Anticorpii antispermici: Anticorpii antispermici și infertilitatea: o întrebare de nerezolvat?

Încă o dată se discută despre detectarea și semnificația clinică a anticorpilor antispermici (ASA) (Helmerhorst et al., 1999). Deși se concluzionează cu prudență că `există motive pentru a accepta imunitatea antispermică mediată de anticorpi ca o cauză a subfertilității`, autorii enumeră trei motive pentru care medicii nu sunt înclinați să testeze ASA la cuplurile subfertile: (i) lipsa unui test standardizat și universal acceptat pentru ASA; (ii) lipsa unui consens cu privire la consecințele clinice ale ASA; și (iii) absența dovezilor pentru o explicație mecanicistă privind modul în care ASA afectează concepția. Fiecare dintre aceste trei afirmații merită un comentariu.

Discuția lui Helmerhorst et al. (1999) se bazează strict pe concepte imunologice moderne, ceea ce duce la recomandarea imunoblottingului și a cromatografiei de afinitate ca fiind promițătoare în acest domeniu. Pentru cei care lucrează în acest domeniu de mulți ani, aceste recomandări pot provoca un sentiment de deja vu. Aceasta a fost strategia obișnuită în urmă cu ~20 de ani și, de atunci, multe studii au fost realizate prin teste imunoenzimatice (ELISA), folosind spermatozoizi sau fracțiuni de antigen, și prin imunoblotting (Lehmann et al., 1985; Mettler et al., 1985). Cu toate acestea, rezultatele au fost, în general, dezamăgitoare; nu s-a obținut claritatea la care se spera. Nu există explicații bune pentru lipsa de succes, dar un aspect al problemei poate fi acela că gândirea imunologică convențională nu este suficientă pentru a realiza progrese în imunologia reproducerii. Fiziologia reproducerii trebuie, de asemenea, să fie luată în considerare. O privire asupra posibilelor efecte in-vivo ale AAS poate ilustra acest lucru.

Explicații mecaniciste pentru afectarea concepției de către AAS?

Afirmația lui Helmerhorst et al. privind `absența dovezilor pentru o explicație mecanicistă privind modul în care AAS afectează concepția’ este destul de surprinzătoare, în special într-o lucrare olandeză, chiar și într-o lucrare din Groningen. În Groningen, grupul remarcabil, condus de Jan Kremer, a demonstrat că migrarea spermatozoizilor cu AAS din clasa imunoglobulinei (Ig) A pe suprafața lor prin mucusul cervical a fost puternic afectată, aparent pentru că partea Fc a moleculei IgA (dar nu și a moleculei IgG) se leagă eficient de micela din mucusul cervical (Jager et al., 1980). În testul de contact între spermatozoizi și mucusul cervical, procentul de spermatozoizi acoperiți cu anticorpi IgA a fost proporțional cu procentul de spermatozoizi care prezintă așa-numitul fenomen de „scuturare”, adică mișcări puternice ale cozii fără progresie înainte în mucusul cervical. O dovadă suplimentară a importanței IgA a fost găsită atunci când s-a demonstrat că tratamentul spermatozoizilor acoperiți cu IgA cu o protează IgA1 a îmbunătățit migrarea spermatozoizilor prin mucusul cervical (Bronson et al., 1987).

Aceasta înseamnă că anticorpii IgA împotriva oricărui antigen exprimat pe membrana spermatozoizilor va afecta penetrarea și că, în această situație, clasa de imunoglobulină a ASA devine mai importantă decât specificitatea antigenului. Acest lucru este în contrast cu reacțiile imunologice convenționale, ceea ce poate fi motivul pentru care fenomenul de scuturare este adesea neglijat în discuțiile imunologice. Cu toate acestea, este în mod evident un mecanism foarte eficient; în experimentele privind migrarea spermatozoizilor acoperiți cu IgA în mucusul cervical în tuburi capilare, spermatozoizii de la pacienții cu reacții imune puternice ajungeau adesea doar la câțiva mm în mucus. Legarea piesei Fc a IgA de mucusul cervical ar trebui privită dintr-o perspectivă evolutivă. Având în vedere că mucusul cervical este singura barieră între mediul înconjurător și tractul genital feminin și cavitatea peritoneală, trebuie să existe mecanisme de apărare în mucus pentru a împiedica pătrunderea microorganismelor în tractul genital. Anticorpii IgA împotriva microorganismelor îndeplinesc această funcție prin captarea microorganismelor. În cazurile rare în care o femeie a produs anticorpi IgA împotriva spermatozoizilor sau, mai frecvent, când spermatozoizii care intră în mucus sunt deja acoperiți cu IgA, rezultatul va fi același: captarea spermatozoizilor sau afectarea migrării.

