (a se vedea Metode). O analiză de îmbogățire în căile canonice de semnalizare cu ajutorul IPA a arătat că aceste gene co-exprimate au fost îmbogățite semnificativ în căi canonice distincte variate în funcție de tipurile de cancer. În mod specific, am observat că principalele căi îmbogățite au fost: semnalizarea HIPPO pentru vezica urinară, semnalizarea PTEN pentru sân, semnalizarea iNOS și Interferon pentru adenocarcinomul pulmonar, hidroliza Acyl-CoA pentru stomac, precum și repararea ruperii duble a firelor de ADN și α-oxidarea acizilor grași pentru pancreas, semnalizarea EIF2 pentru tiroidă și integrarea mediată de GPCR pentru rinichi (P < 0,01 pentru toate; Fișier suplimentar 1: Tabelul S7). În plus, o îmbogățire funcțională în ceea ce privește moartea și supraviețuirea celulară a fost observată în mod obișnuit în mai multe tipuri de cancer, inclusiv vezica urinară, sânul, colul uterin, adenocarcinomul pulmonar și carcinomul pulmonar (P < 0,05 pentru toate).

Am evaluat în continuare asocierea dintre deleția APOBEC3A/B din linia germinală și încărcăturile de neoantigeni. În concordanță cu observația semnăturii APOBEC-mutaționale, rezultatele noastre au arătat că deleția APOBEC3A/B din linia germinală a fost asociată în mod semnificativ cu sarcini neantigenice crescute numai în cancerul de sân (P = 6,5 × 10- 3; Fig. 3c), în timp ce o tendință opusă a fost observată în multe alte tipuri de cancer (Fișier suplimentar 1: Tabelul S8). În mod similar, am constatat că deleția germinală a fost asociată marginal cu abundența relativă a compoziției de celule T (CD8+) în TIL, dar numai în cazul cancerului de sân (P = 0,08; Fig. 3d). Asocierea semnificativă a fost detectată atunci când am pieptănat probele cu deleții homozigote și heterozigote și le-am comparat cu probele care nu purtau deleții (un test Wilcoxon signed-rank, P < 0,05). Cu toate acestea, nu s-a observat nicio asociere pentru alte celule imune. Constatările noastre au arătat că deleția APOBEC3A/B din linia germinală joacă un rol specific țesutului în ceea ce privește afectarea semnăturii APOBEC-mutaționale și a imunogenității în cancerul de sân, consolidând probabil constatările din studiile anterioare de asociere la nivelul genomului privind mecanismele potențiale de asociere a acestora cu un risc crescut de cancer de sân.

Semnătura APOBEC-mutațională contribuie în mod semnificativ la neoantigeni

Pentru a investiga în ce măsură semnătura APOBEC-mutațională contribuie la neoantigeni, am analizat încărcăturile de neoantigeni prezise pentru fiecare probă colectată dintr-un studiu anterior (a se vedea Metode). Cu ajutorul analizei univariate, am evaluat asocierile dintre semnătura APOBEC-mutațională și încărcăturile de neoantigeni pentru fiecare tip de cancer. Așa cum era de așteptat, semnătura APOBEC-mutațională a fost asociată pozitiv cu încărcăturile de neoantigeni în toate tipurile de cancer (P < 1,0 × 10- 4 pentru toate comparațiile), în timp ce asocierile cele mai semnificative au fost observate în tipurile de sân și vezică urinară cu P = 5,1 × 10- 125 și, respectiv, P = 1,5 × 10- 90 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S9). În mod similar, a fost observată o tendință generală de asociere pozitivă între încărcăturile neantigenice prezise și proporția semnăturii APOBEC-mutaționale, cu excepția cancerului de stomac (Fig. 4; Fișier suplimentar 1: Tabelul S10). În mod specific, asocierile semnificative au fost observate în mai multe tipuri de cancer, inclusiv vezica urinară, sânul, colul uterin, adenocarcinomul pulmonar, capul și gâtul și tiroida. În special, cancerul de sân și cel de vezică urinară au prezentat cele mai bune asocieri cu P = 8,9 × 10- 29 și, respectiv, P = 2,8 × 10- 27 (Fișier suplimentar 1: Tabelul S10). Constatările noastre sugerează că semnătura APOBEC-mutațională joacă un rol semnificativ în contribuția la biogeneza neoantigenelor în cancerul uman.

Asociații între abundența relativă a compoziției celulelor imune în TIL cu încărcătura de neoantigen și semnătura mutațională APOBEC

Pentru a investiga relația dintre încărcătura de neoantigen și TIL, am utilizat date de expresie genetică în țesuturile tumorale pentru a măsura abundența compozițiilor celulare relative ale fiecărui tip de celule imune, inclusiv celule B naive, celule B de memorie, celule T CD8 și celule T CD4 activate de memorie în TILs (a se vedea Metode). Cu ajutorul analizei univariate, am evaluat asocierea dintre încărcătura de neoantigen și abundența relativă a compozițiilor celulelor imune pentru fiecare tip de cancer. Am observat că a existat o tendință de asociere pozitivă între încărcăturile de neoantigen și tipurile de celule T CD8+ și CD4+ activate de memorie în toate tipurile de cancer, cu excepția tiroidei și a rinichiului (test binomial P = 0,11 și P = 0,02 pentru tipurile de celule T CD8+ și, respectiv, CD4+ activate de memorie). Un model opus a fost observat atât pentru tipurile de celule B naive, cât și pentru cele cu memorie în toate tipurile de cancer, cu excepția adenocarcinomului pulmonar (test binomial P = 0,02 și P = 2,2 × 10- 16 pentru tipurile de celule B naive și, respectiv, cu memorie). În special, rezultatele noastre au arătat că încărcăturile de neoantigen au avut o asociere cu abundența relativă atât a celulelor T CD8+ și CD4+ activate de memorie, cât și a tipurilor de celule B naive și de memorie în cazul cancerului de vezică urinară. A existat o asociere atât pentru tipurile de celule B naive, cât și pentru cele cu memorie în cazul cancerului de sân, precum și pentru tipurile de celule T CD4 activate de memorie în cazul adenocarcinomului pulmonar, al cancerului de cap și gât și al cancerului de pancreas (Fișier suplimentar 1: Tabelul S11). Deoarece semnătura APOBEC-mutațională a contribuit în mod semnificativ la neantigene, am evaluat în plus asocierea dintre abundențele relative ale compozițiilor de celule imune în TIL și semnătura APOBEC-mutațională. În concordanță cu observația din analiza de asociere a încărcăturii de neoantigeni, s-a constatat un model similar și pentru semnătura APOBEC-mutațională (Fișier suplimentar 1: Tabelul S12). Constatările noastre sugerează că semnătura APOBEC-mutațională are o influență asupra capacităților imunogene ale cancerului, cum ar fi atragerea anumitor celule imune în TILs, posibil mediată de încărcătura crescută de neoantigen.

.