Un mecanism imunologic mai convențional prin care AAS ar putea reduce fertilitatea ar fi prin legarea la receptorul prin care spermatozoizii se atașează de ovul, blocând astfel interacțiunea spermatozoid-ovul. În această situație, specificitatea antigenică a AAS va fi crucială și, deoarece există mai mult de un autoantigen în membrana spermatozoizilor, nu toți AAS ar putea avea acest efect. În ultimele două decenii, acest fenomen a fost studiat pe larg în legătură cu fertilizarea in vitro (FIV) folosind spermatozoizi de la bărbați cu ASA. În aproape toate studiile, s-a observat o reducere semnificativă a procentului de ovule fertilizate. Unul dintre primele studii a indicat, de asemenea, că efectul de blocare a fost cauzat în principal de anticorpii IgA (Clarke et al., 1985), dar acest lucru nu a fost observat în studiile ulterioare, iar experimentele de absorbție au arătat că un efect inhibitor poate fi cauzat și de anticorpii IgG (Bronson et al., 1982). Un studiu recent privind legarea spermatozoizilor de zona pellucida (Francavilla et al., 1997) este deosebit de ilustrativ. În fiecare experiment, aceștia au adăugat un număr egal de spermatozoizi de la o persoană fertilă și de la un pacient cu o reactivitate puternică la testul cu imunobilete, astfel încât cele două tipuri de spermatozoizi, marcați cu diferiți fluorocromi, au fost lăsați să concureze pentru legarea la zona pellucida. În comparație cu spermatozoizii de la bărbații fertili, spermatozoizii de la pacienții cu probe de spermă normale (în afară de prezența AAS) au fost inhibați în ~50% din cazuri, intensificați în câteva cazuri și neafectați în restul cazurilor, ceea ce se potrivește cu conceptul conform căruia specificitatea anticorpilor trebuie să joace un rol. Cu toate acestea, în ciuda răspunsurilor imune puternice ale pacienților, cu titluri ridicate de ASA circulant și, în majoritatea cazurilor, atât cu IgG, cât și cu IgA, pe aproape toate spermatozoizii, inhibiția nu a fost niciodată completă, ci o parte din spermatozoizii acoperiți cu anticorpi au fost legați de zona pellucida. Acest lucru este în concordanță cu experiența din multe alte studii FIV, conform căreia, chiar dacă procentul de ovule fecundate poate fi redus prin prezența AAS, unele ovule vor fi de obicei fecundate.

Concluzia acestei discuții privind posibilele efecte de reducere a fertilității ale AAS este că afectarea migrării spermatozoizilor prin mucusul cervical de către anticorpii IgA este un mecanism foarte eficient, în timp ce blocarea interacțiunii spermatozoid-ovul (cauzată atât de AAS IgG cât și de AAS IgA) pare a fi mai puțin eficientă, probabil rareori împiedicând, dar poate întârziind concepția. Experiențele clinice susțin aceste concluzii. În clinicile de infertilitate, bărbații cu ASA rareori au un răspuns IgG izolat, dar de obicei prezintă un amestec de anticorpi IgG și IgA. Pe de altă parte, în studiile privind fertilitatea bărbaților vasectomizați și ulterior vasovasostomizați, răspunsurile imune limitate la clasa IgG nu au fost rare, dar acești bărbați păreau să aibă o fertilitate normală, în timp ce rata de fertilitate a fost invers corelată cu răspunsul IgA (Meinertz et al., 1990). Prin urmare, se pare că `absența dovezilor pentru o explicație mecanicistă’ nu ar trebui să împiedice clinicianul să testeze pacienții (cel puțin bărbații) cu probleme de fertilitate pentru AAS.

Fără un test standardizat și universal acceptat pentru AAS?

Deși nu se pot aduce argumente împotriva acestei afirmații a lui Helmerhorst et al. (1999), întrebarea este dacă este o cerință corectă și necesară pentru ca un test să fie utilizat? Dacă da, spectrul larg de teste de laborator ar putea fi redus dramatic. Întrebarea esențială pare a fi dacă anumite teste pentru AAS produc rezultate relevante din punct de vedere clinic.

Pentru mulți ani, testele de aglutinare a spermatozoizilor (fie aglutinare macroscopică cu gelatină, fie aglutinare microscopică cu tavă) au fost testele obișnuite (Rose et al., 1976). Mai recent, aceste teste au fost discreditate și adesea descrise ca fiind nesigure, în special în legătură cu descrierea noilor tehnici. Este adevărat, niciuna dintre ele nu este ideală, ambele necesitând probe de material seminal proaspăt de calitate optimă. În cazul testului de aglutinare cu gelatină, se utilizează volume mari de material seminal, iar în cazul testului de aglutinare cu tăviță, este nevoie de experiență și de prudență în citirea rezultatelor pentru a distinge aglutinatele adevărate de aglutinarea nespecifică. Cu toate acestea, aceste teste au dat rezultate relevante din punct de vedere clinic la bărbați. Mai multe studii au arătat că titlurile ridicate în ser sau anticorpii liberi în plasma seminală apar foarte rar, cu excepția pacienților cu probleme de fertilitate (la ~10% dintre bărbații din cuplurile cu fertilitate inexplicabilă) (de exemplu, Bronson et al., 1985) și în rândul bărbaților normospermiști într-un studiu de urmărire (Rümke et al., 1974), creșterea titlurilor serice în aglutinarea cu gelatină a fost corelată cu scăderea fertilității (de exemplu, doar 12,5% din 64 de bărbați cu titluri de la 128-512 și niciunul din 11 cu titluri ≥1024 nu și-au indus concepția în timpul perioadei de observație de 2-16 ani). Deoarece ASA detectate în ser sunt în principal din clasa IgG, poate părea ciudat că titlurile serice sunt legate de subfertilitate dacă efectul anti-fertilitate al ASA este cauzat în principal de anticorpii IgA din spermă. Explicația constă în faptul că anticorpii IgA apar foarte rar fără anticorpi IgG, iar concentrațiile ridicate de IgA se găsesc în principal la pacienții care au, de asemenea, concentrații ridicate de IgG.

O observație la fel de importantă în aceste studii a fost aceea că concentrațiile scăzute de anticorpi (titluri de 4-16) au fost la fel de frecvente în rândul martorilor fertili și al pacienților infertili, ceea ce indică faptul că astfel de valori scăzute aparent nu au afectat fertilitatea în mod semnificativ.

Mai recent, testul imunologic indirect a devenit cel mai popular (Bronson et al., 1982). Spermatozoizii proaspeți, recoltați prin tehnica swim-up, sunt incubați cu ser sau plasmă seminală, apoi sunt spălați cu grijă și se adaugă imunobeads acoperite cu anti-IgG sau anti-IgA (sau anti-IgM). La microscop, se observă imunobiletele care aderă la spermatozoizii mobili dacă proba conține ASA din clasa de imunoglobuline corespunzătoare. Utilizarea unei anti-imunoglobuline garantează specificitatea reacției; este un test foarte sensibil, determină clasa de imunoglobulină a AAS și necesită doar cantități mici de spermatozoizi, ceea ce îl face, aparent, testul ideal. Cu toate acestea, există o problemă. Pentru a rămâne practicabil, se efectuează de obicei cu o singură diluție de ser, de obicei o diluție mică (cel mai adesea 1:4). În astfel de cazuri, testul imunologic indirect funcționează ca un test de screening foarte sensibil, astfel încât chiar și nivelurile scăzute de anticorpi fără semnificație pentru fertilitate (care reprezintă probabil cea mai mare parte a reacțiilor pozitive) pot induce reactivități puternice, cel puțin pentru IgG (de exemplu, a se vedea Bronson et al., 1985). Acest lucru poate explica de ce mai mulți cercetători au pus sub semnul întrebării valoarea testării pentru AAS și semnificația AAS ca o cauză a infertilității. Dacă testul ar fi efectuat cu diluții mai mari de ser (de exemplu, 1:50 și 1:250), ar putea oferi o mai bună orientare clinică.

Cel mai rațional mod de a testa ASA la bărbați este, în mod evident, determinarea imunoglubulinelor (IgG și IgA) de pe suprafața spermatozoizilor pacienților prin intermediul reacției de aglutinare mixtă directă (MAR) sau al testelor cu imunoadezivitate. Ambele teste sunt rapide, ușoare și sensibile, dar necesită spermatozoizi mobili pentru a se asigura că eritrocitele sau imunobeadele aderă la membrana spermatozoizilor. Acestea sunt teste de screening excelente; dacă reacția este negativă sau slab pozitivă (≤50% din spermatozoizii mobili care transportă imunoglobuline), pacientul poate avea cu greu o problemă de infertilitate cauzată de ASA și nu sunt necesare alte teste imunologice. Pe de altă parte, dacă toți sau majoritatea spermatozoizilor au imunoglobuline pe membrană, consecințele pentru fertilitate sunt mai greu de evaluat, în primul rând pentru că aceste teste sensibile nu pot distinge între spermatozoizii cu doar cantități infime de imunoglobulină și spermatozoizii care sunt complet saturați cu anticorpi pe toate moleculele de antigen disponibile. Atât pentru afectarea indusă de IgA a migrării spermatozoizilor prin mucusul cervical, cât și pentru un posibil blocaj al interacțiunii dintre spermatozoizi și ovule, trebuie să se presupună că numărul de molecule de anticorpi joacă un rol. În această situație, poate fi utilă determinarea ASA în ser și plasmă seminală. Cu titluri ridicate în ser sau un exces de AAS liber în plasma seminală, ar părea probabil ca și cantitatea de AAS de pe spermatozoizi să fie ridicată.

Că aceste considerații teoretice sunt în concordanță cu realitatea clinică a fost ilustrat în modul cel mai clar în studiul nostru de urmărire asupra bărbaților vasovasostomizați, menționat mai sus (Meinertz et al., 1990).

În perioada de observație (22-111 luni, mediana 44 de luni), 10 din cei 15 bărbați (66,7%) cu un MAR direct negativ (≤10% din spermatozoizii mobili cu eritrocite aderente) și-au indus concepția, dar la fel au făcut și 42 din cei 79 de bărbați (53,2%) cu un MAR pozitiv (testul exact cu două cozi al lui Fisher: P = 0,4995). Astfel, un simplu MAR pozitiv (>10% pentru IgG sau IgA) nu a oferit nicio informație privind starea de fertilitate. Majoritatea bărbaților cu ASA au avut atât IgG, cât și IgA pe spermatozoizii lor, dar unii au avut doar IgG. Reacțiile IgA pure nu au fost înregistrate. Analizând bărbații cu reacții imune limitate la clasa IgG, rata de concepție pentru grupul total a fost de 85,7% (18/21), iar pentru cei cu IgG pe toate spermatozoizii a fost la fel de ridicată (11/13 = 84,6%). Astfel, nu a putut fi înregistrat niciun efect anti-fertilitate pentru IgG; de fapt, rata de concepție a fost remarcabil de ridicată, chiar mai mare decât la pacienții fără ASA (deși diferența nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic). Pe de altă parte, bărbații cu reactivitate atât la IgG, cât și la IgA au evidențiat o scădere a fertilității odată cu creșterea reactivității IgA. Pentru grupul total, rata de concepție a fost de 42,9% (24/56), iar pentru cei cu IgA pe toate spermatozoizii de 21,7% (cinci din 23). Comparativ cu grupurile cu doar reactivitate IgG, diferențele au fost foarte semnificative. În încercarea de a identifica bărbații cu răspunsuri imune deosebit de puternice, s-a constatat că niciunul dintre cei 10 bărbați cu 100% reactivitate IgA în MAR și aglutinine circulante ale spermatozoizilor în titluri de 256 sau mai mari nu a reușit să inducă sarcina și numai unul dintre cei 13 bărbați cu 100% IgA în MAR și aglutinine libere ale spermatozoizilor în plasma seminală a reușit.

Deși în prezent nu există un singur test care să poată evalua în mod clar starea de fertilitate a fiecărui pacient în parte în ceea ce privește subfertilitatea sau infertilitatea imunitară, pare justificat să concluzionăm că, cu o combinație adecvată de teste (de exemplu, teste MAR sau testele imunoadezive combinate cu aglutininele spermatozoizilor în ser sau plasmă seminală), ne putem apropia destul de mult de acest obiectiv. Un studiu recent privind diagnosticul și managementul ASA, realizat de centrele de medicină reproductivă din Marea Britanie (Krapez et al., 1998), a arătat că marea majoritate a centrelor urmează de fapt această strategie. Astfel, 44 din 48 de centre au testat ASA pe spermatozoizi prin MAR direct (28 de laboratoare) sau prin teste imunobead (19 laboratoare). În unele cazuri, a fost testată și plasma seminală, iar 17 laboratoare au examinat serul de la partenerii de sex masculin prin diverse teste, în principal testul de aglutinare în tavă. Acest lucru înseamnă că aproape toate centrele au identificat, într-un mod simplu, bărbații care ar putea avea o cauză imunologică pentru subfertilitatea lor. Deși acesta este cel mai bun lucru care poate fi făcut în prezent, nu este optim. Este nevoie de o tehnică care să poată identifica într-un mod mai precis bărbații care au o problemă imunologică. În prezent, citometria în flux pare a fi o tehnică promițătoare care ar putea fi capabilă să determine cantitatea exactă de IgG și IgA de pe fiecare spermatozoid în parte (Räsanen et al., 1992; Ke et al., 1995).

Fără consens în ceea ce privește consecințele clinice ale ASA?

La prima vedere, această afirmație a lui Helmerhorst et al. poate părea corectă, dar se pune întrebarea dacă pot fi comparate investigațiile cu multe tehnici și criterii diferite? Cu ani în urmă se credea în general că AAS ar putea cauza infertilitate, dar în prezent imaginea pare mult mai puțin clară. Pot exista mai multe motive pentru această schimbare de opinie.

În primul rând, am învățat că, chiar și cu cele mai ridicate niveluri de AAS (în special IgA), concepția poate fi cu greu exclusă. Prin urmare, întrebarea este mai degrabă în ce măsură AAS poate cauza subfertilitate. Studiile privind infertilitatea masculină, discutate în această trecere în revistă, s-au bazat în principal pe diverse tehnici convenționale (unii ar putea spune de modă veche). Cu toate acestea, chiar dacă consensul ar putea fi un cuvânt prea puternic pentru a fi folosit, rezultatele acestor studii sunt, în general, în bună concordanță, indicând că nivelurile scăzute de AAS sunt puțin dăunătoare, iar valorile ceva mai ridicate (în special IgA) cauzează subfertilitate, ajungând până la ceva apropiat de infertilitate în cazul nivelurilor foarte ridicate de AAS; o concluzie care, în mod evident, reprezintă un obstacol serios în calea încercărilor de a produce un vaccin anti-fertilitate, bazat pe antigeni spermatici!

În al doilea rând, atunci când se introduc noi teste pentru AAS, acestea trebuie comparate cu testele convenționale și, dacă nu determină același tip de AAS, trebuie să se țină cont de acest lucru. Atunci când a fost efectuat un studiu multicentric al Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) privind anticorpii împotriva antigenelor de reproducere, în urmă cu 15 ani, s-a dovedit că mai multe tehnici, inclusiv majoritatea ELISA-urilor, tehnicile de imunoblotting, hemaglutinarea pasivă și testele de citotoxicitate, nu au detectat ASA înregistrat în tehnicile convenționale. Mai mult, rezultatele aveau, de obicei, o relevanță clinică redusă, neprezentând nicio diferență semnificativă între grupurile fertile și infertile (Hjort et al., 1985). Din nefericire, acest lucru este adesea uitat în discuțiile privind ASA.

În al treilea rând, aspectul cantitativ și clasa de imunoglubulină a anticorpilor ar trebui să fie incluse în teste. Astfel, toți pacienții cu reactivitate la testul direct MAR sau la testul imunobead nu ar trebui să fie considerați ca un singur grup, ci cei cu reactivitate slabă (probabil fertili) ar trebui să fie deosebiți de cei cu anticorpi pe aproape toate spermatozoizii (posibil subfertili) și, în mod similar, cei cu numai IgG (probabil fertili) nu ar trebui amestecați cu cei cu reactivități puternice atât pentru IgG, cât și pentru IgA (probabil subfertili sau infertili).

Studiul recent al centrelor de medicină reproductivă din Marea Britanie (Krapez et al., 1998) a indicat că, de obicei, nu se face o distincție între IgG și IgA AS. Acest lucru se datorează, probabil, faptului că majoritatea bărbaților infertili cu ASA vor avea un amestec al celor două clase de imunoglobuline pe spermatozoizii lor. Cu toate acestea, încercările de tratare a pacienților concordă bine cu concluziile la care s-a ajuns în urma investigațiilor de laborator și a `experimentelor clinice’ (studii pe bărbați vasovasostomizați). Astfel, inseminarea intrauterină este utilizată în majoritatea centrelor pentru a depăși afectarea indusă de IgA a penetrării spermatozoizilor prin mucusul cervical. Fie FIV, fie injecția intracitoplasmatică de spermatozoizi (ICSI) a fost utilizată pentru pacienții cu o imunitate puternică la spermatozoizi (>50% reactivitate la testul MAR sau la testul imunobead), dar, în general, cu indicații liberale în comparație cu concluziile la care s-a ajuns mai sus. Acest lucru reflectă, în mod evident, faptul că ASA nu sunt adesea singura cauză a infertilității la acești pacienți, ci numărul scăzut de spermatozoizi, motilitatea slabă sau problemele partenerului feminin pot juca, de asemenea, un rol. Astfel, efectele antifertilitate ale AAS sunt dificil de analizat în grupuri de pacienți infertili.

Bărbații vasectomizați și ulterior vasovasostomizați par să ofere un grup mult mai bun; de fapt, un grup foarte asemănător cu cel al animalelor de laborator. De obicei, ambii parteneri și-au dovedit anterior fertilitatea, astfel încât pot fi excluși factorii genetici de infertilitate. Se poate selecta un grup de bărbați care au fost vasectomizați pentru o perioadă limitată și care au avut o vasovasostomie reușită, cu un număr acceptabil de spermatozoizi care prezintă o motilitate bună în proba de material seminal. Astfel, dacă ambii parteneri au fost sănătoși de la ultima lor concepție, factorii de infertilitate, alții decât eventualul ASA, sunt mult mai puțin probabile decât într-un grup de pacienți infertili. Marele avantaj al grupului de pacienți cu vasovasostomie este, într-adevăr, faptul că statutul de fertilitate al acestora nu este cunoscut de la început și, prin urmare, este inclus automat un grup de control; de exemplu, unii nu au ASA, alții au doar IgG și alții au atât IgG, cât și IgA. Acesta pare a fi un grup ideal pentru studierea efectelor AAS și pentru evaluarea noilor tehnici și este surprinzător faptul că a fost atât de puțin utilizat. Întrebarea crucială în acest sens este, bineînțeles, dacă bărbații vasectomizați produc anticorpi împotriva tuturor acelorași antigeni împotriva cărora pot reacționa bărbații infertili. Sunt necesare studii suplimentare, dar până acum nu avem nici o dovadă că nu ar trebui să fie așa.

Acest lucru duce la concluzia că imunologia spermei poate furniza informații utile pentru clinicieni. S-ar putea să nu mai fie atât de esențială acum, când factorul imunologic, împreună cu mulți alți factori de infertilitate, poate fi depășit prin tehnici de reproducere asistată. Cu toate acestea, este încă un bun principiu să se ajungă la un diagnostic cât mai exact posibil înainte de instituirea unui tratament.

.